本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及一種溝葉結(jié)縷草全長cDNA文庫構(gòu)建的方法。

背景技術(shù)：

cDNA文庫是以某種生物在特定時(shí)期、特定組織或特定處理下所表達(dá)的全部mRNA為模板，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄形成的混合cDNA與適當(dāng)?shù)妮d體進(jìn)行連接或重組后，轉(zhuǎn)化受體菌獲得包括所有mRNA信息的cDNA克隆集合；近些年，cDNA文庫成為基因挖掘或分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)，如通過cDNA文庫獲取大量的EST序列，采用cDNA表達(dá)文庫篩選獲得優(yōu)異的抗逆基因，利用cDNA酵母雙雜文庫篩選獲得互作蛋白。

溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）屬禾本科（Gramineae）畫眉草亞科（Chloridoideae）結(jié)縷草屬植物，是優(yōu)異的多年生暖季型草坪草，在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效應(yīng)；同時(shí)，溝葉結(jié)縷草為鹽生植物，是鹽堿地寶貴的生物基因資源，其鹽脅迫下cDNA文庫構(gòu)建的研究未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供了一種溝葉結(jié)縷草全長cDNA文庫的構(gòu)建方法，本發(fā)明的技術(shù)問題可通過如下技術(shù)方案解決：

1.采用Trizol 法提取總RNA，通過mRNA純化試劑盒獲得高質(zhì)量mRNA；

2.將步驟1的mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，RNA消化，純化獲得高質(zhì)量第一鏈cDNA；

3.采用cap-antibody磁珠富集步驟2中帶5’帽子結(jié)構(gòu)的第一鏈cDNA；

4.給步驟3中的cDNA加上5’接頭后純化，合成cDNA第二鏈，形成雙鏈cDNA；

5.對步驟4中的雙鏈cDNA進(jìn)行分級分離及收集，獲得高純度的雙鏈cDNA；

6.步驟5獲得的雙鏈cDNA與文庫載體pDONR/Zeocin進(jìn)行BP重組，電轉(zhuǎn)大腸桿菌DH10B，即完成溝葉結(jié)縷草全長未剪切cDNA文庫的構(gòu)建。

有益效果：

1．本發(fā)明提供的溝葉結(jié)縷草全長cDNA表達(dá)文庫，可直接用于測序、功能基因組學(xué)研究，用于優(yōu)異基因的規(guī)模化篩選；

2．本發(fā)明提供的文庫構(gòu)建的方法，可為其他植物文庫構(gòu)建提供參考。

附圖說明

圖1 為具體實(shí)施方式1中提取的溝葉結(jié)縷草植株（包括根莖葉）的總RNA（a）及mRNA純化（b）檢測的電泳圖及濃度檢測圖；

圖2 為具體實(shí)施方式7中的文庫濃度檢測及PCR檢測，a：取電轉(zhuǎn)化菌液10μL按照1:100稀釋取50μL涂布平板后，長出的克??；b：隨機(jī)挑選32個(gè)克隆，PCR檢測其插入片段大小。

具體實(shí)施方式

1. RNA提取與mRNA純化。

采用水培法進(jìn)行鹽處理，取300 mM NaCl的Hoagland 營養(yǎng)液處理10 d后的溝葉結(jié)縷草植株，采用Trizol RNA試劑盒（Invitrogen）提取根、莖、葉的總RNA，采用1%凝膠電泳檢測RNA條帶清晰，Thermo nanodrop 核酸分析儀定量結(jié)果表明（圖1a），RNA濃度為884.6ng/μL，A260/A280為1.93，總體積600μL，RNA總量達(dá)到520μg。采用Dynabeads? mRNA Purification Kit（Invitrogen）分離純化mRNA，檢測結(jié)果表明（圖1b），mRNA在1-5kb呈現(xiàn)彌散條帶，mRNA濃度達(dá)到12.8 ng/μL，A260/A280為2.17，總體積400μL，mRNA總量達(dá)到5.12μg。這些結(jié)果均達(dá)到文庫構(gòu)建的要求。

2. 第一鏈cDNA合成及RNA消化。

取實(shí)施方式1中得到的mRNA，經(jīng)乙醇沉淀，溶于22.5 μL DEPC水中，按下表在0.2ml RNase free tube中配置引物反應(yīng)體系：

70℃處理7min，然后在15min內(nèi)緩慢降至45℃；按下表依次加入：

混勻后并運(yùn)行以下程序：45℃ 20min，50℃ 20min，55℃ 20min。然后經(jīng)乙醇沉淀，溶于179μL DEPC水中。按下列體系進(jìn)行RNA消化處理：

37℃孵育30min；然后經(jīng)酚抽提和乙醇沉淀，最后用300μL TEN buffer重懸cDNA沉淀，獲得高質(zhì)量cDNA第一鏈。

3. 富集帶5’帽子結(jié)構(gòu)的一鏈cDNA。

① 取充分混勻的cap-antibody（Invitrogen）磁珠300μl，于磁架上靜置2min、去上清，用300μL的TEN buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mM NaCl）重懸洗滌2次，去上清后，加入300μL的TEN buffer和20μg的酵母tRNA重懸磁珠，置于室溫孵育10min。

② 重懸①的磁珠，加入實(shí)施方式2中獲得的300μL高質(zhì)量cDNA第一鏈，室溫孵育60min，每隔20min混勻一次；然后于磁架上靜置2min、去上清；用300μl的TEN buffer重懸洗滌2次，去上清后，加入300μL的TENG buffer（10 mM Tris-HCl，pH 7.5；0.1 mM EDTA；25 mM NaCl；1 mM GDP）重懸cap-antibody磁珠并轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中，靜置，去上清。

③ 加入100μL的50 mM NaOH重懸②的磁珠，于37℃孵育10min，靜置、取上清置于新的離心管中，即為洗脫的cDNA；然后加入100μL的1M Tris-Hcl（pH7.0）中和cDNA中的NaOH。重復(fù)兩次，最后收集的洗脫液管中溶液總體積為400μL。

④ 采用DNA柱純化試劑盒，純化400μL洗脫液，用22μL的DEPC水過柱洗滌獲得全長篩選富集的cDNA第一鏈溶液。

4. 加5’接頭及雙鏈cDNA合成。

加入以下產(chǎn)物置于PCR儀上，95℃ 10分鐘，立即從PCR儀上取出，置于室溫，放置30分鐘，合成attB1 adapter接頭；

將具體實(shí)施方式3中獲得的22μL的cDNA第一鏈溶液中依次加入以下試劑

用槍混勻后置于16℃孵育24小時(shí)，然后采用DNA柱純化試劑盒純化，用80μL的DEPC水過柱洗滌獲得帶接頭的cDNA第一鏈溶液；

按照以下體系合成cDNA第二鏈，形成雙鏈cDNA溶液

68℃ 20 min，72℃ 20 min，置于冰上待用。

5. cDNA分級分離及收集。

向具體實(shí)施方式3中獲得的100μl的雙鏈cDNA中加入50μL的TEN buffer，混勻后加入分級柱（Invitrogen）中，收集全部濾過液到1號(hào)收集管；然后向分級柱中加入250μL的TEN buffer，收集全部濾過液到2號(hào)收集管；向分級柱中加入50μL的TEN buffer，收集全部濾過液到3號(hào)收集管；向分級柱中加入100μL的TEN buffer，收集全部濾過液到4號(hào)收集管；向分級柱中加入100μL的TEN buffer，收集全部濾過液到5號(hào)收集管；取2號(hào)收集管的產(chǎn)物，經(jīng)乙醇沉淀，用14μL溶解cDNA雙鏈，用于下一步反應(yīng)。

6．BP重組及電轉(zhuǎn)化。

按下表加入各成分：

混勻后置于25℃，20小時(shí)。然后加入2μL的ProreinaseK，37℃，15min；75℃，10min。再經(jīng)乙醇沉淀，用8μL的TE Buffer溶解cDNA；將純化的2uL重組產(chǎn)物和50μL電轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞DH10B混合加入預(yù)冷電轉(zhuǎn)杯，冰上置45min；于TX ECM 630電轉(zhuǎn)化儀上電擊轉(zhuǎn)化，其條件設(shè)置為：

電擊后迅速向電轉(zhuǎn)杯中加入SOC培養(yǎng)基1mL，將電轉(zhuǎn)物取入到新的15mL離心管，置于37℃，225-250rpm搖床培養(yǎng)1小時(shí)；培養(yǎng)結(jié)束后，此即為全長未剪切cDNA文庫菌液。

7．文庫質(zhì)量檢測。

取菌液10μL按照1:100稀釋取50μL涂布平板用于庫容量鑒定、插入片段大小評價(jià)及測序檢測；經(jīng)檢測（圖2a），轉(zhuǎn)化平板的菌液濃度為：CFU/ml= 500/50μL ×100 × 1000μL=1×10⁶cfu/mL，共電轉(zhuǎn)3次，共獲得3mL菌液，總克隆數(shù)CFU達(dá)到3×10⁶ 個(gè)；

隨機(jī)挑選32個(gè)克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測，其檢測體系為：

其PCR擴(kuò)增條件為：

其檢測結(jié)果如圖2b，重組率達(dá)到100%，平均插入片段大小為1.59kb。另外，也通過測序，BLASTX分析表明，16個(gè)克隆序列（SEQ ID NO. 6-21）中均包括了預(yù)測的起始密碼子序列，全長率達(dá)到100%。

綜上所述，本發(fā)明成功構(gòu)建了高質(zhì)量的溝葉結(jié)縷草全長cDNA文庫，不僅為開展溝葉結(jié)縷草功能基因組學(xué)研究奠定了新思路，同時(shí)也為其它植物文庫構(gòu)建提供了新方法。

<110> 江蘇省中國科學(xué)院植物研究所

<120> 一種溝葉結(jié)縷草全長cDNA文庫構(gòu)建的方法

<160> 21

<210> 1

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 第一鏈cDNA合成引物序列Biotin-attB2-Oligo(dT) Primer

<400> 1

ggcggccgca caactttgta caagaaagtt gggttttttt tttttttttt ttt 53

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 5’接頭合成引物attB1-adapter-F

<400> 2

tcgtcgggga caactttgta caaaaaagtt gg 32

<210> 3

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 5’接頭合成引物attB1-adapter-R

<400> 3

cccctgttga aacatgtttt ttcaacc 27

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 文庫質(zhì)量檢測的PCR反應(yīng)引物pDONR222F

<400> 4

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtctt 36

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> 文庫質(zhì)量檢測的PCR反應(yīng)引物pDONR222R

<400> 5

agagctgcca ggaaacagct atgaccatgt aatacgactc 40

<210> 6

<211> 96

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 6

1 tgaaaggagacgagtcgagagaagcggcggcggcagcgacccgatccgccaccgccaccg

61 ccggcgacgataccctgctaacaagagaagatggca

<210> 7

<211> 96

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 7

1 caccaccgcaaatctcctcgtcgcattcgcagaggtgccgccgattcgaccagggatggc

61 g

<210> 8

<211> 294

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 8

1 atccccgattccccgcctcggactcggcggctccgtcttcccttccaaccagcgataggt

61 aatcccatttcttgtcggcgcatttttcgttgcagctgtagccagtagccctgccgccgc

121 gagtgggtgattgatcggagaaaggaacgatctttccgcaaccttgctcccgtgggtgct

181 gctgactaccgattctcaggccccgatccgcgattctcgtggggccaacaacaacaaggg

241 gggcgggcaggctgaccctgacccgcggcggcgccggcggttgggttgatgaat

<210> 9

<211> 128

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 9

1 tacagtttttactctcggtgcgcctgcgtgcacttcacaaacatcgtgaggcagcggcag

61 ccaccgaccgtcgagcacgaacgtcgagatagccggccggccgtagatcgtccgtctgag

121 tcatgggg

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 10

1 ctcgaagcttctccctccctccagccagtcgagccatcaccatcaccccgcgccgagatg

61 ggc

<210> 11

<211> 134

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 11

1 gcttgattccagtcagaatcggtggctgtcgctgagcttcgtcgttcgctcctccagatc

61 cggcagcacggacaggttgcggagttgattccgtcttgctggagtagagacgtgtgcttc

121 ttgttgtcatggag

<210> 12

<211> 19

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 12

1 gcggcacatcggaatgcat

<210> 13

<211> 167

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 13

1 ggcgcgggagcaccagaaaggaaacccgaggcgaggcggccgtgtggcttcgcccaccac

61 caccgcctgccttcttagcctcctcgctttgccatttttgggagtgttcgagggttccgc

121 tggattcccattttcgggagcggacgcgccgatcggccaggatggtg

<210> 14

<211> 71

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 14

1 ctccccactccacacacaccaacgcaaacagccactcctcacctcccccaccctccctcc

61 ggttcatgtcc

<210> 15

<211> 54

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 15

1 agagagagagagagagagagagagagagctcagctcatcagggcgacaatggcg

<210> 16

<211> 96

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 16

1 cctccctcccctcaaacacacgcacgccgccgagccgagcaaacgcaagcgatcaaaacc

61 agcgagacccgaccgccgaagacaacgaggatggca

<210> 17

<211> 320

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 17

1 gcggccgccacggcccaaagcccaacaacgcgcccccggtcatcgtccacaaggccgacc

61 gcgccgccgcctcgcctccaacttcagctccctcgttcctgccgtttcggcgtcggcgaa

121 ttcggctcccgccccgccgcgcgaggggaatcgttccgtcctcgtacgctgccgtggaag

181 gacggcagcagcaccgcgcttaggtgcggctgtagacggacggtagctgcacagcaccga

241 gcagcggctcggtctcgtcttgtgctgccagcgccgcctccaacaggaacttcagcatat

301 ctaggaacttcaagatgttc

<210> 18

<211> 111

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 18

1 gtgtcctcggcttcctcccaagtcccaccccccactcccctctcccgtccttcctgcctg

61 ccgcctgccggagctccggctctcgatctcgcatcgcagacgaaaatgcag

<210> 19

<211> 172

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 19

1 ccagccgccgccggaaccgtagtctcccgtttcctccaccccggcgaaacgatggcgatg

61 cagtccggcaggcgagtgttgtagtcagaaggttggtttcccagtccccggtcccgaccc

121 gaaaggagtacgcgagcgcagcgtgacctttgcctccgctgttgccatggcc

<210> 20

<211> 64

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 20

1 ctttcttccgcttacttcgagctcacacagagtgtgagactggtcagagttgtgttccat

61 ggcg

<210> 21

<211> 157

<212> DNA

<213> 溝葉結(jié)縷草（Zoysia matrella）

<220>

<223> 溝葉結(jié)縷草文庫基因ATG上游啟動(dòng)子序列

<400> 21

1 gcggccgggtcggatccgctagtctcggtagaagacccattctcgccagtcccctctacc

61 gacccctcgcgaactcctcgcccgccggatcggatcggccccgggcaccgctccgcgccg

121 ccgctgccaccgccacctcagatcagagaagatggcc