本發(fā)明涉及銀杏內(nèi)酯B衍生物及其制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：銀杏內(nèi)酯B(GinkgolideB，GB)是從銀杏葉中提取的主要活性成分之一，也是迄今發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的血小板活化因子(PAF)拮抗劑，可以抑制血小板聚集、抗炎、抗休克、保護(hù)心腦血管及治療急性胰腺炎等，是治療急慢性腦缺血疾病的有效藥物。但銀杏內(nèi)酯B是一種六環(huán)籠狀結(jié)構(gòu)的二萜化合物，剛性結(jié)構(gòu)，水溶性差，生物利用率低，致使藥效的充分發(fā)揮受到限制，影響其臨床應(yīng)用的效果。近年來對銀杏內(nèi)酯B結(jié)構(gòu)修飾的相關(guān)研究已成為一個熱點(diǎn)課題。文獻(xiàn)WO9306107出于分離純化的目的對銀杏內(nèi)酯B的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了改造，但僅僅局限于分子內(nèi)部手性的改變，對其水溶性并無改善且抗PAF活性卻大大減弱。文獻(xiàn)CN1139435A報道了對銀杏內(nèi)酯B進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，部分衍生化合物的水溶性和抗PAF活性均得到了改善，但合成工藝苛刻復(fù)雜、產(chǎn)量較低，給實(shí)際生產(chǎn)操作帶來了很大困難。專利CN1837212A亦報道了對銀杏內(nèi)酯B的10-O位進(jìn)行的結(jié)構(gòu)修飾，得到了系列羧酸類和含氮類衍生化合物，但水溶性和藥效活性的改善與否缺乏檢測數(shù)據(jù)。為此，我們有必要在前人的研究基礎(chǔ)上對銀杏內(nèi)酯B先導(dǎo)化合物進(jìn)一步進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，以期發(fā)現(xiàn)活性更高、水溶性更好、結(jié)構(gòu)新穎的銀杏內(nèi)酯B類候選藥物，以便運(yùn)用于心腦血管疾病的防治。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一種新結(jié)構(gòu)的具有藥用價值的銀杏內(nèi)酯B衍生物及其制備方法與應(yīng)用，以及包含該銀杏內(nèi)酯B衍生物的藥物組合物，以便為預(yù)防、處理、治療和/或減輕心腦血管疾病提供更多的藥物選擇途徑。本發(fā)明提供的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：其中，R1選自吡嗪基或取代的吡嗪基；其中，R2選自吡嗪基或取代的吡嗪基、苯基或取代的苯基、烷基或取代的烷基。進(jìn)一步的，所述的化合物如式Ⅰa所示：其中，R11、R12、R13分別或同時選自H、烷基、取代的烷基、酯基、烷氧基、鹵素、羥基、氰基、苯基或取代的苯基。進(jìn)一步的，式Ⅰa所示的化合物中，R11、R12、R13分別或同時選自C1～C6烷基或鹵素取代的C1～C6烷基。進(jìn)一步的，式Ⅰa所示的化合物為：進(jìn)一步的，所述的化合物如式Ⅱa、式Ⅱb或式Ⅱc所示：其中，R21、R22、R23分別或同時選自H、烷基、取代的烷基、酯基、烷氧基、鹵素、羥基、氰基、苯基或取代的苯基；其中，R31、R32、R33、R34、R35分別或同時選自H、烷基、取代的烷基、酯基、烷氧基、鹵素、羥基、氰基、苯基或取代的苯基；其中，R41、R42、R43、R44、R45分別或同時選自H、烷基、取代的烷基、酯基、烷氧基、鹵素、羥基、氰基、苯基或取代的苯基。進(jìn)一步的，式Ⅱa所示的化合物中，R21、R22、R23分別或同時選自C1～C6烷基或鹵素取代的C1～C6烷基。進(jìn)一步的，式Ⅱa所示的化合物為：進(jìn)一步的，式Ⅱb所示的化合物中，R31選自酯基或酯基取代的烷基，R32、R33、R34、R35同時為H。進(jìn)一步的，式Ⅱb所示的化合物中，R31選自C2～C6酯基或如式A所示的酯基取代的烷基：其中，R311、R312分別或同時選自C2～C6酯基或C1～C6烷基，R311、R312不同時為C1～C6烷基。進(jìn)一步的，式Ⅱb所示的化合物為：進(jìn)一步的，式Ⅱc所示的化合物中，R41、R42、R43、R44、R45分別或同時選自H或鹵素。進(jìn)一步的，式Ⅱc所示的化合物為：進(jìn)一步的，所述藥學(xué)上可接受的鹽選自有機(jī)酸鹽或無機(jī)酸鹽。進(jìn)一步的，有機(jī)酸鹽選自甲磺酸鹽、對甲苯磺酸鹽、苯磺酸鹽、乳酸鹽、枸櫞酸鹽(檸檬酸鹽)、琥珀酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽或丁二酸鹽；無機(jī)酸鹽選自鹽酸鹽、硫酸鹽、氫溴酸鹽或磷酸鹽。本發(fā)明還提供了上述式Ⅰa所示化合物的制備方法，包括以下步驟：a、將銀杏內(nèi)酯B溶于有機(jī)溶劑中，加入無機(jī)堿和催化劑，于50℃～60℃反應(yīng)，得到反應(yīng)液；其中，X為鹵素；b、對步驟a所得反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，即得式Ⅰa所示化合物。進(jìn)一步的，步驟a中，所述銀杏內(nèi)酯B與的摩爾比為1:1～1:5；所述銀杏內(nèi)酯B與無機(jī)堿的摩爾比為1:5～1:20；優(yōu)選的，所述銀杏內(nèi)酯B與的摩爾比為1:2～1:3；所述銀杏內(nèi)酯B與無機(jī)堿的摩爾比為1:10～1:20。進(jìn)一步的，步驟a中，有機(jī)溶劑選自乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；無機(jī)堿選自碳酸鉀、碳酸鈉或碳酸銫；催化劑為碘化鉀。本發(fā)明還提供了上述式Ⅱa、式Ⅱb或式Ⅱc所示化合物的制備方法，包括以下步驟：①、將銀杏內(nèi)酯B和式Ⅴ所示化合物溶于有機(jī)溶劑中，加入催化劑和縮合劑，于20℃～30℃反應(yīng)4h～6h，得到反應(yīng)液；其中，制備式Ⅱa所示化合物的式Ⅴ所示化合物為：制備式Ⅱb所示化合物的式Ⅴ所示化合物為：制備式Ⅱc所示化合物的式Ⅴ所示化合物為：②、對步驟①所得反應(yīng)液進(jìn)行分離、純化，即得式Ⅱa、式Ⅱb或式Ⅱc所示化合物。進(jìn)一步的，步驟①中，銀杏內(nèi)酯B和式Ⅴ所示化合物的摩爾比為1:1～1:5；銀杏內(nèi)酯B和催化劑的摩爾比為1:0.1～1:0.3；銀杏內(nèi)酯B和縮合劑的摩爾比為1:1.2～1:1.6。進(jìn)一步的，步驟①中，有機(jī)溶劑選自乙腈或N,N-二甲基甲酰胺；催化劑選自4-二甲氨基吡啶或1-羥基苯并三唑；縮合劑選自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、二環(huán)己基碳二亞胺或二異丙基碳二亞胺。本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它是以上述的式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽為活性成分，加上藥學(xué)上可接受的輔料或輔助性成分制備得到的制劑。本發(fā)明還提供了上述的式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽在制備治療和/或預(yù)防心腦血管疾病的藥物中的用途。進(jìn)一步的，所述的心腦血管疾病包括高血壓、腦卒中、冠心病、心律失常、心力衰竭、血脂異常、肺血管病、慢性腎臟病、外周血管病等，如心肌梗死、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、左主干病變、分叉病變、心絞痛、血栓、肺源性心臟病、內(nèi)分泌病性心臟病、貧血性心臟病、心臟神經(jīng)癥、營養(yǎng)代謝性心臟病、主動脈瘤、下肢動脈硬化疾病、周圍動脈疾病、顱內(nèi)動脈瘤、動脈硬化性動脈瘤、缺血性腦卒中、出血性腦卒中、高血脂、動脈硬化、心源性猝死、中風(fēng)、血管栓塞、肺栓塞、房顫、心肌疾病、心包疾病、瓣膜病、高血壓性腦病、高血壓合并腦卒中、腦出血、腦血栓、腦栓塞、腦梗塞、腦動脈炎、腦動脈硬化、腔隙性梗塞、血管性癡呆、慢性腎臟病、慢性心功能不全、痛風(fēng)性腎病、糖尿病腎病和/或腎功能異常。進(jìn)一步的，所述的心肌梗死為急性心肌梗死；所述的冠狀動脈疾病為急性冠狀動脈綜合征或冠狀動脈血管再通術(shù)；所述的高血壓為原發(fā)性高血壓；所述的中風(fēng)為腦中風(fēng)；所述的心律失常為室性心律失常、復(fù)雜性心律失常、遺傳性心律失常或惡性心律失常。本發(fā)明提供的式Ⅰ或式Ⅱ所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，特別是，化合物BZ、BA、BL、BM、BD或其鹽，對于預(yù)防和/或治療高血壓、腦卒中、冠心病、心律失常、心力衰竭、血脂異常、肺血管病、慢性腎臟病、外周血管病等，如心肌梗死、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、左主干病變、分叉病變、心絞痛、血栓、肺源性心臟病、內(nèi)分泌病性心臟病、貧血性心臟病、心臟神經(jīng)癥、營養(yǎng)代謝性心臟病、主動脈瘤、下肢動脈硬化疾病、周圍動脈疾病、顱內(nèi)動脈瘤、動脈硬化性動脈瘤、缺血性腦卒中、出血性腦卒中、高血脂、動脈硬化、心源性猝死、中風(fēng)、血管栓塞、肺栓塞、房顫、高血壓性腦病、高血壓合并腦卒中、腦出血、腦血栓、腦栓塞、腦梗塞、腦動脈炎、腦動脈硬化、腔隙性梗塞、血管性癡呆、慢性腎臟病、慢性心功能不全、痛風(fēng)性腎病、糖尿病腎病和/或腎功能異常等心腦血管疾病具有良好的藥效，為臨床上預(yù)防和/或治療心腦血管疾病提供了一種新的選擇。關(guān)于本發(fā)明的使用術(shù)語的定義：除非另有說明，本文中基團(tuán)或者術(shù)語提供的初始定義適用于整篇說明書的該基團(tuán)或者術(shù)語；對于本文沒有具體定義的術(shù)語，應(yīng)該根據(jù)公開內(nèi)容和上下文，給出本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠給予它們的含義?！叭〈笔侵阜肿又械臍湓颖黄渌煌脑踊蚍肿铀鎿Q。碳?xì)浠鶊F(tuán)中碳原子含量的最小值和最大值通過前綴表示，例如，前綴(Ca～Cb)烷基表明任何含“a”至“b”個碳原子的烷基。因此，例如，C1～C6烷基是指包含1～6個碳原子的烷基。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指某載體、運(yùn)載物、稀釋劑、輔料，和/或所形成的鹽通常在化學(xué)上或物理上與構(gòu)成某藥物劑型的其它成分相兼容，并在生理上與受體相兼容。術(shù)語“鹽”和“可藥用的鹽”是指上述化合物或其立體異構(gòu)體，與無機(jī)和/或有機(jī)酸和堿形成的酸式和/或堿式鹽，也包括兩性離子鹽(內(nèi)鹽)，還包括季銨鹽，例如烷基銨鹽。這些鹽可以是在化合物的最后分離和純化中直接得到。也可以是通過將上述化合物，或其立體異構(gòu)體，與一定數(shù)量的酸或堿適當(dāng)(例如等當(dāng)量)進(jìn)行混合而得到。這些鹽可能在溶液中形成沉淀而以過濾方法收集，或在溶劑蒸發(fā)后回收而得到，或在水介質(zhì)中反應(yīng)后冷凍干燥制得。本發(fā)明中所述鹽可以是化合物的鹽酸鹽、硫酸鹽、枸櫞酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、乳酸鹽、對甲苯磺酸鹽、氫溴酸鹽、氫氟酸鹽、磷酸鹽、乙酸鹽、丙酸鹽、丁二酸鹽、草酸鹽、蘋果酸鹽、琥珀酸鹽、富馬酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、三氟乙酸鹽或水楊酸鹽。顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。以下通過實(shí)施例形式的具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。具體實(shí)施方式本發(fā)明具體實(shí)施方式中使用的原料、設(shè)備均為已知產(chǎn)品，通過購買市售產(chǎn)品獲得。1.乙酰水楊酸：成都市科龍化工試劑廠，批號20131016012.3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸的制備稱取10g(73.42mmol)四甲基吡嗪于250ml三頸瓶中，加入100ml水，升溫至35～40℃，攪拌條件下加入11.6gKMnO4，保溫反應(yīng)10h。乙酸乙酯萃取，干燥后除去溶劑得淺黃色固體6.2g，收率50.82％。3.S(+)-2-(2-氯苯基)-2-(4,5,6,7-四氫噻吩[3,2-c]并吡啶-5)乙酸的制備稱取20g氯吡格雷于500ml三頸瓶中，加入150ml甲醇和100ml的2mol/L氫氧化鈉攪拌溶解后加熱至50℃反應(yīng)1h，減壓除去甲醇后加水100ml稀釋，降溫至0-10℃，用鹽酸調(diào)至酸性后加入150ml乙酸乙酯，萃取，干燥后除去溶劑得類白色固體13.2g，收率69％4.2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪的制備在250ml三頸瓶中依次加入川芎嗪(20.0g，0.147mol)、NBS(26.8g，0.151mol)，催化劑過氧化苯甲酰(0.058g,0.232mmol)和溶劑CCl4(75.0mL)，白熾燈照射，油浴升溫至75℃反應(yīng)10小時。過濾，除去濾液中的溶劑得濃縮物。經(jīng)柱層析純化后得淡黃色固體2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪15.8g，收率50％。5.2-(1-乙酰氧基戊基)苯甲酸的制備將丁苯酞12.4g(65mmol)溶于盛有甲醇100mL的500mL單頸燒瓶中，加入2mol/LNaOH溶液100mL，50℃下攪拌1h，減壓蒸除甲醇后加蒸餾水100mL稀釋，冷卻至-5℃，攪拌下用5％鹽酸酸化至pH2～3，乙醚萃取，干燥后低溫除去乙醚得白色固體。向白色固體中分別加入三乙胺20mL、DMAP2.5g和二氯甲烷200mL投入500mL三頸瓶中,-10～0℃下攪拌溶解后滴加乙酰氯11mL，保溫攪拌5h。加水100mL室溫攪拌0.5h,分出有機(jī)層，干燥后除去溶劑，經(jīng)純化后得白色固體6.35g，收率38.96％。同樣，3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸、2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪、2-(1-乙酰氧基戊基)苯甲酸也都可以通過市售購得。實(shí)施例1、化合物BZ的制備稱取5.0g(11.78mmol)GB和2.55g(15.32mmol)3,5,6-三甲基吡嗪-2-甲酸溶于乙腈中，于冰浴中攪拌混合。然后加入0.29g(2.36mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)和3.17g(16.49mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，冰浴條件下攪拌1小時后，混合物于20℃反應(yīng)6h，旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，并用5％NaHCO3清洗兩次，飽和氯化鈉溶液清洗一次。收集有機(jī)相，干燥，過濾并濃縮，分離純化后得白色固體BZ共2.80g，收率41.48％，HPLC純度為99.80％。LC-MS：573.2[M+H+]，595.2[M+Na+]。1H-NMR(DMSO，400MHz)：1.02(s,9H,t-Bu),1.13-1.19(d,3H,14-Me)1.75-1.79(dd,1H,8-H),1.84-1.89(d,1H,7a-H),2.16-2.21(q,1H；7β-H),2.49-2.58(dd,6H,2CH3-pyrazine),2.76(s,3H,CH3-pyrazine),2.86-2.91(q,1H,14-H),4.15-4.18(q,1H,1-H),4.72-4.74(d,1H,2-H),5.46-5.47(d,1H,1-OH),6.33(s,1H,10-H),6.50(s,1H,6-H),6.57(s,1H,12-H),6.89-6.90(d,1H,3-OH)。實(shí)施例2、化合物BA的制備稱取5.0g(11.78mmol)GB和2.76g(15.32mmol)乙酰水楊酸溶于乙腈中，于冰浴中攪拌混合。然后加入0.29g(2.36mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)和3.17g(16.49mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，冰浴條件下攪拌1小時后，混合物于30℃反應(yīng)4h，旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，并用5％NaHCO3洗滌兩次，飽和氯化鈉洗滌一次。收集有機(jī)相，干燥，過濾并濃縮，分離純化后得白色固體BA共2.52g，收率36.52％，HPLC純度為99.13％。MS：609.16[M+Na+]，C29H30NaO13。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：1.08(s,9H,t-Bu),1.24-1.26(d,3H,14-Me)1.99-2.03(dd,1H,8-H),2.16(s,3H,-CH3CO-),2.24(d,1H,7a-H),2.30-2.37(q,1H,7β-H),3.01-3.09(q,1H,14-H),4.08-4.13(q,1H,1-H),4.20-4.22(d,1H,2-H),4.63-4.67(d,1H,1-OH),5.64-5.65(s,1H,10-H),6.14(s,1H,6-H),6.21(s,1H,12-H),6.91-7.99(ddd,4H,Ar),10.03(s,1H,3-OH)。實(shí)施例3、化合物BL的制備稱取5.0g(11.78mmol)GB和4.70g(15.32mmol)S(+)-2-(2-氯苯基)-2-(4,5,6,7-四氫噻吩[3,2-c]并吡啶-5)乙酸溶于乙腈中，于冰浴中攪拌混合。然后加入0.29g(2.36mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)和3.17g(16.49mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，冰浴條件下攪拌1小時后，混合物于25℃反應(yīng)5h。旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，并用5％NaHCO3洗滌兩次，飽和氯化鈉洗滌一次。收集有機(jī)相，干燥，過濾并濃縮，分離純化后得白色固體BL共3.46g，收率41.09％，HPLC純度為99.58％。LC-MS：714.3[M+H+]，736.0[M+Na+]。1H-NMR(CDCl3，400MHz)：1.05(s,9H,t-Bu),1.25-1.36(d,3H,14-Me)1.78-1.83(dd,1H,8-H),2.00-2.04(m,4H,-CH2CH2-),2.28-2.35(d,1H,7a-H),2.82(q,1H,7β-H),2.94-3.01(q,1H,14-H),3.86-3.87(d,2H,-CH2-),4.09(s,1H,-CHCO-),4.11-4.14(q,1H,1-H),4.17-4.18(d,1H,2-H),4.51-4.53(d,1H,1-OH),5.41-5.43(s,1H,10-H),5.43-5.45(d,1H,6-H),6.08(s,1H,12-H),6.23(s,1H,3-OH),6.67-6.69(dd,1H,-CHS-),7.15-7.18(dd,1H,-CHCHS-),7.36-7.68(m,4H,Ar)。實(shí)施例4、化合物BM的制備將2.0g銀杏內(nèi)酯B溶于50ml乙腈中，依次加入0.96g2-溴甲基-3,5,6-三甲基吡嗪(1.2eq)、6.81g碳酸鉀(10eq)及少量KI催化劑，在60℃下反應(yīng)，直至原料銀杏內(nèi)酯B反應(yīng)完畢。冷卻至室溫，過濾后將濾液旋蒸除去得淡黃色油狀物。柱層析純化(V石油醚：V乙酸乙酯＝2:1)后得白色固體1.05gBM，收率39.92％；HPLC純度為98.25％。LC-MS：559.3[M+H+]，581.3[M+Na+]。1H-NMR(DMSO,400MHz)：1.14(s,9H,t-Bu),1.16-1.1.20(d,3H,14-Me)1.80-1.85(dd,2H,7-H),2.15-2.8(t,1H,8-H),2.42(s,3H,-CH3),2.49-2.53(d,6H,-CH3),2.82-2.88(q,1H,14-H),4.17-4.19(d,1H,1-H),4.71-4.73(d,1H,2-H),4.94-4.98(d,1H,1-OH),5.41(s,1H,-CH2-)5.42(s,1H,10-H),5.43-5.45(d,1H,6-H),5.54(s,1H,12-H),6.23(s,1H,3-OH).實(shí)施例5、化合物BD的制備稱取5.0g(11.78mmol)GB和3.83g(15.32mmol)2-(1-乙酰氧基戊基)苯甲酸溶于乙腈中，于冰浴中攪拌混合。然后加入0.29g(2.36mmol)4-二甲氨基吡啶(DMAP)和3.17g(16.49mmol)1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)，冰浴條件下攪拌1小時后，混合物于25℃反應(yīng)5h，旋蒸除去溶劑，用乙酸乙酯溶解粗產(chǎn)物，并用5％NaHCO3洗滌兩次，飽和氯化鈉洗滌一次。收集有機(jī)相，干燥，過濾并濃縮，分離純化后得白色固體BD共2.90g，收率37.46％，HPLC純度為98.14％。LC-MS：679.2[M+Na+]。1H-NMR(CDCl3,400MHz)：0.87-0.91(t,3H,-CH3),1.12(s,9H,t-Bu),1.27-1.1.29(d,3H,14-Me),1.32-1.36(dd,2H,7-H),1.45-1.49(t,1H,8-H),1.75-1.92(m,4H,-CH2CH2-),1.98(s,5H,-COCH3,-CH2CH3),2.37-2.39(q,1H,14-H),3.03-3.09(q,2H,1-H,2-H),4.37-4.39(d,1H,1-OH),4.54-4.56(d,1H,10-H),5.50-5.51(d,1H,6-H),5.89-5.94(m,1H,-CHCH2-),6.13(s,1H,12-H),6.23(s,1H,3-OH),7.32-7.38(m,2H,ArH),7.46-7.48(d,1H,ArH),7.50-7.54(d,1H,ArH).實(shí)施例6、BZ甲磺酸鹽的制備將2.0gBZ加入50mL丙酮中，攪拌加熱至40-50℃，溶清后向其慢慢滴加0.44g甲磺酸，滴加完畢后降溫攪拌30min，過濾，干燥，即得BZ甲磺酸鹽1.85g，收率79.06％。實(shí)施例7、BM甲磺酸鹽的制備將0.9gBM加入30mL丙酮中，攪拌加熱至40-50℃，溶清后向其慢慢滴加0.19g甲磺酸，滴加完畢后降溫攪拌30min，過濾，干燥，即得BM甲磺酸鹽0.82g，收率81.56％。實(shí)施例8、BZ鹽酸鹽的制備將1.0gBZ加入30mL無水乙醇中，攪拌加熱至60-70℃，溶清后向其慢慢滴加氯化氫乙醇溶液(含量30-40％)直至溶液PH為3左右，滴加完畢后降溫靜置析晶，析出白色固體，過濾后干燥，即得BZ鹽酸鹽0.72g，收率67.92％。實(shí)施例9、BM鹽酸鹽的制備將1.5gBM加入50mL無水乙醇中，攪拌加熱至60-70℃，溶清后向其慢慢滴加氯化氫乙醇溶液(含量30-40％)直至溶液PH為3左右，滴加完畢后降溫靜置析晶，析出白色固體，過濾，干燥，即得BM鹽酸鹽0.95g，收率59.38％。以下用試驗(yàn)例的方式說明本發(fā)明的有益效果。試驗(yàn)例1水溶性試驗(yàn)測定方法：取樣品研成細(xì)粉，定量稱取目標(biāo)化合物加入純化水中，超聲考察其溶解性。結(jié)果如表1所示。表1各目標(biāo)化合物在水中的溶解性化合物水中的溶解性(mg/mL)銀杏內(nèi)酯B(GB)0.11BM0.25BM甲磺酸鹽4.20BM鹽酸鹽4.65BZ0.30BZ甲磺酸鹽5.02BZ鹽酸鹽5.10BA0.22BL0.20BD0.25結(jié)果表明，銀杏內(nèi)酯B衍生物及其鹽的水溶性較銀杏內(nèi)酯B有明顯改善。試驗(yàn)例2銀杏內(nèi)酯B衍生物對原發(fā)性高血壓降壓藥理試驗(yàn)原發(fā)性高血壓是一種遺傳異質(zhì)性疾病，若干有微弱效應(yīng)的基因聯(lián)合作用生成高血壓，并受一系列環(huán)境因素的影響。高血壓病的病理過程常涉及動脈血管壁增厚、心肌纖維化、左室肥大和腎血管硬化，引致高血壓靶器官的損害，明顯增加心腦血管事件和腎臟病的發(fā)生率和死亡率，對人類危害極大。因此，合理控制血壓具有十分重要的臨床意義。自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneouslyhypertensiverats，SHR)與人類原發(fā)性高血壓有許多相似之處，包括它們的遺傳特性、發(fā)病過程以及高血壓并發(fā)癥的發(fā)生等，所以SHR被認(rèn)為是研究人類原發(fā)性高血壓的最佳動物模型，已被廣泛應(yīng)用于高血壓發(fā)病機(jī)制和抗高血壓藥物療效的實(shí)驗(yàn)研究中。故本試驗(yàn)選擇SHR大鼠作為試驗(yàn)動物。1、試驗(yàn)材料1.1試驗(yàn)藥品：BZ、BA、BL、BM、BD、GB，純度＞98％。1.2陽性對照藥物：卡托普利片(CaptoprilTablets)，25mg/片，上海普康藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號:101003。1.3試驗(yàn)儀器：BP-6無創(chuàng)動物血壓測量系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；FA1004電子分析天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。1.4試驗(yàn)動物：14周齡SHR大鼠112只，雌雄各半，體質(zhì)量(200～250)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(京)2007-001；相同周齡健康Wistar大鼠8只，雌雄各半，體質(zhì)量(200～250)g，由南京醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號:SCXK(蘇)2008-0004。2、試驗(yàn)方法2.1動物分組及給藥：取SHR大鼠112只，雌雄各半(雌性未孕)，體質(zhì)量200～250g，適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室5d，每天測血壓1次，以使大鼠適應(yīng)環(huán)境和檢測刺激。然后稱質(zhì)量、編號，隨機(jī)均分為14組，每組8只，即SHR大鼠模型對照組、陽性對照組(卡托普利，27mg/kg)、BZ大劑量組(120mg/kg/d)、BZ小劑量組(60mg/kg/d)、BA大劑量組(120mg/kg/d)、BA小劑量組(60mg/kg/d)、BL大劑量組(120mg/kg/d)、BL小劑量組(60mg/kg/d)、BM大劑量組(120mg/kg/d)、BM小劑量組(60mg/kg/d)、BD大劑量組(120mg/kg/d)、BD小劑量組(60mg/kg/d)、GB大劑量組(120mg/kg/d)、GB小劑量組(60mg/kg/d)。另取8只健康Wistar大鼠作為正常對照組。各藥物組大鼠分別按照上述劑量灌胃給藥，給藥容積為1mL/100g體質(zhì)量，正常對照組和SHR大鼠模型對照組大鼠灌胃等容量蒸餾水，給藥時間持續(xù)8周。2.2一般狀態(tài)：觀察期間，觀察大鼠的精神、飲水、攝食、排便、毛色、體質(zhì)量、活動度等情況。大鼠易激惹程度分為Ⅲ級:Ⅰ級指捉持大鼠頸部時無明顯反應(yīng)；Ⅱ級指捉持大鼠頸部時尖叫、驚跳；Ⅲ級指捉持大鼠頸部時咬人或同籠大鼠頻繁打斗。2.3血壓測定：用Bp-6無創(chuàng)血壓測量系統(tǒng)測定大鼠尾動脈收縮壓。在大鼠安靜狀態(tài)下，連續(xù)測收縮壓3次，取平均值作為測壓結(jié)果。觀察指標(biāo):①單次給藥降壓效果，測給藥前大鼠血壓、首次藥后30、60、90、120min的血壓情況；②連續(xù)給藥降壓情況，分別測定1、7、13、19、25、35、49、56d藥后30min血壓，每天重復(fù)測量3次，取所得平均值作為最終的血壓值。2.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法：試驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用SPSS15軟件進(jìn)行單因素方差分析檢驗(yàn)，以P＜0.05有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。3試驗(yàn)結(jié)果3.1對自發(fā)性高血壓大鼠一般狀態(tài)的影響：正常對照組大鼠進(jìn)食、飲水、活動情況均正常，反應(yīng)靈敏，毛色健康有光澤，精神狀態(tài)良好，未見任何異樣反應(yīng)；SHR大鼠模型組大鼠逐漸表現(xiàn)出被毛蓬松成簇?zé)o光澤，食量減少，體質(zhì)量下降，精神萎靡且易怒，在給藥及血壓檢測過程中，易出現(xiàn)劇烈抵抗、攻擊等行為，易激惹程度大部分由Ⅰ級轉(zhuǎn)變?yōu)棰?、Ⅲ級；銀杏內(nèi)酯B及其衍生物單次給藥后，各組大鼠行為學(xué)一般狀態(tài)觀察與模型對照組無明顯差別。連續(xù)給藥2周治療后，則精神狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，情緒相對穩(wěn)定，進(jìn)食量明顯增多，體質(zhì)量增長較快。每周稱取各組大鼠攝食量及體質(zhì)量一次，SHR大鼠模型組進(jìn)食量明顯減少、體質(zhì)量減輕，與正常對照組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；銀杏內(nèi)酯B及其衍生物高劑量組均可顯著增加SHR大鼠進(jìn)食量及體質(zhì)量，與SHR大鼠模型對照組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，結(jié)果見表2、表3。表2、對SHR大鼠每周進(jìn)食量的影響注:模型對照組與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；各藥物組與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。表3、對SHR大鼠每周體質(zhì)量的影響注:模型對照組與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；各藥物組與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。3.2對自發(fā)性高血壓大鼠的降壓效果3.2.1單次給藥對自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈壓明顯高于正常對照組，與之比較有高度顯著性差異(P＜0.01)；各藥物組單次給藥30min后，即對自發(fā)性高血壓大鼠有明顯的降壓作用，在藥后各時間點(diǎn)，收縮壓有明顯降低趨勢，與自發(fā)性高血壓大鼠模型組比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，降壓作用可持續(xù)到藥后120min，與藥前血壓比較，在藥后30、60、90、120min等時間點(diǎn)亦有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，見表4。表4、各藥物組單次用藥對自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響(x±s，n＝8)注:模型對照組與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；各藥物組與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與給藥前比較，#P＜0.05，##P＜0.01。3.2.2連續(xù)給藥對自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響試驗(yàn)結(jié)果顯示:自發(fā)性高血壓大鼠隨著年齡的增長，血壓逐漸升高，與正常對照組比較有高度顯著性差異(P＜0.01)，在實(shí)驗(yàn)第7天～第56天，與實(shí)驗(yàn)前比較有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；各藥物組可顯著抑制自發(fā)性高血壓大鼠血壓升高的病理進(jìn)展，連續(xù)用藥后，在不同時間段收縮壓及舒張壓均有所降低，各藥物組低劑量組降壓過程出現(xiàn)一定的波動，但高劑量組則表現(xiàn)出較為平穩(wěn)的降壓效果，與模型組比較及用藥前比較均有顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)，見表5。表5、各藥物組連續(xù)用藥8周對自發(fā)性高血壓大鼠尾動脈收縮壓的影響(x±s，n＝8)注:模型對照組與正常對照組比較，＊＊P＜0.01；各藥物組與模型對照組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與給藥前比較，#P＜0.05，##P＜0.01。上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，銀杏內(nèi)酯B衍生物與銀杏內(nèi)酯B的高劑量組和低劑量組單次及連續(xù)給藥后均能顯著降低自發(fā)性高血壓大鼠的血壓值，有顯著的降壓作用。綜上所述，本發(fā)明提供的銀杏內(nèi)酯B衍生物及其鹽，水溶性較銀杏內(nèi)酯B有明顯改善，很好地解決了后者水溶性差、生物利用率低、藥效無法充分發(fā)揮的缺陷。藥效實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明化合物對心腦血管疾病有顯著的治療作用，可用于預(yù)防和/或治療高血壓、腦卒中、冠心病、心律失常、心力衰竭、血脂異常、肺血管病、慢性腎臟病、外周血管病等，如心肌梗死、冠狀動脈疾病、動脈粥樣硬化、左主干病變、分叉病變、心絞痛、血栓、、肺源性心臟病、內(nèi)分泌病性心臟病、貧血性心臟病、心臟神經(jīng)癥、營養(yǎng)代謝性心臟病、主動脈瘤、下肢動脈硬化疾病、周圍動脈疾病、顱內(nèi)動脈瘤、動脈硬化性動脈瘤、缺血性腦卒中、出血性腦卒中、高血脂、動脈硬化、運(yùn)動猝死、心源性猝死、中風(fēng)、低血壓、血管栓塞、肺栓塞、房顫、高血壓性腦病、高血壓合并腦卒中、腦出血、腦血栓、腦栓塞、腦梗塞、腦動脈炎、腦動脈硬化、腔隙性梗塞、血管性癡呆、慢性腎臟病、慢性心功能不全、痛風(fēng)性腎病、糖尿病腎病和/或腎功能異常等心腦血管疾病，為臨床上預(yù)防和/或治療心腦血管疾病提供了一種新的選擇。當(dāng)前第1頁1 2 3