本發(fā)明屬于植物分子生物學和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種小米α淀粉酶在導致花粉敗育中的應(yīng)用，還涉及結(jié)合該應(yīng)用，利用現(xiàn)代生物技術(shù)，應(yīng)用于雜交種子生產(chǎn)技術(shù)體系，保證制種質(zhì)量，以及提高制種效率；也可以應(yīng)用于防止轉(zhuǎn)基因擴散。

背景技術(shù)：

植物雜種優(yōu)勢利用是最為經(jīng)濟有效的提高糧食產(chǎn)量的途徑之一，但其仍存在一些限制因素，例如組合優(yōu)良難度較大、雜交作物所占的比重較小等。雖然幾乎所有的農(nóng)作物都已最大的可能利用雜種優(yōu)勢，但仍蘊藏著巨大的潛力。因此諸多學者進行研究，尤其是水稻，其雜種優(yōu)勢主要途徑由“三系法”到“兩系法”，提高了配組自由度，提高了水稻雜種優(yōu)勢水平。但“兩系法”的溫敏不育系受溫度的影響過大，會造成制種失敗，損失嚴重。由于雄性不育系的資源有限，嚴重制約水稻雜交技術(shù)。

90年代初，Mariani等人利用來自煙草的花藥絨氈層的特異啟動子(TA29)和核糖核酸酶基因(Barnase)重組表達盒轉(zhuǎn)化煙草和油菜，并成功獲得雄性不育系，開創(chuàng)了人工制備雄性不育系的新途徑(Denis M,Delourme R,Gourret J P,et al.Expression of engineered nuclear male sterility in Brassica napus(genetics,morphology,cytology,and sensitivity to temperature)[J].Plant Physiology,1993,101(4):1295-1304.)。當前，很多研究表明分析其他功能基因也可能通過基因工程方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因雄性不育植株。

植物雄性不育主要表型，體現(xiàn)在花粉敗育，它涉及到花器官中雄蕊的發(fā)生與發(fā)育、絨氈層結(jié)構(gòu)、小孢子形成、花藥開裂以及外部生態(tài)環(huán)境等眾多環(huán)節(jié)或因素，其中弄清花粉發(fā)育的全過程和分子機理是研究植物雄性不育的基礎(chǔ)和關(guān)鍵所在。而花粉發(fā)育涉及到眾多基因的表達調(diào)控，其中了解到在花粉發(fā)育后期，淀粉能為花粉萌發(fā)和花粉管延伸儲備能量。因此，當花粉粒中的淀粉提前被α-淀粉酶降解，使得花粉粒能量來源被瓦解，從而遏制花粉的生長，出現(xiàn)畸形花粉粒，導致植物雄性不育。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，主要分布在動植物、細菌和真菌，人們通過利用基因工程技術(shù)，已經(jīng)克隆出了各種淀粉酶基因的cDNA序列(崔錦，馬向東(2009)淀粉酶基因的多樣性.鄭州牧業(yè)工程高等專科學校學報，29(2):21-23)。同時對淀粉酶的多樣性進行了研究，表明除了在來源多樣性外，其基因結(jié)構(gòu)和功能方面皆呈現(xiàn)多樣性。根據(jù)其對淀粉酶的作用方式不同進行分類，α-淀粉酶屬于內(nèi)切型淀粉酶，可以從淀粉分子的內(nèi)部隨機切割α-1，4糖苷鍵，使淀粉水解成麥芽糖、葡萄糖等，釋放能量(Morris G P,Beck P L,Herridge M S,et al.Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon[J].Gastroenterology,1989,96(3):795-803.)。因此，在成熟花粉中，適量的淀粉酶可水解淀粉，為花粉的正常發(fā)育和花粉管的萌發(fā)、生長提供能量。相反，若在花粉形成過程中淀粉酶過表達和沉默表達，都會降低花粉能量代謝水平，導致淀粉積累量不足，產(chǎn)生敗育花粉。而在水稻花粉敗育基因方面的研究，鮮少報道。

水稻是我國的民族產(chǎn)業(yè)，研究水稻開花機理意義重大。水稻的花粉形成發(fā)生在雄蕊中的花藥中，花藥含有生殖細胞，這些生殖細胞形成絨氈層和花粉母細胞。絨氈層為雄配子體的發(fā)育提供營養(yǎng)，包括各種酶類和非酶類蛋白質(zhì)，并參與花粉外壁的合成?；ǚ勰讣毎麆t進行減數(shù)分裂，產(chǎn)生四分體。四分體中的單細胞經(jīng)絨氈層分泌胼胝酶的作用分離產(chǎn)生單倍體小孢子體。單倍體小孢子體進一步發(fā)育，到晚期時形成中央大液泡。中央大液泡將細胞核排擠到細胞邊緣(稱為單核靠邊期)，形成細胞極性。這種細胞極性的促進小孢子體進行一次不等有絲分裂，產(chǎn)生一個大的營養(yǎng)核和一個小的生殖細胞。小的生殖細胞被完全包含在大的營養(yǎng)細胞內(nèi)，形成細胞中細胞的特異現(xiàn)象。生殖細胞將進行第二次有絲分裂，產(chǎn)生兩個精細胞，形成成熟的花粉粒。

小米為禾本科的狗尾巴屬草本植物，學名為粟米，是我國北方地區(qū)主要糧食作物之一；同時其作為“五谷”之一，它具備諸多優(yōu)點，例如生育期短，適應(yīng)性廣，耐干旱、耐貧瘠和耐貯存等。小米營養(yǎng)頗豐富，含有人體必需的氨基酸、多種維生素和微量元素，且營養(yǎng)均衡，易被人體消化和吸收，是一種民間養(yǎng)生膳食。隨著人們的生活水平提高，人們對飲食越來越重視，因此小米的制種技術(shù)也逐漸受到青睞，甚至更深一層的研究。

小米的敗育基因為水稻通過基因工程實現(xiàn)不育系轉(zhuǎn)基因植株的獲得，特別是在控制育性和轉(zhuǎn)基因漂移等方面提供了新的選擇，同時亦可應(yīng)用于小米的制種技術(shù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種小米α淀粉酶在導致花粉敗育及制備轉(zhuǎn)基因花粉敗育植株中的應(yīng)用。

為了達到以上目的，本發(fā)明提供的小米α-淀粉酶，其氨基酸序列為：

a)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列；或

b)SEQ ID No.4所示的氨基酸序列經(jīng)替換、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸殘基形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本發(fā)明提供了編碼小米α-淀粉酶的基因，是如下：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在嚴格條件下與SEQ ID NO.1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

4)與1)、2)或3)的核苷酸序列具有80％以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)相同目的能夠容易地鑒定并利用與植物花粉敗育基因α-淀粉酶核苷酸序列互補的DNA分子，因此，具有啟動子活性并在嚴格條件下與本發(fā)明敗育基因α-淀粉酶序列或其片段雜交的分離序列包括在本發(fā)明中。

其中，所述核苷酸序列互補，是指在嚴格條件下能與α-淀粉酶雜交。

嚴格條件是指探針將與其靶序列雜交至可探測程度超過與其它序列雜交(如至少2倍于背景)的條件。嚴格條件具有序列依賴性，且因環(huán)境的不同而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可以鑒定與探針100％互補的靶序列(同源探測)?？蛇x擇地，可以調(diào)節(jié)嚴格條件以允許一些序列錯配，使得探測到較低程度的相似性(異源探測)。通常，探針長度短于大約1000個核苷酸，優(yōu)選地短于500個核苷酸。

典型地，嚴格條件是在pH值7.0-8.3下鹽濃度低于大約1.5M Na離子，典型地大約0.01-1.0M Na離子濃度(或其它鹽類)，溫度對短探針(如10-50個核苷酸)至少大約30℃，對長探針(如超過50個核苷酸)至少大約60℃。通過添加去穩(wěn)定劑如甲酰胺也可獲得嚴格條件。低嚴格條件，例如，包括在30-35％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS(十二烷基磺酸鈉)的緩沖溶液中37℃雜交，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M檸檬酸三鈉)中50-55℃洗滌。中度嚴格條件，例如，包括在40-45％甲酰胺、1.0M NaCl、l％SDS的緩沖溶液中37℃雜交，在0.5×至1×SSC中55-60℃洗滌。高度嚴格條件，例如，包括在50％甲酰胺、1M NaCl、l％SDS的緩沖溶液中37℃雜交，在0.1×SSC中60-65℃洗滌。非必要地，洗滌緩沖液可含有大約0.1％-1％的SDS。雜交時間一般少于大約24小時，通常大約4-12小時。

特別典型地是雜交后洗滌的函數(shù)，關(guān)鍵因素是最終洗滌溶液的離子強度和溫度。對于DNA-DNA雜交體，Tm可以從Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138:267-284的方程估算:Tm＝81.5℃+16.6(logM)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L；其中M是單價陽離子的摩爾濃度，％GC是鳥嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸在DNA中的百分比，％form是甲酰胺在雜交溶液中的百分比，L是雜交體在堿基對中的長度。Tm是50％互補靶序列與完全配對探針雜交的溫度(在規(guī)定的離子強度和pH下)。每1％的錯配需Tm降低大約l℃；因此，Tm雜交和/或洗滌條件可被調(diào)節(jié)以與所需同一性的序列雜交。例如，如果探尋的序列具有≥90％的同一性，Tm可以降低10℃。一般地，選擇的嚴格條件是低于特定序列的熱解鏈溫度(Tm)大約5℃，且其在規(guī)定的離子強度和pH下互補。但是，高度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)1、2、3或4℃的雜交和/或洗滌；中度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)6、7、8、9或10℃的雜交和/或洗滌；低度嚴格條件可以應(yīng)用低于熱解鏈溫度(Tm)11、12、13、14、15或20℃的雜交和/或洗滌。應(yīng)用此方程、雜交和洗滌組合物和所需的Tm，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會理解雜交和/或洗滌溶液的條件隨嚴格度的變化而變化。如果所需的錯配程度使Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，優(yōu)選增加SSC濃度以能夠使用較高的溫度。核酸雜交的指南見于Tijssen(1993)生物化學和分子生物學實驗室技術(shù)一用核酸探針雜交，第I部分，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等人編輯(1995)分子生物學現(xiàn)代方法第2章(Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York)。見Sambrook等人(1989)分子克隆:實驗室手冊(第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Plainview,NewYork)。

所述嚴格條件優(yōu)選為在6×SSC(檸檬酸鈉)、0.5％SDS(十二烷基磺酸鈉)的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜1次。

本發(fā)明提供了含有編碼上述小米α淀粉酶基因的生物材料，其為重組表達載體、表達盒、重組菌或宿主細胞。

本發(fā)明提供的上述生物材料，其還含有轉(zhuǎn)導肽和雄性配子優(yōu)先型啟動子。

進一步地，本發(fā)明提供的表達盒含有SEQ ID No.1-3所示的DNA片段。

其中，SEQ ID No.1所示的序列長度為1332bp的是小米花粉敗育基因α-淀粉酶正向DNA片段；SEQ ID No.2所示的序列長度為216bp的轉(zhuǎn)導肽；SEQ ID No.3所示的序列長度為2732bp的雄性配子優(yōu)先型啟動子PG47。

本發(fā)明含有上述小米α-淀粉酶重組表達載體可通過農(nóng)桿菌介導法、基因槍法、花粉管通道法等常規(guī)生物學方法轉(zhuǎn)化植物細胞或組織獲得獨立的轉(zhuǎn)基因細胞或組織，獲得雄性不育的轉(zhuǎn)基因株系。

本發(fā)明提供了上述小米α-淀粉酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在降解植物花粉中淀粉或擾亂植物花粉發(fā)育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述小米α-淀粉酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在誘導植物雄性不育中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了上述小米α-淀粉酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在制備花粉敗育轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。

所述轉(zhuǎn)基因植物為外源基因在花粉中特異表達的轉(zhuǎn)基因植物，優(yōu)選為授粉/受精能力增強/削弱的轉(zhuǎn)基因植物，更優(yōu)選為雄性不育轉(zhuǎn)基因植物。

本發(fā)明提供了上述小米α-淀粉酶或其編碼基因或含有其編碼基因的生物材料在作物育種中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種降解植物花粉中外源基因擴散的方法，將含有植物α淀粉酶基因的表達盒轉(zhuǎn)化愈傷組織，將轉(zhuǎn)化后的愈傷組織進行誘導分化獲得轉(zhuǎn)基因花粉敗育的轉(zhuǎn)基因植株，使轉(zhuǎn)基因植株花粉無法正常授粉，進而降解植物花粉中外源基因擴散，

所述的植物α淀粉酶基因的核苷酸序列為：

1)SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或

2)在SEQ ID No.1所示的核苷酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且具有同等功能的由1)衍生的核苷酸序列；或

3)在嚴格條件下與SEQ ID NO.1所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列，所述嚴格條件為在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜；或

4)與1)、2)或3)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

所述植物包括而不限于水稻、玉米、高梁、大麥、燕麥、小麥、粟、甘蔗、大豆、蕓苔屬物種、棉花、紅花、煙草、苜蓿和向日葵。

本發(fā)明的有益效果在于：

(1)花粉敗育基因α-淀粉酶分離自小米，對水稻基因工程十分有利，同時作為小米的內(nèi)源基因，對小米的基因工程更是影響巨大。

(2)小米α-淀粉酶花粉粒碘染實驗表明，α-淀粉酶能在啟動子PG47驅(qū)動下，能精確地作用于花藥中花粉粒，使得可育花粉和敗育花粉的比例符合為1:1。

(3)本發(fā)明植物α-淀粉酶基因表達水平精確，可控制轉(zhuǎn)基因擴散；可用于保持雄性不育系的保持和繁殖，同時在雜交制種過程中省去人工去雄步驟，應(yīng)用前景廣闊。

附圖說明

圖1是實施例2中花粉敗育基因小米α-淀粉酶XMAA的重組表達載體DX2182-XMAA構(gòu)建流程圖。

圖2是實施例4中DX2182-XMAA轉(zhuǎn)基因水稻花粉碘染照片。

圖3是實例5中DX2182-XMAA植物重組表達載體的轉(zhuǎn)基因植物潮霉素篩選T1代種子，獲得T2代植株。

具體實施方式

以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)牛員所熟知的常規(guī)手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。

實施例1小米α-淀粉酶基因的獲取

1、小米RNA的提取

利用Biozol Reagent方法提取小米RNA：稱取0.1g小米新鮮幼穗組織1ml Biozol Reagent的比例混勻，室溫靜置5min；按每1ml Biozol Reagent加0.2ml氯仿，用力震蕩15s，待溶液充分乳化后，再室溫靜置5min，12000rmp，4℃離心15min；從離心機中小心取出離心管，吸取上清液轉(zhuǎn)移至另一新的離心管中；向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在室溫下靜置10min,12000rmp，4℃離心10min；棄上清，管壁可現(xiàn)白色沉淀，加0.5ml 75％乙醇(用滅菌后DEPC水配置)洗滌，顛倒混勻，10000rmp，4℃離心5min；重復一次，低溫干燥，使乙醇揮發(fā)；加50ul的Rnase-free水溶解沉淀，置于-80℃保存。

2、獲得小米的cDNA

以小米RNA為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV逆轉(zhuǎn)錄，具體方法如下：

(1)冰上配置

RNA 5-10μl

Olig(dT) 2μl

RNase-free H₂O 至14.5μl

混勻

(2)70℃，5分鐘，立刻置于冰上，打開二級結(jié)構(gòu)。

(3)加入反轉(zhuǎn)錄酶等：

混勻

(4)42℃，延伸90分鐘。70℃，15分鐘。獲得小米的cDNA分裝保存于-40℃。

注：所有實驗用品均為RNase-free。

3.設(shè)計合成克隆α-淀粉酶的引物

通過NCBI數(shù)據(jù)庫獲得小米的α-淀粉酶(XMAA)(LOC101768040)基因的核苷酸序列(如序列表中SEQ ID NO.1所示)，其氨基酸序列(如序列表中SEQ ID NO.4所示)。所述小米α-淀粉酶XMAA核苷酸序列是通過設(shè)計引物序列(如序列表中SEQ IDNO:5-6)從小米的cDNA中克隆獲得。引物設(shè)計使用Gibson Assembly方法，擴增產(chǎn)物插入到DX2182載體MluI和Sac1單酶切位點。擴增α-淀粉酶基因引物對如序列SEQ ID NO:5-6所示。其中上下游引物5’端均有15個左右核苷酸序列與載體相應(yīng)連接位置重復，以便Gibson Assembly連接。擴增體系及程序如下：

PCR程序:預變性94℃3min，變性94℃30s，退火55-65℃40s，延伸68℃1min20s，35個循環(huán)，延伸68℃10min。

實施例2構(gòu)建小米α-淀粉酶的重組表達載體DX2182-XMAA

構(gòu)建流程見圖1，載體DX2182預先構(gòu)建好SEQ ID No.3所示的序列長度為2732bp的雄性配子優(yōu)先型啟動子PG47，和SEQ ID No.2所示的序列長度為216bp的轉(zhuǎn)導肽。將實施例1擴增產(chǎn)物插入DX2182載體Mlu1和Sac1酶切位點，即為雄性配子優(yōu)先型啟動子和轉(zhuǎn)導肽下游。

引物SEQ ID NO:5-6擴增PCR產(chǎn)物1％瓊脂糖凝膠電泳回收1300bp左右產(chǎn)物。Mlu1和Sac1酶切載體DX2182，回收線性酶切載體。

2X連接試劑盒連接敗育基因到DX2182，10ul體系如下：

2.5μ1α-淀粉酶PCR產(chǎn)物(50ng)，2.5μ1酶切載體(100ng)，5μ1 Ligation Mix，連接程序：50℃60分鐘。

轉(zhuǎn)化：取上述連接產(chǎn)物2μ1電擊轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞。挑選陽性克隆測序。命名為DX2182-XMAA。DX2182-XMAA載體含有潮霉素抗性基因，其序列如SEQ ID NO:7所示，可用潮霉素篩選，獲得抗性植株，同時還可以用篩選轉(zhuǎn)基因T0代種子，獲得轉(zhuǎn)基因植株T1代抗性植株。

實施例3轉(zhuǎn)基因水稻植株的獲得

取-70℃保存的農(nóng)桿菌EHA105于含Kan(50μg/ml)+Rif(25μg/ml)+鏈霉素(50μg/ml)平板劃線，28℃培養(yǎng)。挑取單菌落接種于50ml YEB液體培養(yǎng)基中，220rpm 28℃振蕩培養(yǎng)12-16hr。取2ml菌液轉(zhuǎn)接于100ml(含有抗生素)YEP液體培養(yǎng)基中，28℃220rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀＝0.5。冰上預冷10分鐘，5000rpm 10min(冷凍離心機預冷到4℃)。無菌去離子水洗2次(每次10ml)，10％甘油洗1次溶于3ml 10％甘油中。取100μl感受態(tài)細胞加1μl實施例2中得到的DX2182-XMAA質(zhì)粒，2.5KV電擊轉(zhuǎn)化。在含有卡那霉素和利福平的YEP培養(yǎng)板上28℃培養(yǎng)，挑選陽性克隆，用DX2182-XMAA載體特異性引物SEQ ID NO:8-9PCR驗證。

驗證正確的克隆，通過農(nóng)桿菌介導的遺傳轉(zhuǎn)化法侵染水稻中花11(Hiei Y Ohta S,Komari T,Kumashiro T(1994)Efficient transformation of rice(Oryza sativa L.)mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA.The Plant Journal 6:271-282)。經(jīng)共培養(yǎng)、篩選、分化、生根等環(huán)節(jié)獲取T0代轉(zhuǎn)基因幼苗，提取DNA，經(jīng)PCR驗證的轉(zhuǎn)基因陽性植株，自交結(jié)實獲得T1代。取T1植株進行后續(xù)分析。

實施例4轉(zhuǎn)基因水稻碘化鉀染色分析

配制碘化鉀染色液容液(取2g KI溶于5-10mL蒸餾水中，然后加入1g I₂(用適量的無水乙醇溶解)，待全部溶解后，再加蒸餾水定容至300mL。貯于棕色瓶中備用)。對水稻轉(zhuǎn)基因植株的成熟花粉進行鏡檢，對轉(zhuǎn)基因植株的花粉粒育性進行分析，具體方法如下：

1、花粉采集：取充分成熟將要開花的花藥，剝除穎殼，取出花藥。

2.鏡檢：按碘化鉀：去離子水＝1:1的比例稀釋碘化鉀溶液，取70ul的稀釋液置于載玻片，取一花藥置于載玻片上，用鑷子將花藥充分搗碎，使花粉粒釋放，蓋上蓋玻片，于低倍顯微鏡下觀察。凡被染成藍色的花粉粒為可育花粉，呈黃褐色的為敗育的花粉粒。

轉(zhuǎn)基因植株的花粉粒經(jīng)碘化鉀染色分析，花粉粒碘染結(jié)果表明可育花粉：敗育花粉符合1:1的分離比例，即為部分花粉表現(xiàn)為雄性不育(50％)，均有一半(50％)不能染成黑藍色(如圖2右圖所示，50％正常的花粉染色)。而野生型(或其他不攜帶花粉敗育基因的轉(zhuǎn)基因植株)則是完全雄性可育的(如圖2的左圖所示，100％正常的花粉染色)。表明α-淀粉酶花粉敗育基因能在水稻花粉中降解淀粉，因此在花粉粒在發(fā)育過程中，能量供給不足，導致花粉敗育。

由此證明本發(fā)明得到的小米α-淀粉酶基因能夠降解花粉粒中的淀粉，造成水稻轉(zhuǎn)基因花粉不育，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種。

綜上所述，本發(fā)明影響雄性生育力的蛋白質(zhì)小米α-淀粉酶為首次克隆自小米品種α-淀粉酶，并且能夠降解花粉粒中的淀粉，造成水稻轉(zhuǎn)基因花粉不育，準確性高，有效阻止轉(zhuǎn)基因作物通過花粉將轉(zhuǎn)基因元件傳播給其他野生作物品種；可用于保持雄性不育植株的純合隱性狀態(tài)；同時省去了雜交制種過程中去雄的步驟。

實施例5對轉(zhuǎn)基因水稻T1代種子潮霉素篩選

由重組植物表達載體DX2182-XMAA的轉(zhuǎn)基因植株，收獲T1代種子。根據(jù)實施例4中，可育花粉：敗育花粉符合1:1的分離比例，即是一半種子為非轉(zhuǎn)基因種子，一半為轉(zhuǎn)基因種子，因此利用潮霉素進行篩選轉(zhuǎn)基因種子，誘導轉(zhuǎn)基因T2代植株。驗證方案如下：

以非轉(zhuǎn)基因ZH11為對照，在400mg/L潮霉素下，篩選含小米α-淀粉酶XMAA的花粉敗育基因重組載體的T1代種子，分別選取100粒，進行篩選。7d后觀察其發(fā)芽率。結(jié)果表明7d后觀察出芽率，14d后統(tǒng)計其存活率與死亡率＝49:51，基本符合1:1的分離比例(如圖3)。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。

SEQUENCE LISTING

<110> 海南波蓮水稻基因科技有限公司

<120> 小米α-淀粉酶及其編碼基因與應(yīng)用

<130> KHP161117837.7Q

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1332

<212> DNA

<213> 小米

<400> 1

gtccaggcac aggtcctctt ccaggggttt aactgggagt cgtgcaagaa gcagggcagc 60

tggtacaaca gcctcaatgc ccaggtcgac gacatcgcca aggccggcgt cacgcacgtc 120

tggttgcctc caccctcgca ctccgtctca ccccaaggtt acatgcctgg gcgcctctac 180

gacctggacg cgtccaagta cggcacggcc gtggagctca agtccctgat cgcggcgttc 240

caccgcaggg gcatccagtg cgtggcggac attgtcatca accaccggtg cgcggacaag 300

aaggacgcgc gcggcgtcta ctgcatcttc gagggcggga cgcccgacga ccgcctcgac 360

tggggccccg gcatgatatg cagcgacgac acgcagtact cggacggcac gggccaccgc 420

gacaccggcg acgggttcgc ggcggcaccc gacatcgacc acctcaacgc gcgtgtccaa 480

agagagctca tcgactggct caactggctc aagtccgacg tcggctacga cggctggcgc 540

ctcgactttg caaagggcta ctccccagcc atcaccaaga tgtacgtgga gaactcaaag 600

ccgagcttcg tcgtggccga gatatggaac tccctgagct acaacggtga cggaaagccg 660

tcgcccaacc aggaccagtg ccggcaggag ctggtggact gggtgcaggc ggttggcgag 720

ccggcgatgg cgttcgactt caccaccaag gggttgctgc aggcggccgt gcagggcgag 780

ctatggcggc tgcgcgacag ctccggcaag gcggctggct tgattgggtg gacgccggaa 840

aaggcggtca cgttcattga caaccacgac accgggtcga cacagaagat gtggccgttc 900

ccatcagaca aggtcatgca gggctacgcc tacatcctca cccatccagg agtcccctgc 960

atcgtaagcc cttgtttcac cagaatcttc aagttacagc catatttcag atttgtccta 1020

atccatgtac ttgtgtatat catccagttc tacgaccaca tgttcgactt gaacctgaag 1080

caggagatat cgacgctagc agcgatcaga gcccgcaacg gcatccatgc cgggagcaag 1140

cttcgaattc tcctggccga cgccgacgcg tacgtggcca tcgtcgacga gaaggtcatg 1200

gtgaagatcg ggacgaggta cgacgtgggc aacgtgatcc cgtcggactt ccaacccgct 1260

gcgcacggca aggactactg cgtctgggag aaggggagcc tccgcgtccc ggcaggccgg 1320

cacctttagc ac 1332

<210> 2

<211> 216

<212> DNA

<213> 水稻

<400> 2

atgctgtgtc tcacctcctc ttcctcctcc gcgcccgctc cgctccttcc ctctctcgct 60

gatcgaccga gcccgggaat cgcgggcggg ggtggcaatg ttcgcctgag cgtggtttct 120

tcgccgcgcc ggtcgtggcc tggaaaggtc aagaccaatt tctcagttcc tgcgactgcg 180

cgaaaaaaca aaaccatggt gactgttgtg gaggag 216

<210> 3

<211> 2737

<212> DNA

<213> 玉米

<400> 3

gcaccggaca ctgtctggtg gcataccaga cagtccggtg tgccagatca gggcaccctt 60

cggttccttt gctcctttgc ttttgaaccc taactttgat cgtttattgg tttgtgttga 120

acctttatgc acctgtggaa tatataatct agaacaaact agttagtcca atcatttgtg 180

ttgggcattc aaccaccaaa attatttata ggaaaaggtt aaaccttatt tccctttcaa 240

tctccccctt tttggtgatt gatgccaaca caaaccaaag aaaatatata agtgcagaat 300

tgaactagtt tgcataaggt aagtgcatag gttacttaga attaaatcaa tttatacttt 360

tacttgatat gcatggttgc tttcttttat tttaacattt tggaccacat ttgcaccact 420

tgttttgttt tttgcaaatc tttttggaaa ttctttttca aagtcttttg caaatagtca 480

aaggtatatg aataagattg taagaagcat tttcaagatt tgaaatttct ccccctgttt 540

caaatgcttt tcctttgact aaacaaaact ccccctgaat aaaattctcc tcttagcttt 600

caagagggtt ttaaatagat atcaattgga aatatattta gatgctaatt ttgaaaatat 660

accaattgaa aatcaacata ccaatttgaa attaaacata ccaatttaaa aaatttcaaa 720

aagtggtggt gcggtccttt tgctttgggc ttaatatttc tccccctttg gcattaatcg 780

ccaaaaacgg agactttgtg agccatttat actttctccc cattggtaaa tgaaatatga 840

gtgaaagatt ataccaaatt tggacagtga tgcggagtga cggcgaagga taaacgatac 900

cgttagagtg gagtggaagc cttgtcttcg ccgaagactc catttccctt tcaatctacg 960

acttagcata gaaatacact tgaaaacaca ttagtcgtag ccacgaaaga gatatgatca 1020

aaggtataca aatgagctat gtgtgtaatg tttcaatcaa agtttcgaga atcaagaata 1080

tttagctcat tcctaagttt gctaaaggtt ttatcatcta atggtttggt aaagatatcg 1140

actaattgtt ctttggtgct aacataagca atctcgatat cacccctttg ttggtgatcc 1200

ctcaaaaagt gataccgaat gtctatgtgc ttagtgcggc tgtgttcaac gggattatcc 1260

gccatgcaga tagcactctc attgtcacat aggagaggga ctttgctcaa tttgtagcca 1320

tagtccctaa ggttttgcct catccaaagt aattgcacac aacaatgtcc tgcggcaata 1380

tacttggctt cggcggtaga aagagctatt gagttttgtt tctttgaagt ccaagacacc 1440

agggatctcc ctagaaactg acaagtccct gatgtgctct tcctatcaat tttacaccct 1500

gcccaatcgg catctgaata tcctattaaa tcaaaggtgg atcccttggg gtaccaaaga 1560

ccaaatttag gagtgtaaac taaatatctc atgattcttt tcacggccct aaggtgaact 1620

tccttaggat cggcttggaa tcttgcacac atgcatatag aaagcatact atctggtcga 1680

gatgcacata aatagagtaa agatcctatc atcgaccggt ataccttttg gtctacggat 1740

ttacctcccg tgtcgaggtc gagatgccca ttagttccca tgggtgtcct gatgggcttg 1800

gcatccttca ttccaaactt gttgagtatg tcttgaatgt actttgtttg gctgatgaag 1860

gtgccatctt ggagttgctt gacttgaaat cctagaaaat atttcaactt ccccatcata 1920

gacatctcga atttcggaat catgatccta ctaaactctt cacaagtaga tttgttagta 1980

gacccaaata taatatcatc aacataaatt tggcatacaa acaaaacttt tgaaatggtt 2040

ttagtaaaga gagtaggatc ggctttactg actctgaagc cattagtgat aagaaaatct 2100

cttaggcatt cataccatgc tgttggggct tgcttgagcc cataaagcgc ctttgagagt 2160

ttataaacat ggttagggta ctcactatct tcaaagccga gaggttgctc aacatagacc 2220

tattcacccc atttgatcac ttttttggtc cttcaggatc taatagttat gtataattta 2280

gagtctcttg tttaatggcc agatatttct aattaatcta agaatttatg atatttttta 2340

attttttatc atgtctgatg agaattaaca taaaggctca attgggtcct gaattaataa 2400

tagagtgaaa attaatccag aggctctatt agaaccttca attagtaata ccaagatata 2460

tataagatag tagagtatag tttaaatgtt ggcattgttc attctttctt ttgttattta 2520

atttatgctt tccacggtgg ttagtggtta cttctgaagg gtccaaataa tgcatgaaga 2580

gtttgaggac aagaagtctg ccctaaaaat agcgatgcaa aggcatggtg tccaagccat 2640

acatatagcg cactaatttt atcagcagaa caatggtatt tataggtcct agtgcccagg 2700

caacaagaga cacgaataaa gcatcgatca cgacaag 2737

<210> 4

<211> 446

<212> PRT

<213> 小米

<400> 4

Val Gln Ala Gln Val Leu Phe Gln Gly Phe Asn Trp Glu Ser Cys Lys

1 5 10 15

Lys Gln Gly Ser Trp Tyr Asn Ser Leu Asn Ala Gln Val Asp Asp Ile

20 25 30

Ala Lys Ala Gly Val Thr His Val Trp Leu Pro Pro Pro Ser His Ser

35 40 45

Val Ser Pro Gln Gly Tyr Met Pro Gly Arg Leu Tyr Asp Leu Asp Ala

50 55 60

Ser Lys Tyr Gly Thr Ala Val Glu Leu Lys Ser Leu Ile Ala Ala Phe

65 70 75 80

His Arg Arg Gly Ile Gln Cys Val Ala Asp Ile Val Ile Asn His Arg

85 90 95

Cys Ala Asp Lys Lys Asp Ala Arg Gly Val Tyr Cys Ile Phe Glu Gly

100 105 110

Gly Thr Pro Asp Asp Arg Leu Asp Trp Gly Pro Gly Met Ile Cys Ser

115 120 125

Asp Asp Thr Gln Tyr Ser Asp Gly Thr Gly His Arg Asp Thr Gly Asp

130 135 140

Gly Phe Ala Ala Ala Pro Asp Ile Asp His Leu Asn Ala Arg Val Gln

145 150 155 160

Arg Glu Leu Ile Asp Trp Leu Asn Trp Leu Lys Ser Asp Val Gly Tyr

165 170 175

Asp Gly Trp Arg Leu Asp Phe Ala Lys Gly Tyr Ser Pro Ala Ile Thr

180 185 190

Lys Met Tyr Val Glu Asn Ser Lys Pro Ser Phe Val Val Ala Glu Ile

195 200 205

Trp Asn Ser Leu Ser Tyr Asn Gly Asp Gly Lys Pro Ser Pro Asn Gln

210 215 220

Asp Gln Cys Arg Gln Glu Leu Val Asp Trp Val Gln Ala Val Gly Glu

225 230 235 240

Pro Ala Met Ala Phe Asp Phe Thr Thr Lys Gly Leu Leu Gln Ala Ala

245 250 255

Val Gln Gly Glu Leu Trp Arg Leu Arg Asp Ser Ser Gly Lys Ala Ala

260 265 270

Gly Leu Ile Gly Trp Thr Pro Glu Lys Ala Val Thr Phe Ile Asp Asn

275 280 285

His Asp Thr Gly Ser Thr Gln Lys Met Trp Pro Phe Pro Ser Asp Lys

290 295 300

Val Met Gln Gly Tyr Ala Tyr Ile Leu Thr His Pro Gly Val Pro Cys

305 310 315 320

Ile Val Ser Pro Cys Phe Thr Arg Ile Phe Lys Leu Gln Pro Tyr Phe

325 330 335

Arg Phe Val Leu Ile His Val Leu Val Tyr Ile Ile Gln Phe Tyr Asp

340 345 350

His Met Phe Asp Leu Asn Leu Lys Gln Glu Ile Ser Thr Leu Ala Ala

355 360 365

Ile Arg Ala Arg Asn Gly Ile His Ala Gly Ser Lys Leu Arg Ile Leu

370 375 380

Leu Ala Asp Ala Asp Ala Tyr Val Ala Ile Val Asp Glu Lys Val Met

385 390 395 400

Glu Thr Val Lys Ile Gly Thr Arg Tyr Asp Val Gly Asn Val Ile Pro

405 410 415

Ser Asp Phe Gln Pro Ala Ala His Gly Lys Asp Tyr Cys Val Trp Glu

420 425 430

Lys Gly Ser Leu Arg Val Pro Ala Gly Arg His Leu Ser His

435 440 445

<210> 5

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

actgttgtgg aggagatcgt ccaggcacag gtcctc 36

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aggagagttg ttgagctgtg ctaaaggtgc cggcct 36

<210> 7

<211> 810

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gaccttcctc tatataagga agttcatttc atttggagag gacacgctga aatcaccagt 60

ctctctctac aaatctatct ctctcgagct ttcgcagatc cgggggggca atgagatatg 120

aaaaagcctg aactcaccgc gacgtctgtc gagaagtttc tgatcgaaaa gttcgacagc 180

gtctccgacc tgatgcagct ctcggagggc gaagaatctc gtgctttcag cttcgatgta 240

ggagggcgtg gatatgtcct gcgggtaaat agctgcgccg atggtttcta caaagatcgt 300

tatgtttatc ggcactttgc atcggccgcg ctcccgattc cggaagtgct tgacattggg 360

gagtttagcg agagcctgac ctattgcatc tcccgccgtg cacagggtgt cacgttgcaa 420

gacctgcctg aaaccgaact gcccgctgtt ctacaaccgg tcgcggaggc tatggatgcg 480

atcgctgcgg ccgatcttag ccagacgagc gggttcggcc cattcggacc gcaaggaatc 540

ggtcaataca ctacatggcg tgatttcata tgcgcgattg ctgatcccca tgtgtatcac 600

tggcaaactg tgatggacga caccgtcagt gcgtccgtcg cgcaggctct cgatgagctg 660

atgctttggg ccgaggactg ccccgaagtc cggcacctcg tgcacgcgga tttcggctcc 720

aacaatgtcc tgacggacaa tggccgcata acagcggtca ttgactggag cgaggcgatg 780

ttcggggatt cccaatacga ggtcgccaac 810

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggcatggtgt ccaagccata c 21

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ccgaggctgt agccgacgat g 21