本發(fā)明涉及一種蘋(píng)果疏果的高值化利用，具體是一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，屬于功能食品加工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

蘋(píng)果作為蘋(píng)果屬植物的果實(shí)，由于具有豐富的功能性和營(yíng)養(yǎng)性，利于食用和保健，備受消費(fèi)者歡迎。在每年的蘋(píng)果生產(chǎn)過(guò)程中，疏果是蘋(píng)果生產(chǎn)環(huán)節(jié)中為提高果實(shí)品質(zhì)而必須采取的措施，我國(guó)是世界上最大的蘋(píng)果生產(chǎn)國(guó)，疏果產(chǎn)生的幼果數(shù)量很大。蘋(píng)果疏除幼果也具有豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，其中豐富的多糖、多酚、維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等己成為研究蘋(píng)果疏除幼果功能特性的基礎(chǔ)。目前生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的蘋(píng)果疏落果被遺棄在田間，少量以沼氣或者飼喂家禽家畜等方式消化，既污染了自然環(huán)境產(chǎn)生大量的農(nóng)業(yè)垃圾，又造成資源的浪費(fèi)，而且被遺棄的幼果還可以成為病原菌的寄主，加速果樹(shù)病蟲(chóng)害的傳播。

原花青素為蘋(píng)果中主要的酚類(lèi)成分，由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成，按聚合度的不同可分為低聚體和高聚體。蘋(píng)果中的原花青素具有抗氧化、抗腫瘤、保護(hù)心血管系統(tǒng)、抗炎、美容及抗衰老等效果；原花青素的毒理試驗(yàn)表明，原花青素?zé)o致畸變和致突變作用，大鼠、小鼠口服原花青素的LD₅₀均在4000mg/kg以上，屬安全無(wú)毒級(jí)。原花青素以其優(yōu)越的多功能性及安全性，使其在營(yíng)養(yǎng)保健、化妝品、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的應(yīng)用已越來(lái)越引起人們的關(guān)注。

常用的原花青素工業(yè)制備方法為有機(jī)溶劑提取結(jié)合樹(shù)脂純化工藝，此類(lèi)方法提取效果不完善，且操作過(guò)程復(fù)雜、成本較高。

如中國(guó)專(zhuān)利文獻(xiàn)CN106083796A公開(kāi)了一種藍(lán)莓花青素的提取方法，以藍(lán)莓果為原料，破碎打漿，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40％乙醇溶液作為提取液，并加入纖維素酶，在超聲輔助下提取，再經(jīng)離心分離，沉淀重復(fù)浸提一次，合并提取液濃縮后，通過(guò)高壓脈沖電場(chǎng)，促進(jìn)藍(lán)莓花青素的溶出，增加提取液的藍(lán)莓花青素溶出量，再經(jīng)大孔吸附樹(shù)脂吸附，醇洗，濃縮，冷凍干燥，從而得到藍(lán)莓花青素提取方法。操作過(guò)程復(fù)雜，提取率最高至80％，提取效率低。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，工藝流程簡(jiǎn)單，提取率高，高達(dá)90％以上，最大限度的保留了原花青素功能活性成分，原花青素品質(zhì)高，對(duì)清除體內(nèi)自由基、抑制腫瘤細(xì)胞增殖具有較好的活性。

本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

發(fā)明概述：

本發(fā)明的方法以蘋(píng)果疏除幼果為原料，采用雙酶解技術(shù)、蛋白沉淀工藝結(jié)合LH-20凝膠柱層析提取原花青，不僅實(shí)現(xiàn)了蘋(píng)果疏除幼果資源的高效回收再利用，也為開(kāi)發(fā)新的植物提取物資源進(jìn)一步拓寬了思路，具有深遠(yuǎn)的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

發(fā)明詳述：

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，包括步驟如下：

1)提取液的制備：以清洗干凈的蘋(píng)果疏除幼果為原料，加水打成果漿，向果漿中加入復(fù)合植物水解酶和纖維素酶進(jìn)行雙酶酶解，雙酶酶解后得到的酶解液進(jìn)行醇沉，獲得原花青素粗提液；

2)解析液的制備：將步驟1)獲得的原花青素粗提液濃縮至無(wú)醇味，加入粗提液重量8～20倍的水稀釋后，加入明膠使明膠濃度達(dá)到3～8mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)4～8h，反應(yīng)后過(guò)濾，收集沉淀物，沉淀物以水為解析液進(jìn)行攪拌解析，離心，收集上清液，得解析液；

3)精制原花青素：解析液濃縮后，上樣至Sephadex LH-20凝膠層析柱進(jìn)行純化，收集合并在紫外波長(zhǎng)下有吸收的部分，減壓濃縮、真空干燥，得到蘋(píng)果原花青素提取物。

本發(fā)明優(yōu)選的，水的加入量與蘋(píng)果疏除幼果質(zhì)量比為：(8～15)：1。

本發(fā)明優(yōu)選的，復(fù)合植物水解酶和纖維素酶的加入量占果漿總質(zhì)量的0.5％～3.0％，植物復(fù)合水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:1～1:3.5。

進(jìn)一步優(yōu)選的，復(fù)合植物水解酶和纖維素酶的加入量占果漿總質(zhì)量的0.5％～2.0％，植物復(fù)合水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:1.5～1:3，最為優(yōu)選的，復(fù)合植物水解酶和纖維素酶的加入量占果漿總質(zhì)量的1.0％，復(fù)合植物水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:2。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟1)所述的酶解條件為：酶解溫度30～50℃，酶解時(shí)間為80～150min，pH值為4～6。

進(jìn)一步優(yōu)選的，酶解條件為：酶解溫度30～45℃，酶解時(shí)間為100～130min，pH值為4～5，最為優(yōu)選的，酶解溫度40℃，酶解時(shí)間為120min，pH值為4.5。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟1)中醇沉加入乙醇進(jìn)行醇沉，加入乙醇后乙醇最終的質(zhì)量濃度為50％～80％，醇沉?xí)r間8～16h。

進(jìn)一步優(yōu)選的，加入乙醇后乙醇最終的質(zhì)量濃度為60％～70％，最為優(yōu)選的，加入乙醇后乙醇最終的質(zhì)量濃度為60％。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟2)，水的加入量為粗提液重量的10～15倍，加入明膠使明膠濃度達(dá)到4～6.5mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)5～7h；最為優(yōu)選的，水的加入量為粗提液重量的10倍，加入明膠使明膠濃度達(dá)到5mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)6h。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟2)中解析溫度為40～60℃，解析時(shí)間60～120min，離心速度為3000～6000rpm。

進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟2)中解析溫度為40～50℃，解析時(shí)間80～100min，離心速度為4000～5000rpm；最為優(yōu)選的，解析溫度為45℃，解析時(shí)間90min，離心速度為4000rpm。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟3)解析液濃縮至1/10～1/20，濃縮條件：溫度50～60℃，真空度0.1～0.15mbar。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟3)采用無(wú)水乙醇進(jìn)行洗脫雜質(zhì)。

本發(fā)明優(yōu)選的，步驟3)洗脫液收集部分為在紫外波長(zhǎng)為200～400nm有吸收的部分。

進(jìn)一步優(yōu)選的，步驟3)洗脫液收集部分為在紫外波長(zhǎng)為254～365nm有吸收的部分；最為優(yōu)選的，洗脫液收集部分為在紫外波長(zhǎng)為280nm有吸收的部分。

本發(fā)明通過(guò)多酚類(lèi)物質(zhì)與蛋白質(zhì)類(lèi)成分存在絡(luò)合互作的特點(diǎn)，利用明膠對(duì)粗提液進(jìn)行蛋白沉淀，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的量逐漸增加時(shí)，會(huì)慢慢形成多酚-蛋白質(zhì)的交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生沉淀；而當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)的量繼續(xù)增加時(shí)，由于有足夠多的蛋白質(zhì)，多酚的多個(gè)羥基就有足夠的機(jī)會(huì)與其它的蛋白質(zhì)結(jié)合從而使沉淀減少；本發(fā)明分別對(duì)比了膠原、明膠、水解膠原蛋白對(duì)蘋(píng)果原花青素沉淀的影響，意外發(fā)現(xiàn)明膠可以達(dá)到理想的效果，且在明膠濃度達(dá)到3～8mg/mL時(shí)效果最好。解析時(shí)隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更為松散，同時(shí)體系中的多酚和蛋白分子的熱運(yùn)動(dòng)加劇，相互碰撞結(jié)合的機(jī)會(huì)增多，絡(luò)合作用也會(huì)消失，但是，較高溫度下會(huì)引起原花青素的降解，導(dǎo)致收率降低，本發(fā)明通過(guò)明膠對(duì)粗提液進(jìn)行蛋白沉淀，且明膠濃度為3～8mg/mL，解析溫度為40～60℃，大幅度的提高了原花青素的收率。

通過(guò)蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分在功能食品領(lǐng)域中應(yīng)用驗(yàn)證，本發(fā)明的提取的蘋(píng)果幼果原花青素組分對(duì)老齡健康小鼠體內(nèi)的羥自由基具有清除作用，由此判定其具有抗氧化、延緩衰老的功效。細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期試驗(yàn)表明，該活性組分對(duì)MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞株具有較好的抑制效果，可通過(guò)誘導(dǎo)其凋亡達(dá)到減緩腫瘤細(xì)胞增殖的作用。

本發(fā)明的提取的蘋(píng)果幼果原花青素活性組分可直接作為單方或是與其他藥物組分復(fù)配使用，制劑類(lèi)型包括片劑等常規(guī)制劑類(lèi)型。

本發(fā)明所用原料均為現(xiàn)有技術(shù)。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：

1.對(duì)我國(guó)當(dāng)前蘋(píng)果規(guī)模化生產(chǎn)中尚未完全開(kāi)發(fā)的大量落果、疏果資源進(jìn)行高值化加工，提取其中原花青素類(lèi)成分，實(shí)現(xiàn)蘋(píng)果資源的綜合利用，提高其附加值，具有重要經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

2.與現(xiàn)有技術(shù)相比，突破了有機(jī)溶劑提取、樹(shù)脂純化等傳統(tǒng)的加工方法中提取效率不高、有機(jī)試劑殘留、操作復(fù)雜且成本高的局限，通過(guò)酶解技術(shù)、蛋白沉淀工藝結(jié)合凝膠色譜技術(shù)對(duì)蘋(píng)果幼果中原花青素實(shí)施精制，工藝路線(xiàn)設(shè)計(jì)科學(xué)，終產(chǎn)品原花青素含量可達(dá)到90％以上。

3.所得的蘋(píng)果原花青素提取物保存有完好的結(jié)構(gòu)和有效地生物活性，具有良好的抗自由基氧化、延緩衰老的功效，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖。即可作為單方又可與其他藥物組分復(fù)配使用，適用于各種常規(guī)劑型，易于消費(fèi)者接受。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例1提取的方法得到的蘋(píng)果幼果原花青素促M(fèi)DA-MB-231細(xì)胞凋亡情況圖；

圖2為實(shí)施例1提取的方法得到的蘋(píng)果幼果原花青素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞周期影響圖。

具體實(shí)施方式

下面通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但不限于此。

實(shí)施例中使用的復(fù)合植物水解酶為復(fù)合植物水解酶Viscozyme L；

復(fù)合植物水解酶Viscozyme L、纖維素酶均購(gòu)自諾維信(中國(guó))生物技術(shù)有限公司。

實(shí)施例1

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，具體步驟如下：

1)取清洗干凈的蘋(píng)果落果或疏除幼果10Kg，按料水比為1：10的比例加水將其打成勻漿，加入加入占果漿總質(zhì)量的1.0％的植物復(fù)合水解酶和纖維素酶進(jìn)行雙酶酶解，復(fù)合植物水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:2，調(diào)節(jié)pH值為4.5，在溫度40℃酶解120min；酶解液過(guò)濾后加乙醇濃度至60％，醇沉12h，獲得原花青素粗提液。

2)原花青素粗提液減壓濃縮至無(wú)醇味，加入粗提液重量10倍的水稀釋后，加入明膠使明膠濃度達(dá)到5mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)6h，過(guò)濾，收集到的沉淀，加10倍量水混懸，并在45℃下解吸90min，4000rpm離心，收集上清液，得解析液；

3)解析液濃縮后，上樣Sephadex LH-20凝膠層析柱，無(wú)水乙醇洗脫，收集合并280nm有吸收的部分，減壓濃縮、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物68g，其中原花青素含量為93.1％。

實(shí)施例2

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，具體步驟如下：

1)取清洗干凈的蘋(píng)果落果或疏除幼果10Kg，按料水比為1：10的比例加水將其打成勻漿，加入加入占果漿總質(zhì)量的3.0％的植物復(fù)合水解酶和纖維素酶進(jìn)行雙酶酶解，復(fù)合植物水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:3.5，調(diào)節(jié)pH值為6，在溫度50℃酶解90min；酶解液過(guò)濾后加乙醇濃度至75％，醇沉12h，獲得原花青素粗提液。

2)原花青素粗提液減壓濃縮至無(wú)醇味，加入粗提液重量15倍的水稀釋后，加入明膠使明膠濃度達(dá)到3mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)5h，過(guò)濾，收集到的沉淀，加10倍量水混懸，并在60℃下解吸60min，4000rpm離心，收集上清液，得解析液；

3)解析液濃縮后，上樣Sephadex LH-20凝膠層析柱，無(wú)水乙醇洗脫，收集合并365nm有吸收的部分，減壓濃縮、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物63g，其中原花青素含量為91.5％。

實(shí)施例3

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分高效提取方法，具體步驟如下：

1)取清洗干凈的蘋(píng)果落果或疏除幼果10Kg，按料水比為1：10的比例加水將其打成勻漿，加入加入占果漿總質(zhì)量的0.5％的植物復(fù)合水解酶和纖維素酶進(jìn)行雙酶酶解，復(fù)合植物水解酶與纖維素酶的質(zhì)量比為1:1，調(diào)節(jié)pH值為4，在溫度30℃酶解150min；酶解液過(guò)濾后加乙醇濃度至50％，醇沉12h，獲得原花青素粗提液。

2)原花青素粗提液減壓濃縮至無(wú)醇味，加入粗提液重量20倍的水稀釋后，加入明膠使明膠濃度達(dá)到8mg/mL進(jìn)行絡(luò)合反應(yīng)4h，過(guò)濾，收集到的沉淀，加10倍量水混懸，并在40℃下解吸120min，4000rpm離心，收集上清液，得解析液；

3)解析液濃縮后，上樣Sephadex LH-20凝膠層析柱，無(wú)水乙醇洗脫，收集合并254nm有吸收的部分，減壓濃縮、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物66g，其中原花青素含量為92.7％。

對(duì)比例1

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分的提取方法，采用傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑提取-大孔樹(shù)脂純化工藝：

1)取蘋(píng)果落果或疏除幼果10Kg，將其打成勻漿，加入20倍量70％乙醇，60℃提取2次，每次2小時(shí)，收集濃縮液。

2)AB-8樹(shù)脂工藝對(duì)蘋(píng)果幼果原花青素組分進(jìn)行純化，樹(shù)脂洗脫條件為：上樣流速為1.0mL/min，吸附2h；8BV純水、6BV 60％乙醇依次洗脫，洗脫流速為1.0mL/min，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物62g，其中原花青素含量為74.3％。

對(duì)比例2

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分的提取方法，同實(shí)施例1，不同之處在于：

步驟2)采用膠原為沉淀劑，膠原濃度及其他制備步驟同實(shí)施例1，得到粉末形式保存的提取物46g，其中原花青素含量為66.5％。

對(duì)比例3

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分的提取方法，同實(shí)施例1，不同之處在于：

步驟2)采用水解膠原蛋白為沉淀劑，膠原濃度及其他制備步驟同實(shí)施例1，得到粉末形式保存的提取物54g，其中原花青素含量為59.7％。

對(duì)比例4

一種蘋(píng)果疏除幼果原花青素組分的提取方法，步驟如下：

1)取蘋(píng)果落果或疏除幼果10Kg，按1：10比例加水將其打成勻漿，加入1.0％植物復(fù)合水解酶和纖維素酶(1：2)進(jìn)行雙酶解，調(diào)節(jié)pH值為4.5，40℃酶解120min；酶解液過(guò)濾后加乙醇濃度至60％，醇沉12h獲得原花青素提取液。

2)提取液減壓濃縮至無(wú)醇味，加水稀釋10倍后，調(diào)節(jié)明膠濃度至5mg/mL進(jìn)行絡(luò)合，過(guò)濾，收集到的沉淀，加10倍量水混懸，并在45℃下解吸附90min，4000rpm離心收集上清解析液。

3)采用AB-8樹(shù)脂工藝對(duì)蘋(píng)果幼果原花青素組分進(jìn)行純化，樹(shù)脂洗脫條件為：上樣流速為1.0mL/min，吸附2h；8BV純水、6BV 60％乙醇依次洗脫，洗脫流速為1.0mL/min，收集60％乙醇洗脫液，減壓濃縮、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物64g，其中原花青素含量為83.4％。

通過(guò)本發(fā)明實(shí)施例1-3與對(duì)比例1-4對(duì)比可以看出，本發(fā)明的方法得到原花青素含量高達(dá)93.1％，而對(duì)比例的遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于本發(fā)明的，本發(fā)明的方法通過(guò)酶解技術(shù)、蛋白沉淀工藝結(jié)合凝膠色譜技術(shù)，大大提高了蘋(píng)果幼果中原花青素提取率。

應(yīng)用試驗(yàn)例：

對(duì)實(shí)施例1所的原花青素組分進(jìn)行相關(guān)成分及功能活性測(cè)試：

一、原花青素B₁和B₂的含量測(cè)定

1)對(duì)照品溶液配制

精確稱(chēng)取5mg原花青素B₁標(biāo)準(zhǔn)品，置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

精確稱(chēng)取4.5mg原花青素B₂標(biāo)準(zhǔn)品，置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，稀釋成不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2)色譜條件

Apollo C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：A：0.1％磷酸溶液，B：乙腈；梯度洗脫：0～3min(10％B)、3～6min(10％～15％B)、6～8min(15％～20％B)、8～20min(20％B)；UV檢測(cè)波長(zhǎng)280nm；流速1.0mL/min；進(jìn)樣量10uL；

3)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以峰面積Y與樣品的質(zhì)量濃度(X,mg/mL)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

原花青素B₁的回歸方程為：Y＝23860X-1491.2，R＝0.9969；

原花青素B₂的回歸方程為：Y＝36163ln(X)+61862，R＝0.9998

4)樣品含量測(cè)定

稱(chēng)取100mg原花青素提取物于25mL棕色容量瓶中，用70％甲醇定容。供試溶液按2)色譜條件進(jìn)樣，記錄峰面積。外標(biāo)法求得原花青素B₁和B₂含量的平均值分別為11.5％和17.3％，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1原花青素B₁和B₂樣品含量測(cè)定結(jié)果

二、蘋(píng)果幼果原花青素組分小鼠體內(nèi)的羥自由基清除試驗(yàn)：

1)色譜條件

色譜柱：Apollo C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；流動(dòng)相：30mmol/L醋酸鈉：30mmol/L 檸檬酸：甲醇(2:2:1，V/V/V)；pH3.6；流速：1.0mL/min；UV檢測(cè)器：305nm；進(jìn)樣量：20μL。

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

以流動(dòng)相為溶劑配制濃度為2.0、1.5、1.0、0.5、0.1、0.05μg/mL的2,3-DHBA標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)樣20μL，重復(fù)三次取平均值，以檢測(cè)濃度為橫坐標(biāo)，DHBA峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；2,3-DHBA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)y＝3826.4x+0.0157(R＝0.9972)。

3)實(shí)驗(yàn)方法

采用10月齡的老齡健康小鼠，設(shè)原花青素劑量組(20mg/mL)、Vc對(duì)照組(6.0mg/mL)和空白組(蒸餾水)，每組10只，經(jīng)口給予受試物(0.2mL/10g)30d后，按小鼠體重的0.5％尾靜脈注射水楊酸鈉(60mg/mL)捕獲體內(nèi)羥自由基，反應(yīng)60min后頸椎脫臼處死。迅速將處死小鼠置于冰盤(pán)上，取出同一部位肝臟0.6g，于0.1mol/L，6mL高氯酸中勻漿(冰水浴)；4℃，10000rpm離心10min。取上清液，0.22μm濾膜過(guò)濾，經(jīng)HPLC色譜儀和紫外檢測(cè)器分離、檢測(cè)由水楊酸捕獲羥自由基后產(chǎn)生的2,3-二羥基苯甲酸量。

由于個(gè)體差異，水楊酸的分布和濃度可能會(huì)在不同組織間有所差異，因此用2,3-DHBA/水楊酸的比值來(lái)表示對(duì)·OH的清除影響。

4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2.原花青素對(duì)老齡小鼠肝組織中羥自由基的影響

**特別顯著性差異(p＜0.01)

因?yàn)楦闻K是機(jī)體代謝集中的場(chǎng)所，比其他組織更易儲(chǔ)積代謝產(chǎn)物。為保證實(shí)驗(yàn)的靈敏性和顯著性，本次實(shí)驗(yàn)選取肝臟作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物組織。由表1中的結(jié)果可以看出，灌服蘋(píng)果幼果原花青素提取物后可以顯著提高老齡小鼠肝臟內(nèi)DHBA/水楊酸的比值，證實(shí)其具有清除體內(nèi)·OH自由基的功效，可作為抗氧化、延緩衰老的功能食品。

三、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)(MTT法)

1)細(xì)胞處理

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，0.25％胰酶消化，1000rpm離心3min，棄去上清液，加入少量培養(yǎng)液，把沉在底部的細(xì)胞吹打均勻，再用培養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞數(shù)為5×10⁴個(gè)細(xì)胞/mL。

2)實(shí)驗(yàn)方法

取96孔板，每孔加入100μL細(xì)胞懸液，即每孔的細(xì)胞數(shù)為5×10³個(gè)，在37℃、5％CO₂條件下培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度的蘋(píng)果原花青素提取物，終濃度分別為5、10、25、40、80μg/mL，同時(shí)設(shè)定空白對(duì)照組(溶劑組)和陽(yáng)性對(duì)照組(阿霉素組)，再在上述條件下培養(yǎng)24h，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h。去上清，每孔加入100μL DMSO震蕩混勻10min，使結(jié)晶物充分溶解。酶標(biāo)儀490nm處測(cè)定每孔吸光值(OD值)。按照公式：抑制率＝(1-藥物組OD值/對(duì)照組OD值)×100％，計(jì)算抑制率。同等條件下，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3蘋(píng)果幼果原花青素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞增殖抑制作用

蘋(píng)果幼果原花青素作用24h后，可以顯著抑制MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞的增殖，IC₅₀分別為36.6±1.27μg/mL，增殖的抑制作用呈現(xiàn)量效依賴(lài)性。

在上述MTT實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取半數(shù)抑制濃度(IC₅₀)進(jìn)行蘋(píng)果幼果原花青素腫瘤細(xì)胞凋亡和周期實(shí)驗(yàn)。

四、MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞凋亡和周期實(shí)驗(yàn)

1)凋亡實(shí)驗(yàn)

a.胰酶消化獲取細(xì)胞，l500rpm離心5min，棄上清；

b.加入5mL PBS，輕輕震蕩使細(xì)胞懸浮，l500rpm離心5min，重復(fù)2次；

c.將細(xì)胞重懸于500μL Binding Buffer中；

d.加入5μL AnnexinV-FITC，混勻；

e.加入5μL PI，混勻；

f.室溫避光反應(yīng)15min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

2)周期試驗(yàn)

a.胰酶消化，收集細(xì)胞，1500rpm離心5min；

b.加入5mL PBS洗滌細(xì)胞沉淀，重復(fù)2次；

c.500μL 70％冰乙醇重懸細(xì)胞，-20℃固定過(guò)夜；

d.PBS洗去乙醇，1500rpm離心5min；

e.加入100μL RNase A 37℃水浴30min；

f.再加入400μL PI染色液，混勻；

g.室溫下避光孵育10min；流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

觀察細(xì)胞處于細(xì)胞周期各個(gè)時(shí)相(G₀/G₁、S、G₂/M)的細(xì)胞比例。

3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2所示。

測(cè)試濃度下，蘋(píng)果幼果原花青素分別可以誘導(dǎo)47.5％和5.0％的MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)入早期凋亡和晚期凋亡狀態(tài)。與陰性對(duì)照組相比，處于G₀/G₁期的細(xì)胞有一定程度增加，從對(duì)照組的54.96％上升到62.73％，而S期細(xì)胞與G₂/M細(xì)胞出現(xiàn)下降趨勢(shì)；由于大部分細(xì)胞處于早期凋亡狀態(tài)，Sub-G1峰僅為0.58％?？梢缘贸觯ㄇ嗨靥崛∥飳DA-MB-231腫瘤細(xì)胞阻滯在G₀/G₁期，具有誘導(dǎo)其凋亡的效果。