本發(fā)明屬于天然產(chǎn)物有效成分的分離純化領(lǐng)域，特別涉及一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法。

背景技術(shù)：

肉蓯蓉(Cistanche deserticola Y.C.Ma)又名蓯蓉、疆蕓、寸蕓等，為列當(dāng)科(Orobanchaceae(肉蓯蓉屬(Cistanche Hoffmg.et Link)多年生寄生植物。肉蓯蓉以其肉質(zhì)莖入藥，具有多種生物活性，已發(fā)現(xiàn)的相關(guān)藥理生理活性有：激素調(diào)節(jié)、通便、肝保護(hù)、神經(jīng)保護(hù)、心肌缺血保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)骨形成等功效。肉蓯蓉主要化學(xué)成分有：苯乙醇苷類、苯甲醇苷類、環(huán)烯醚萜類、單萜類、木脂素和苯丙醇類、生物堿類、氨基酸、糖類、甾醇和揮發(fā)油類成分。其中苯乙醇苷類被認(rèn)為是肉蓯蓉主要的活性成分，目前已發(fā)現(xiàn)的苯乙醇苷類化合物大約有20多種，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷是肉蓯蓉中含量較高且是苯乙醇苷類發(fā)揮其活性作用的主要化合物，且國內(nèi)以這兩種成分做為評價肉蓯蓉質(zhì)量的主要指標(biāo)，所以在提取肉蓯蓉中苯乙醇苷時，希望得到的松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量更高。

現(xiàn)有技術(shù)中對肉蓯蓉中苯乙醇苷的提取一般都是用溶劑提取法，例如CN105017344、CN102441040公開了一種從肉蓯蓉中提取苯乙醇苷的工藝方法，采用有機(jī)溶劑對其回流提取，利用大孔吸附樹脂分離苯乙醇苷，但大孔樹脂需進(jìn)行前處理步驟較多、費(fèi)時；又如CN101041677應(yīng)用膜分離技術(shù)從肉蓯蓉中生產(chǎn)含有苯乙醇苷的原料及其制備方法，但采用膜設(shè)備成本較高，且其易導(dǎo)致膜污染、堵塞，需對膜進(jìn)行物理或化學(xué)清洗，延長非工藝時間；又如CN104189100公開了一種雙水相萃取蓯蓉苯乙醇苷的方法，其是將肉蓯蓉粉末加入乙醇/硫酸銨、乙醇/磷酸氫二鉀、乙醇/檸檬酸鈉或PEG/硫酸銨體系等雙水相體系中進(jìn)行提取，該技術(shù)采用了雙水相萃取方法，其作為一種新型的綠色分離富集技術(shù)，具有條件溫和、含水量高、高效和耗能低等優(yōu)點(diǎn)，但該方法仍然存在著有機(jī)溶劑易揮發(fā)，雙水相體系不能重復(fù)利用，性質(zhì)不穩(wěn)定，會對環(huán)境造成污染等問題；并且得到的苯乙醇苷類化合物中，松果菊苷和毛蕊花糖苷的總含量相對低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種新的鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法采用低共熔溶劑水溶液作為提取溶劑，經(jīng)濟(jì)環(huán)保，低共熔溶劑可回收利用，并且和鹽組成雙水相體系，進(jìn)行分離純化，能夠顯著提供肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量，并且苯乙醇苷中，松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩個苯乙醇苷的收率也相對提高；因此，利用這項(xiàng)技術(shù)為從天然產(chǎn)物中提取活性成分提供了新的研究思路。

本發(fā)明具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明一方面提供了一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向肉蓯蓉粉末中加入低共熔溶劑水溶液，提取，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃?。合虿襟ES1得到的肉蓯蓉粗提液中加入磷酸鹽，混勻得雙水相體系，調(diào)pH，靜置，分相，分離上相和下相；

S3：二次雙水相萃取：取步驟S2分離得到的上相，加入與上相等體積的磷酸鹽水溶液，充分混勻，得二次雙水相體系，靜置，分相，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，除鹽，冷凍干燥，得到肉蓯蓉苯乙醇苷。

低共熔溶劑是由2種或2種以上固體混合而形成的溶液，只需將季銨鹽和氫鍵給體混合加熱攪拌成均一的液體即可，合成過程中原子利用率達(dá)100％，無需純化就可得到高純度的產(chǎn)品，且合成原料來源豐富、價格低廉。低共熔溶劑具有離子液體的優(yōu)良性質(zhì)又比離子液體廉價、容易制備且無毒性，具有蒸汽壓低、無毒性、可生物降解性、溶解性良好等特點(diǎn)，是一種真正的綠色溶劑。

進(jìn)一步的改進(jìn)，低共熔溶劑水溶液中的低共熔溶劑由摩爾比為1:1-3的季銨鹽和氫鍵給體組成，所述季銨鹽為氯化膽堿，所述氫鍵供體為甘油、草酸、葡萄糖或山梨糖醇中的一種或多種。

進(jìn)一步的改進(jìn)，低共熔溶劑由摩爾比為1:2:1的氯化膽堿、甘油和草酸組成、或由摩爾比為1:1:1的氯化膽堿、葡萄糖和甘油組成、或由摩爾比為1:1的氯化膽堿和山梨糖醇組成。

進(jìn)一步的改進(jìn)，低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50-70％，所述肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:15-20。

本發(fā)明提供的低共熔溶劑一方面作為提取溶劑，另一方面作為雙水相體系的其中一相，利用該種提取方法顯著提高了肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩個苯乙醇苷的收率。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟S1中所述提取為微波提取，微波提取功率為100-300W，提取時間為3-5min。

通過本發(fā)明提供的微波提取，可顯著降低整個提取時間，如果本發(fā)明選擇的微波參數(shù)不在以上保護(hù)范圍內(nèi)，微波功率或時間過大，會破會肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致提取收率降低，如果微波功率或時間過小會導(dǎo)致提取不完全，影響收率。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟S2中所述磷酸鹽為K₂HPO₄、Na₂HPO₄或K₃PO₄，雙水相體系中磷酸鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％-63％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22％-30％。

磷酸鹽和低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算方法如下：

低共熔溶劑質(zhì)量＝低共熔溶劑水溶液質(zhì)量乘以低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

嚴(yán)格控制雙水相體系中磷酸鹽和低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)可顯著提高肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩個苯乙醇苷的收率，如果沒有到達(dá)上述的質(zhì)量分?jǐn)?shù)會出現(xiàn)鹽析或不分相等現(xiàn)象，進(jìn)而降低提取收率。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟B中，分相溫度為室溫，分相時間為10-15min。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟B中，所述pH為6-8。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟C中，所述磷酸鹽水溶液為K₂HPO₄水溶液，所述K₂HPO₄水溶液的濃度為0.5-0.8g/mL。

進(jìn)一步的改進(jìn)，步驟C中，分相時間為10-15min。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明所提供的一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法的優(yōu)點(diǎn)在于：

1)本發(fā)明所提供的鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法中，利用了低共熔溶劑/鹽雙水相萃取體系，其是將一定量低共熔溶劑和鹽溶液相互混合，達(dá)到一定濃度后，低共熔溶劑和鹽聚集在兩相中；目標(biāo)產(chǎn)物集中于一相，雜質(zhì)集中于另一相，可達(dá)到分離純化目的。與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取相比，本發(fā)明提供的方法具有成本低、環(huán)境友好、揮發(fā)性小、溶解性能良、提取收率高等優(yōu)點(diǎn)，綠色環(huán)保。

2)本發(fā)明所提供的鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法提取和萃取環(huán)境條件溫和，分相時間短，顯著提高了肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩個苯乙醇苷的收率。

3)本發(fā)明所提供的鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法中所使用的設(shè)備簡單，投資費(fèi)用較低，操作簡單、方便。

4)本發(fā)明所提供的鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法處理量大，能耗低，適合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

5)本發(fā)明為天然產(chǎn)物中活性成分的提取分離提供一種新的萃取分離技術(shù)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為65％的低共熔溶劑水溶液，肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:18，低共熔溶劑由摩爾比為1:1的氯化膽堿和山梨糖醇組成，微波提取，微波提取功率為150W，提取時間4min，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃?。合虿襟ES1得到的肉蓯蓉粗提液中加入K₃PO₄，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至8，靜置，室溫分相12min，分離上相和下相；雙水相體系中K₃PO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28％；

S3：二次雙水相萃取：取步驟S2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.55g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相12.5min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，除鹽，冷凍干燥，得到185.2mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為18.52％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的87.7％。

實(shí)施例2

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60％的低共熔溶劑水溶液，肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:15，低共熔溶劑由摩爾比為1:2:1的氯化膽堿、甘油和草酸組成，微波提取，微波提取功率為200W，提取時間3min，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃?。合虿襟ES1得到的肉蓯蓉粗提液中加入K₂HPO₄，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至6，靜置，室溫分相10min，分離上相和下相；雙水相體系中K₂HPO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為53.4％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)23％；

S3：二次雙水相萃取：取步驟S2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.7g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相15min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，除鹽，冷凍干燥，得到肉蓯蓉苯乙醇苷，得到217.4mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為21.74％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的88.3％。

實(shí)施例3

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％的低共熔溶劑水溶液，肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:20，低共熔溶劑由摩爾比為1:1:1的氯化膽堿、葡萄糖和甘油組成，微波提取，微波提取功率為100W，提取時間5min，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃?。合虿襟ES1得到的肉蓯蓉粗提液中加入K₃PO₄，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至7.5，靜置，室溫分相15min，分離上相和下相；雙水相體系中K₃PO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)30％；

S3：二次雙水相萃?。喝〔襟ES2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.8g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相15min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，0℃低溫除鹽，冷凍干燥，得到得到179.7mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為17.97％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的85.8％。

實(shí)施例4

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的低共熔溶劑水溶液，肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:17.5，低共熔溶劑由摩爾比為1:1的氯化膽堿和山梨糖醇組成，微波提取，微波提取功率為300W，提取時間4min，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃?。合虿襟ES1得到的肉蓯蓉粗提液中加入Na₂HPO₄，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至7，靜置，室溫分相12min，分離上相和下相；雙水相體系中Na₂HPO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)27％；

S3：二次雙水相萃?。喝〔襟ES2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.5g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相12min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，0℃低溫除鹽，冷凍干燥，得到194.4mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為19.44％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的87.1％。

對比例1

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入無水乙醇，肉蓯蓉粉末與無水乙醇的固液比為1:17.5，微波提取，微波提取功率為300W，提取時間4min，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃取：向步驟S1得到的肉蓯蓉粗提液中加入Na₂HPO₄和低共熔溶劑，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至7，靜置，分相12min，分離上相和下相；雙水相體系中Na₂HPO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為28％；由摩爾比為1:1的氯化膽堿和山梨糖醇組成；

S3：二次雙水相萃?。喝〔襟ES2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.5g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相12min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，4℃低溫除鹽，冷凍干燥，得到82.1mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為8.21％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的73.4％。

對比例2

一種鹽誘導(dǎo)低共熔溶劑萃取肉蓯蓉中苯乙醇苷的方法，該方法包括如下步驟：

S1：向1g肉蓯蓉粉末中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為70％的低共熔溶劑水溶液，肉蓯蓉粉末與低共熔溶劑水溶液的固液比為1:17.5，低共熔溶劑由摩爾比為1:1的氯化膽堿和山梨糖醇組成，超聲提取，超聲提取功率為800W，提取時間40min，超聲提取頻率為40kHz，過濾，得到肉蓯蓉粗提液；

S2：雙水相萃取：向步驟S1得到的肉蓯蓉粗提液中加入Na₂HPO₄，室溫混勻得雙水相體系，調(diào)pH至7，靜置，分相12min，分離上相和下相；雙水相體系中Na₂HPO₄的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為63％，雙水相體系中低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)28％；

S3：二次雙水相萃取：取步驟S2分離得到的上相，加入與上相等體積的K₂HPO₄水溶液，K₂HPO₄水溶液的濃度為0.5g/mL，充分混勻，得二次雙水相體系，室溫靜置，分相12min，分離下相；

S4：回收肉蓯蓉苯乙醇苷：將步驟S3分離得到的下相，4℃低溫除鹽，冷凍干燥，得到9.5mg肉蓯蓉苯乙醇苷，收率為9.5％，其中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的72.5％。

從對比例1和對比例2中可以看出，本發(fā)明提供的各步驟對肉蓯蓉中苯乙醇苷的收率具有顯著的影響，當(dāng)采用的提取溶劑換成了乙醇后，可顯著影響肉蓯蓉中苯乙醇苷的收率，由此得出提取過程采用低共熔溶劑作為提取溶劑、微波提取可顯著提高肉蓯蓉中苯乙醇苷的含量，并且使得苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量也相對提高。

參數(shù)考察

分別對本發(fā)明S1-S3步驟的各參數(shù)進(jìn)行考察，測得不同參數(shù)下，肉蓯蓉中苯乙醇苷的收率和苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，對步驟S1-S3的考察結(jié)果分別見表1-3，未變化的各參數(shù)同實(shí)施例4。

表1步驟S1中各參數(shù)考察結(jié)果

表2步驟S2中各參數(shù)考察結(jié)果

表3步驟S3中各參數(shù)考察結(jié)果

注：固液比為肉蓯蓉粉末的質(zhì)量與低共熔溶劑水溶液的體積之比，收率為肉蓯蓉中總苯乙醇苷的收率，含量為松果菊苷和毛蕊花糖苷的總重量占肉蓯蓉苯乙醇苷總重量的百分比。

通過對本發(fā)明步驟S1-S3各參數(shù)的考察可以看出，將本發(fā)明的低共熔溶劑換成本發(fā)明以外的低共熔溶劑均會影響肉蓯蓉中苯乙醇苷的收率，并且由于選擇的低共熔溶劑不能夠很好地與磷酸鹽進(jìn)行分相，所以苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的收率也相對降低；當(dāng)?shù)凸踩廴軇┧芤旱馁|(zhì)量分?jǐn)?shù)過高或過低，都會影響苯乙醇苷的收率；當(dāng)微波功率參數(shù)過大時，會破壞肉蓯蓉中苯乙醇苷的結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使得其收率降低，當(dāng)參數(shù)過小導(dǎo)致提取不完全而使得收率降低；當(dāng)雙水相體系中磷酸鹽和低共熔溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均沒有達(dá)到合適的比例時，由于出現(xiàn)鹽析或者不能分相等原因，也會影響肉蓯蓉中苯乙醇苷的收率，并且使得苯乙醇苷中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量顯著降低，等等，因此，為了提高肉蓯蓉中苯乙醇苷的提取收率，及松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量，各步驟的參數(shù)均應(yīng)落入本發(fā)明保護(hù)的范圍內(nèi)，否則會顯著降低肉蓯蓉中松果菊苷和毛蕊花糖苷這兩個苯乙醇苷的收率。