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GLCCI1基因基于Cre?LoxP條件性基因敲除小鼠模型構(gòu)建試劑盒及構(gòu)建方法與流程

文檔序號:12412212閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.GLCCI1基因基于Cre-LoxP條件性基因敲除小鼠模型構(gòu)建試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中包括如下引物對:

5’端篩選引物對:

5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’,5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’;

3’端篩選引物對:

5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’,5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’。

2.如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述試劑盒中還包括如下引物:

5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’;

5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’;

5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’;

5’-GGCTGGACGTAAACTCCTC-3’;

5’-CTGGCAGTTTGTGAGGCATG-3’;

5’-AAGGGTTATTGAATATGATCGGA-3’;

5’-CCCTTGTTTTACATGCGGAGC-3’;

5’-GCTCACAGTCAGCTAATGGATGG-3’。

3.GLCCI1基因基于Cre-LoxP條件性基因敲除小鼠模型構(gòu)建的打靶載體,其特征在于,所述打靶載體的序列如SEQ ID NO.13所示,所述打靶載體命名為Glcci1-final vector。

4.GLCCI1基因基于Cre-LoxP條件性基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法,其特征在于,所述方法包括如下步驟:

(1)構(gòu)建打靶載體Glcci1-final vector;

(2)ES細胞篩選及鑒定;

(3)制備嵌合小鼠;

(4)繁育F1代雜合子小鼠;

(5)獲得GLCCI1-/-純合子小鼠,即為GLCCI1基因基于Cre-LoxP條件性基因敲除小鼠模型。

5.如權(quán)利要求4所述的方法,其特征在于,所述步驟(1)是采用BAC載體構(gòu)建打靶載體Glcci1-final vector,將構(gòu)建好的打靶載體Glcci1-final vector用PCR及ApaL Ⅰ、Bgl Ⅱ、Kpn Ⅰ、Pst Ⅰ酶切鑒定,PCR鑒定的引物為:5’-CTGCTTTGAGGTCTTCATCTGC-3’,5’-CTTACAGTGCCTCCTCATTACC-3’。

6.如權(quán)利要求5所述的方法,其特征在于,所述步驟(2)是將打靶載體Glcci1-final vector采用電沖擊法轉(zhuǎn)到ES細胞中進行打靶,使其發(fā)生同源重組,通過PCR及Southern blot篩選出中靶克隆;其中,用于5’端篩選的PCR反應(yīng)引物對為:5’-CAGTTCCTGCATTAGCCACCAC-3’,5’-CTAGTTGGCTGGACGTAAACT-3’;用于3’端篩選的PCR反應(yīng)引物對為:5’-ACAGGACCTTACCTCACAGG-3’,5’-CTAGAACTAGTGGATCCCCTCGA-3’。

7.如權(quán)利要求6所述的方法,其特征在于,在步驟(3)中,注射用囊胚采用C57BL/6N近交系小鼠,通過超數(shù)排卵,自然受孕,胚胎體內(nèi)發(fā)育至囊胚階段,用于注射;注射后移植入假孕小鼠受體子宮,假孕受體為C57BL/6N與CBA的雜交一代,生育出嵌合率大于50%的嵌合雄鼠。

8.如權(quán)利要求7所述的方法,其特征在于,所述步驟(4)是將獲得的嵌合率高的嵌合雄鼠與野生型C57BL/6N背景雌鼠回交,得到F1代雜合子;經(jīng)提取尾基因組DNA進行PCR反應(yīng)鑒定基因型,根據(jù)電泳結(jié)果判斷野生型、雜合子或純合子。

9.如權(quán)利要求8所述的方法,其特征在于,所述步驟(5)是將獲得的F1代雜合子小鼠與先后與Flper小鼠及野生型C57BL/6N小鼠交配,獲得完全刪去Neo抗性基因的小鼠,再將完全刪去Neo抗性基因的小鼠與全身性敲除cre品系交配獲得全身性敲除GLCCI1的純合子小鼠,即為GLCCI1基因基于Cre-LoxP條件性基因敲除小鼠模型。

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