本發(fā)明屬于生物材料及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用高產(chǎn)酯土著生香酵母提高食醋總酸總酯、還原糖含量的方法。

背景技術(shù)：

中國(guó)不同地區(qū)均擁有各自當(dāng)?shù)氐氖炒最愋?。山西老陳醋是山西省的代表性產(chǎn)品，有3000多年的生產(chǎn)歷史，由于其上好而獨(dú)特的風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)保健功能，被譽(yù)為中國(guó)四大名醋之首。山西老陳醋釀造工藝十分復(fù)雜，被列為國(guó)家非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。其獨(dú)特品質(zhì)也與當(dāng)?shù)氐乃?、氣候、土壤、生態(tài)系統(tǒng)等關(guān)系密切，因?yàn)檫@些因素決定了大曲的品質(zhì)，在山西老陳醋的釀造過程中，大曲既是糖化劑，也是酒化發(fā)酵劑，是決定山西老陳醋產(chǎn)量及品質(zhì)的關(guān)鍵因素，越來越受到研究者關(guān)注。

大曲，又稱磚曲，主要以大麥、豌豆為原料，經(jīng)粉碎加水?dāng)嚢?，踩壓成曲醅，通過自然接種的方法讓各種微生物自然競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)而制成。經(jīng)過長(zhǎng)期的自然馴化及山西老陳醋獨(dú)特工藝條件的驅(qū)使，老陳醋大曲形成了一個(gè)彼此共生、依次消長(zhǎng)和代謝互補(bǔ)的特定微生物群落。酵母菌作為大曲中的主要功能微生物之一，在整個(gè)發(fā)酵階段都起著重要作用，其作用包括酒化、酯化、提供生香前體物質(zhì)及風(fēng)味物質(zhì)等。在釀造過程中起主要作用的有產(chǎn)酒酵母和生香酵母。產(chǎn)酒酵母發(fā)酵糖類生成乙醇，其發(fā)酵力強(qiáng)弱決定山西老陳醋的產(chǎn)量。在食醋生產(chǎn)的酒精發(fā)酵階段，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是起主導(dǎo)作用的優(yōu)勢(shì)酵母菌，占了酵母總數(shù)的95%。盡管生香酵母數(shù)量極少，但可以形成多種芳香物質(zhì)，在很大程度上決定了食醋、酒精飲料及其他發(fā)酵制品的風(fēng)味和品質(zhì)。

生香酵母，又稱產(chǎn)酯酵母，狹義上講是指在酯酶作用下催化酸類與醇類發(fā)生反應(yīng)生成酯類物質(zhì)的酵母菌，廣義上講是指在代謝過程中可以合成芳香氣味物質(zhì)的酵母菌。這些芳香物質(zhì)或特別的風(fēng)味物質(zhì)將對(duì)釀造產(chǎn)品的總體風(fēng)味產(chǎn)生積極影響，使產(chǎn)品的風(fēng)味特征明顯改善，并且酵母菌種屬不同,產(chǎn)生風(fēng)味物質(zhì)的種類和數(shù)量也不同。生香酵母主要屬于漢遜酵母屬、球擬酵母屬、假絲酵母屬、畢赤氏酵母屬、魯氏接合酵母等。生香酵母的潛力近些年來才引起人們的重視并被開發(fā)利用。山西老陳醋的釀造過程有關(guān)生香酵母的研究也很少，還有許多問題亟待解決。

許多研究表明大曲的糖化力和酒化力較低，導(dǎo)致大曲的用量增加，在一定程度上也降低了原料利用率，導(dǎo)致生產(chǎn)成本提高。在山西老陳醋生產(chǎn)過程中，大曲用量約為主料的60%，以曲代粱也是其工藝特點(diǎn)之一?，F(xiàn)今，山西許多醋廠通過添加純種培養(yǎng)的麩曲及活性干酵母來解決此問題，氨基態(tài)氮的含量下降，影響了老陳醋的品質(zhì)。添加的活性干酵母往往是商品化的釀酒酵母和生香酵母，由于這些外源酵母與大曲土著微生物區(qū)系不相容，從而達(dá)不到預(yù)期效果。研究表明，許多酵母菌包括釀酒酵母（S.cerevisiae)和畢赤酵母屬(Pichia spp.)會(huì)產(chǎn)生和分泌胞外致死毒性蛋白（Killer toxin proteins）。產(chǎn)生某種特定毒性蛋白的酵母菌不僅可以殺死許多不產(chǎn)毒性蛋白的酵母類型，還可殺死產(chǎn)生其他毒性蛋白的酵母菌。伴隨山西老陳醋的生產(chǎn)歷史，經(jīng)歷了3000多年的選擇進(jìn)化，大曲微生物彼此互容，形成了穩(wěn)定的區(qū)系和生態(tài)。外源非土著酵母菌的引入會(huì)被大曲棲息微生物抑制甚至殺死，更為糟糕的是，大曲土著微生物甚至?xí)贿@些外源引進(jìn)的酵母所殺死。因此，商品化外源酵母強(qiáng)化大曲自然難以達(dá)到增加產(chǎn)量，改善品質(zhì)的功效，反而有時(shí)它們的引入會(huì)引起醋品質(zhì)的下降。因此，考慮到微生物之間的相容性，從大曲中分離產(chǎn)酯能力高的土著生香酵母，用其強(qiáng)化大曲，在對(duì)大曲糖化、酒化能力不產(chǎn)生負(fù)面影響的前提下，提高其酯化能力，是改善山西老陳醋品質(zhì)的一條可行途徑。此項(xiàng)工作在改良山西老陳醋傳統(tǒng)工藝，促進(jìn)區(qū)域性經(jīng)濟(jì)發(fā)展，開拓地方產(chǎn)品國(guó)際市場(chǎng)方面將起到不可估量的作用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決外源非土著酵母菌強(qiáng)化大曲難以達(dá)到增加產(chǎn)量，改善品質(zhì)之功效，反而會(huì)引起醋品質(zhì)下降的問題，提供了一種利用高產(chǎn)酯土著生香酵母提高食醋總酸總酯、還原糖含量的方法。

本發(fā)明由如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種利用高產(chǎn)酯土著生香酵母強(qiáng)化大曲提高食醋總酸總酯、還原糖含量的方法，包括如下步驟：

（1）高產(chǎn)酯土著生香酵母的分離：采集傳統(tǒng)山西老陳醋工藝發(fā)酵第三天和第六天的酒醅，分別利用孟加拉紅選擇培養(yǎng)基通過10倍遞減梯度稀釋法分離酵母菌，取梯度稀釋樣品液各100uL涂布于孟加拉紅選擇培養(yǎng)基的平板上，28℃倒置培養(yǎng)48h，選擇菌落特征明顯的單菌落在孟加拉紅選擇培養(yǎng)基上進(jìn)一步劃線純化培養(yǎng)2~3次，純化后轉(zhuǎn)入YEPD固體斜面，4℃保存，備用；經(jīng)過了兩批次的分離純化實(shí)驗(yàn)，獲得酵母菌，通過鏡檢、菌落形態(tài)觀察、理化特征檢測(cè)、rRNA基因D1/D2區(qū)序列分析鑒定，以及產(chǎn)酒、產(chǎn)酯性能、環(huán)境耐受性檢測(cè)，最終獲得高產(chǎn)酯土著生香酵母：畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14，乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18；

（2）高產(chǎn)酯土著生香酵母單菌株活化：Y14、Y18分別以2%的接種量接種在YEPD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)20h，將菌懸液用冷卻至室溫的無菌水稀釋至10⁷/ml；

（3）高產(chǎn)酯土著生香酵母菌強(qiáng)化大曲，進(jìn)行醋酸發(fā)酵：采用稀釋至10⁷/ml的高產(chǎn)酯土著生香酵母Y18單一菌株或Y14和Y18的聯(lián)合雙菌株強(qiáng)化大曲，然后進(jìn)行醋酸發(fā)酵，強(qiáng)化時(shí)高產(chǎn)酯土著生香酵母菌菌液的總ml數(shù)等于大曲用量的總g數(shù)，聯(lián)合雙菌株強(qiáng)化時(shí)其中Y14和Y18的用量各占高產(chǎn)酯土著生香酵母菌菌液總ml數(shù)的50%。

所述畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14在麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3天，細(xì)胞球形、卵形，大小為4.6-6.5×3.8-6.5mm.麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)1個(gè)月，菌落奶酪狀，淺白灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊；玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲；rRNA基因D1/D2區(qū)序列檢測(cè)鑒定，測(cè)序引物為：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；26s rDNA D1/D2區(qū)的Genbank序列登錄號(hào)為KP027538；將Y14菌株活化，接種于醋酸鈉產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍鏡觀察子囊孢子的形狀及孢子數(shù)目，Y14可形成子囊孢子，用孔雀綠染色，子囊孢子呈現(xiàn)藍(lán)色、綠色或無色;所述畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14保藏編號(hào)為：CGMCC NO.12407，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期是201６年４月２８日。

所述乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18在麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)3天，細(xì)胞卵形、臘腸形，大小為4.0-7.2×3.0-5.2mm.麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)1個(gè)月，菌落奶酪狀，淺灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊；在玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲；rRNA基因D1/D2區(qū)序列檢測(cè)鑒定，測(cè)序引物為：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G；26s rDNA D1/D2區(qū)Genbank序列登錄號(hào)為KP339953；將Y18菌株活化，接種于醋酸鈉產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)4~5d，利用芽孢染色法染色，高倍鏡觀察子囊孢子的形狀及孢子數(shù)目，Y18不形成子囊和子囊孢子；所述乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18保藏編號(hào)為：CGMCC NO. 12409，保藏單位為中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，保藏日期是201６年４月２８日。

本發(fā)明所述Y14和Y18菌株分離自傳統(tǒng)的山西老陳醋大曲中，經(jīng)中科院微生物研究所鑒定為：Pichia manshurica（Y14）和Candida ethanolica（乙醇假絲酵母，Y18）。

參考文獻(xiàn)（Bhaskar B., Zareena B.,Sisinthy S.,2008.Pichia garciniaesp.nov.,isolated from a rotten mangosteen fruit (Garcinia mangostana L., Clusiaceae).International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology.58,2665–2669.）；（Heide-Marie Daniel, Gino Vrancken, Jemmy F. Takrama,Nicholas Camu, Paul De Vos, Luc De Vuyst, 2009.Yeast diversity of Ghanaian cocoa bean heap fermentations. FEMS Yeast Res.9,774–783.）與已報(bào)道的上述文獻(xiàn)對(duì)比，Y14和Y18雖然分別鑒定為Pichia manshurica 和 Candida ethanolica,在許多生理特性上與報(bào)道的同種酵母表現(xiàn)不同，P. manshurica NRRL Y-27978^T (Bhaskar Bhadra, et al. 2008)不能同化硝酸鹽和亞硝酸鹽，水解尿素和發(fā)酵D-葡萄糖，而Y14具有上述能力。從發(fā)酵可可豆中分離出的Pichia manshurica(Heide-Marie Daniel, et al. 2009)可以同化蔗糖，而Y14不能；這些差異可被認(rèn)為是種內(nèi)株間差異。

由于Y14和Y18菌株分離自傳統(tǒng)的山西老陳醋大曲中，在發(fā)酵實(shí)踐中經(jīng)歷了長(zhǎng)達(dá)3000年的選擇和進(jìn)化，必然表現(xiàn)出能適應(yīng)山西食醋釀造所用的各種原輔料及發(fā)酵環(huán)境的相應(yīng)特性，菌種具有獨(dú)特性。經(jīng)研究表明，其產(chǎn)酯能力甚至極顯著地高于商品化的安琪生香酵母，表現(xiàn)出極強(qiáng)的耐高溫、耐酸、耐乙醇、耐高滲性能；更為重要的是用大曲土著微生物強(qiáng)化大曲，克服了在釀造過程中菌種不相容的問題，如果使用外源的商品化的非大曲微生物強(qiáng)化大曲，不僅收不到應(yīng)有的效果，甚至?xí)?yán)重影響醋的品質(zhì)。在實(shí)際生產(chǎn)中，按本發(fā)明所述方法強(qiáng)化大曲，無論是Y14+Y18雙菌種強(qiáng)化，還是Y18單菌種強(qiáng)化，均可極顯著地提高醋液中的總酸、總酯及還原糖含量，并且不對(duì)醋的其他兩項(xiàng)指標(biāo)即不揮發(fā)酸和氨基態(tài)氮產(chǎn)生影響。

附圖說明

圖1為Y14（Pichia manshurica）麥芽汁液體培養(yǎng)3天后菌體形態(tài)觀察結(jié)果圖；圖2為Y18（Candida ethanolica）麥芽汁液體培養(yǎng)3天后菌體形態(tài)觀察結(jié)果圖；圖3為Y2（Candida ethanolica）麥芽汁液體培養(yǎng)3天后菌體形態(tài)觀察結(jié)果圖；圖4為Y2和Y18（Candida ethanolica）經(jīng)小室培養(yǎng)形成的假菌絲；圖5為Y14（Pichia manshurica）形成的子囊以及子囊孢子顯微圖；圖6為分離自山西老陳醋大曲中的各株酵母菌的產(chǎn)酯量結(jié)果圖；圖7-圖10為畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14和乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2、Y18的相關(guān)環(huán)境耐受性分析結(jié)果圖。圖11為畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14和乙醇假絲酵母(Candida ethonolic)Y2、Y18強(qiáng)化大曲后酒精發(fā)酵液的酒精度測(cè)定結(jié)果圖；圖12為Y2強(qiáng)化酒精發(fā)酵液的HS-GC-MS 6-40min離子圖；圖13為菌株Y14強(qiáng)化酒精發(fā)酵液的的HS-GC-MS 6-40min的離子圖；圖14為菌株Y18強(qiáng)化酒精發(fā)酵液的的HS-GC-MS 6-40min的離子圖；圖15為對(duì)照大曲酒精發(fā)酵液的的HS-GC-MS 6-40min的離子圖。

具體實(shí)施方式

一種利用高產(chǎn)酯土著生香酵母提高食醋總酸總酯、還原糖含量的方法，包括如下步驟：

1.高產(chǎn)酯土著生香酵母的分離：采集傳統(tǒng)山西老陳醋工藝發(fā)酵第三天和第六天的酒醅，分別利用孟加拉紅選擇培養(yǎng)基通過10倍遞減梯度稀釋法分離其中的酵母菌，取梯度稀釋樣品液各100uL涂布于孟加拉紅選擇培養(yǎng)基的平板上，28℃倒置培養(yǎng)48h，選擇菌落特征明顯的單菌落在孟加拉紅選擇培養(yǎng)基上進(jìn)一步劃線純化培養(yǎng)2~3次，純化后轉(zhuǎn)入YEPD固體斜面，4℃保存，備用；結(jié)果表明：第三天的樣品，平板上布滿了霉菌菌絲，同時(shí)還可看到大量的酵母菌菌落，但這些酵母菌的菌落特征極為相似；

經(jīng)過了兩批次的分離純化實(shí)驗(yàn)，獲得15株酵母菌，所得到的酵母菌通過菌落形態(tài)觀察及鏡檢最后保留并合并為6株；第六天的樣品，平板上完全沒有霉菌，并且酵母菌數(shù)量激增，且種類較第3天的樣品更為豐富；第三天樣品中大量存在的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)酵母菌在第六天的樣品中同樣處于優(yōu)勢(shì)地位；經(jīng)過了兩批次的試驗(yàn)，分離純化了研究了29株酵母菌，最后保留并合并為19株，分別編號(hào)為Y1~Y19；通過理化特征檢測(cè)、rRNA基因D1/D2區(qū)序列檢測(cè)鑒定，以及產(chǎn)酒、產(chǎn)酯性能、環(huán)境耐受性檢測(cè)，最終獲得高產(chǎn)酯土著生香酵母，根據(jù)各菌株的培養(yǎng)特征、細(xì)胞顯微形態(tài)特征、生理生化特征以及26s rRNA D1/D2區(qū)序列等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)綜合分析，經(jīng)中科院微生物研究所鑒定為：畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14，乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2和Y18；

1.1畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14的鑒定：

（1）畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14顯微形態(tài)特征：

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，顯微形態(tài)見圖1，細(xì)胞球形、卵形，大小為（4.6-6.5）×（3.8-6.5）mm。麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)1個(gè)月，菌落奶酪狀，淺白灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲。

（2）畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14生理生化檢測(cè)結(jié)果見表1：

表1：Y14（Pichia manshurica）理化特征

（3）畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14的rRNA 基因D1/D2區(qū)序列測(cè)定結(jié)果

測(cè)序引物為：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G。 測(cè)定結(jié)果如下：Genbank序列登錄號(hào)為KP027538，其堿基序列如SEQ ID NO：1所示，即：

5￠-AAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTAGGGTGCTGCGCGAAGCTTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCCAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCTCGACATGGGGGGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCCCTCTGGGCCAGCATCGGTTCCTGCTGCGGGAGAAGGGGCTCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGGGCCAGATGCCGCGTGTGGGGACCGAGGACTGCGGCTTCTGTCTCGGATGCTGGCATAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGAA-3￠。

1.2乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18的鑒定：

（1）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18顯微形態(tài)特征：

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，顯微形態(tài)見圖2，細(xì)胞卵形、臘腸形，大小為（4.0-7.2）×（3.0-5.2）mm。麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)1個(gè)月，菌落奶酪狀，淺灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲。

（2）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18生理生化檢測(cè)結(jié)果見表2：

表2:Y18（Candida ethanolica）理化特征

（3）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y18的rRNA 基因D1/D2區(qū)序列測(cè)定：

測(cè)序引物為：NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG；NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G。 測(cè)定結(jié)果如下：Genbank序列登錄號(hào)為KP339953，其堿基序列如SEQ ID NO：2所示，即：

5￠-AAGCGGCAAGAGCTCAGATTTGAAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCTGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGCTGCGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCCCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCGAGAGAAGTGGCGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGTGCCGGATGTCGCGTGCGGGGACCGAGGGCTGCGACATCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGA-3￠。

1.3乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2的鑒定：

（1）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2顯微形態(tài)特征：

麥芽汁液體培養(yǎng)基中25℃培養(yǎng)三天，顯微形態(tài)見圖3，細(xì)胞卵形、臘腸形，大小為（4.5-12）×（3.8-5.5）mm.，麥芽汁瓊脂斜面25℃培養(yǎng)1個(gè)月，菌落奶酪狀，淺灰色，表面平滑，不反光，邊緣整齊。玉米粉瓊脂Dalmau平板培養(yǎng)，不產(chǎn)生假菌絲。與Y18基本相同，只是菌體比Y18要長(zhǎng)。

（2）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2生理生化檢測(cè)結(jié)果見表3：

由表2和表3可知，Y2與Y18的不同之處是Y18可以同化甘油，而Y2不能。

表3 Y2（Pichia manshurica）理化特征

（3）乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2的26s rRNA 基因D1/D2區(qū)序列測(cè)定：

引物 D1D2區(qū)擴(kuò)增引物為 NL1: GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG和NL4：GGT CCG TGT TTC AAG ACG G。ITS擴(kuò)增引物為:ITS4：TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC和ITS5：GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG C。

Y2（Candida ethanolica）26s rDNA D1D2 區(qū)序列如SEQ ID NO：3所示，即：

5￠-AAATCGTGTTTCGGCACGAGTTGTAGAGTGTAGGCGGGAGTCTCTGTGGAGCGCGGTGTCCAAGTCCCTTGGAACAGGGTGCCTGAGAGGGTGAGAGCCCCGTGGGGTGCTGCGCGAAGCTTTGAGGCCCTGCTGACGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTCTAAGCGGGTGGTAAATTCCATCTAAGGCTAAATACTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACTGTGAAGGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGAGTGAAACAGCACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGTATTGGGCCCGACATGGGGAGTGCGCACCGCTGTCTCTTGTAGGCGGCGCTCTGGGCGCTCTCTGGGCCAGCATCGGTTCTTGCTGCGAGAGAAGTGGCGCCGGAAAGTGGCTCTTCGGAGTGTTATAGCCGGTGCCGGATGTCGCGTGCGGGGACCGAGGGCTGCGACATCTGTCTCGGATGCTGGCACAACGGCGCAATACCGCCCGTCTTGAACC-3￠。

Y2（Candida ethanolica）26s rDNA ITS 序列如SEQ ID NO：4所示，即：

5￠-ATCTGAGGTCGAGCTCATAGTGCTCGGAGACCCCAAGCGTCCTGTTCTAGTTCGCTCGTGGCCTCGTTTCTTTTCGGCGGGGCCGTGGCCGGGCCAGCTCTGCGCAACTCTCGTCTTGCAAGAAGGAAACGACGCTCAGACAGGCATGCCCGCCGGAATGCCGACGGGCGCAATGTGCGTTCAAGAACTCGATGATTCACGATGGCTGCAATTCACACTAGGTATCGCATTTCGCTGCGCTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTTTGTGTTAAAATAAAAACTCCTGAACTAGTATACGTGTTTGTGTGTTGTGTGCGCTCACGCAGTGTGGAACAATAATCACAGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGAAACCTTGTTACGACtTTTTTACTTCCA-3￠。

1.4假菌絲形態(tài)觀察以及子囊孢子形態(tài)觀察：

有些酵母菌繁殖時(shí)形成假菌絲，若用接種環(huán)挑取使菌絲斷裂，無法看到假菌絲的完整形態(tài)，因此采用小室培養(yǎng)為酵母菌生長(zhǎng)繁殖提供一個(gè)相對(duì)獨(dú)立的環(huán)境，以便隨時(shí)觀察酵母菌假菌絲形成情況。Y2和Y18（Candida ethanolica）經(jīng)小室培養(yǎng)形成的假菌絲見圖4；將待觀察菌株活化，接種于醋酸鈉產(chǎn)孢培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)4~5d，利用芽孢染色法染色，于高倍鏡下觀察子囊孢子的形狀及孢子數(shù)目。結(jié)果表明乙醇假絲酵母Y2和Y18不形成子囊和子囊孢子。Y14雖可形成子囊孢子，見圖5，但用孔雀綠染色時(shí)很不容易染色，子囊孢子呈現(xiàn)藍(lán)色、綠色或無色。

1.5畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14和乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2/Y18的產(chǎn)酒與產(chǎn)酯性能檢測(cè)：

（1）產(chǎn)酒性能：采用YEPD培養(yǎng)基杜氏管產(chǎn)氣試驗(yàn)，結(jié)果表明，Y14（Pichia manshurica）和Y2/Y18（Candida ethanolica）分別培養(yǎng)48h菌株仍無產(chǎn)氣現(xiàn)象，說明其發(fā)酵能力較弱。而發(fā)酵力強(qiáng)的菌株培養(yǎng)12h便開始產(chǎn)氣。

（2）產(chǎn)酯性能：將山西老陳醋大曲中分離的19株酵母菌（Y1~Y19），對(duì)照菌株為Y20（安琪高活性釀酒干酵母）及Y21（安琪生香干酵母）在YEPD培養(yǎng)基中活化，以3%的接種量接入含有80ml產(chǎn)酯發(fā)酵液的150mL三角瓶中，28℃靜置培養(yǎng)7d，按GB19777-2005規(guī)定的堿夜皂化法測(cè)定測(cè)定發(fā)酵液中總酯含量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖6。與對(duì)照安琪生香干酵母Y21相比，菌株Y2、Y5、Y6、Y9、Y10、Y11、Y12、Y13、Y14、Y15、Y18產(chǎn)酯能力較強(qiáng)，其余菌株產(chǎn)酯能力較弱。產(chǎn)酯能力最高的三株菌為Y14、Y2和Y18，其產(chǎn)酯量分別為36.05g/L、33.75g/L、33.47g/L。差異顯著性分析結(jié)果見表4，11株高產(chǎn)酯酵母產(chǎn)酯量均極顯著地高于安琪生香酵母，但Y2與Y18差異不顯著。

表4：酵母菌產(chǎn)酯量差異性分析

1.6畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14和乙醇假絲酵母(Candida ethanolica)Y2/Y18的相關(guān)環(huán)境耐受性分析：酵母菌的性能分析主要包括酵母菌對(duì)溫度、pH、酒精度、糖度等因素的耐受性，接種活化酵母菌菌懸液0.3mL于含10 mL YEPD培養(yǎng)基試管中,除耐高溫測(cè)定，均在30℃培養(yǎng)3d，將培養(yǎng)液4000r/min離心10min，倒掉上清液，測(cè)菌體濕重。結(jié)果見圖7-圖10。

從圖中可以看出，在溫度高達(dá)40℃時(shí)Y14和Y18依然生長(zhǎng)良好，但隨著溫度繼續(xù)升高，在50℃時(shí)，其生長(zhǎng)明顯受到抑制，可能由于溫度升高至一定程度時(shí)酶活力受到抑制，使細(xì)胞新陳代謝減弱，菌體生長(zhǎng)緩慢，而Y2在40℃雖然還有生長(zhǎng)現(xiàn)象，但生長(zhǎng)情況不及Y14和Y18。酵母菌在相對(duì)低的溫度下生長(zhǎng)較強(qiáng)，這與山西老陳醋實(shí)際生產(chǎn)中低溫酒精發(fā)酵環(huán)境的長(zhǎng)期馴化有著直接的關(guān)系。Y14和Y18這兩株產(chǎn)酯酵母在35℃、40℃的溫度下依然可以生長(zhǎng)，則可以在醋酸發(fā)酵階段繼續(xù)作用生成香氣成分，進(jìn)而提高醋的品質(zhì)。

當(dāng)pH由起始值4降低到2時(shí)，Y18的生長(zhǎng)量反而增加，Y2和Y14的生長(zhǎng)量?jī)H略有減少，但pH1.5時(shí)，菌體的生長(zhǎng)大受抑制。這些產(chǎn)酯酵母可耐受醋酸發(fā)酵過程中酸性環(huán)境，則可利用醋酸發(fā)酵形成的多種有機(jī)酸生成更多的酯類物質(zhì)，改善醋的風(fēng)味，從而提高醋的品質(zhì)。

在所有分離的酵母菌菌株中，Y18的耐乙醇能力最強(qiáng)。pH對(duì)Y2和Y14生長(zhǎng)的影響趨勢(shì)基本相同。3菌株在乙醇濃度8%時(shí)生長(zhǎng)很旺盛，并且均可耐受10%的乙醇濃度，12%的乙醇濃度使生長(zhǎng)完全抑制。

40%的糖濃度對(duì)Y14和Y18的生長(zhǎng)毫無影響，兩菌株在50%時(shí)生長(zhǎng)受到抑制，但Y14在60%時(shí)，依然保持50%時(shí)的生長(zhǎng)量，Y18則迅速降低。而超過30%的糖濃度顯著抑制Y2菌株的生長(zhǎng)。

研究表明，生理耐性優(yōu)良的酵母菌在實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)提高原料利用率、降低生產(chǎn)成本，提高產(chǎn)品的風(fēng)味等都有極佳的效果。優(yōu)良酵母菌通常具備以下生理耐性：

耐高溫：傳統(tǒng)菌種的最適發(fā)酵溫度一般為28~35℃，當(dāng)環(huán)境溫度逐漸升高時(shí)，其發(fā)酵能力隨之減弱。耐高溫酵母菌在較高溫度下可正常發(fā)酵，其合成酶活性比適溫酵母菌的酶活更高。在食醋生產(chǎn)中，原料的糖化需高溫進(jìn)行，如果酵母菌耐高溫，則可以邊糖化邊發(fā)酵，加快生產(chǎn)速度，縮短發(fā)酵周期。

耐乙醇：雖然乙醇是酵母菌厭氧發(fā)酵的產(chǎn)物，但其濃度積累到一定程度對(duì)其自身具有抑制作用。在酒精發(fā)酵后期，發(fā)酵醪液中酒精濃度較高，若酵母菌耐乙醇能力較弱，其發(fā)酵活力就會(huì)受到嚴(yán)重影響，導(dǎo)致原料中的發(fā)酵性糖無法轉(zhuǎn)化成酒精，從而降低出酒率。耐乙醇性能好的酵母則可以發(fā)酵徹底，提高原料利用率，增加出品率。

耐酸性：山西老陳醋在酒精發(fā)酵結(jié)束轉(zhuǎn)醋酸發(fā)酵的過程中要添加輔料，醋醅中會(huì)產(chǎn)生一些新增還原糖，在醋醅的酸度還沒有顯著提高的情況下，若酵母菌有一定的耐酸性，新增的還原糖就可被利用生成一定量的酒精和酯類物質(zhì)，從而增加食醋的產(chǎn)量和香氣成分。

耐高糖：酒精發(fā)酵過程中發(fā)酵醪的糖度過高，則會(huì)引起細(xì)胞失水，破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致體內(nèi)酶活喪失，從而抑制其生長(zhǎng)和發(fā)酵。因此，具有一定的耐高滲能力是良好發(fā)酵性能酵母菌所必備的性能。

Y2和Y18盡管均被鑒定為乙醇假絲酵母，但在環(huán)境耐受性表型卻明顯不同,Y2明顯不耐高溫以及高糖環(huán)境。綜合各菌株的環(huán)境耐受性能可知，這三個(gè)菌株都可耐受醋實(shí)際生產(chǎn)發(fā)酵過程中的各種環(huán)境，也就意味它們可以在山西老陳醋整個(gè)發(fā)酵過程中發(fā)揮作用，將進(jìn)一步促進(jìn)雙邊乃至多邊發(fā)酵工藝，縮短發(fā)酵周期。研究理論表明，發(fā)酵過程中有機(jī)酸的存在與相應(yīng)的酯類生成有直接的關(guān)系，因此產(chǎn)酯酵母在醋酸發(fā)酵階段繼續(xù)作用，不僅可以提高酯的含量，還可豐富酯類物質(zhì)的種類，從而改善醋的風(fēng)味，提高醋的品質(zhì)。

2.高產(chǎn)酯土著生香酵母單菌株活化：Y14、Y18分別以2%的接種量接種在YEPD培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)20h,將菌種用冷卻至室溫的無菌水稀釋至10⁷/ml；

3.1高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化酒精發(fā)酵酒度測(cè)定結(jié)果：

Y2、Y14、Y18三株高產(chǎn)酯酵母菌分別與大曲共同酒精發(fā)酵，發(fā)酵液酒精度測(cè)定結(jié)果如圖11所示，酒精度依次分別為：Y2（9.65%）>Y14（9.59%）>Y18（9.51%）,而未經(jīng)強(qiáng)化的對(duì)照組其酒精度為9.42%，由此可見3株高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化發(fā)酵在一定程度上提高了發(fā)酵液的酒度。差異顯著性分析結(jié)果表明，三株高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化與對(duì)照相比以及三株高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化組之間差異均為極顯著，表明高產(chǎn)酯酵母與大曲共發(fā)酵使產(chǎn)酒量顯著提高。

3.2酒精發(fā)酵液香氣感官評(píng)價(jià)：

選10名受過食品感官評(píng)價(jià)訓(xùn)練的評(píng)價(jià)員（本專業(yè)研究生和老師組成）對(duì)高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化酒精發(fā)酵液的香氣評(píng)價(jià)結(jié)果如表6所示。通過感官評(píng)價(jià)分析，強(qiáng)化發(fā)酵液與大曲發(fā)酵液相比，香氣宜人。

表5:高產(chǎn)酯酵母強(qiáng)化酒精發(fā)酵液香氣感官評(píng)價(jià)

3.3發(fā)酵液中揮發(fā)性香氣成分的測(cè)定：高產(chǎn)酯酵母與大曲共同酒精發(fā)酵，利用HS-GC-MS對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)發(fā)酵液中的主要揮發(fā)性香氣成分。將重復(fù)三次的發(fā)酵液混合均勻，4℃ 4000r/min冷凍離心15min，留取上清液，混勻取樣10ml置于20ml頂空進(jìn)樣瓶中，加3g NaCl溶解，采用頂空自動(dòng)進(jìn)樣，通過GC-MS測(cè)定發(fā)酵液中香氣成分。HS-GC-MS測(cè)定條件如下：

1）頂空進(jìn)樣器條件：振蕩溫度70℃，振蕩時(shí)間30min，進(jìn)樣量2ml。

2）GC分析條件：色譜柱為TR-5MS（30m×0.25mm，0.25um）。進(jìn)樣口溫度250℃，載氣He，流速1mL/min。進(jìn)樣量2μL，不分流進(jìn)樣。升溫程序：起始溫度35℃，保持8min，以5℃/min的速度升溫至230℃，保持5min。

3）MS條件：電子轟擊（EI）離子源，電子能量70eV，離子源溫度250℃，傳輸線溫度280℃，質(zhì)量掃描范圍m/z：30～350。

檢測(cè)結(jié)果見圖12-15，如圖所示，四個(gè)樣品總離子流圖大致相同，主要是因?yàn)楦弋a(chǎn)酯酵母源自大曲且又與大曲共發(fā)酵，強(qiáng)化發(fā)酵液中的主要成分種類相同，且發(fā)酵液中乙醇含量較高，導(dǎo)致其他峰較弱；由6~40min的離子流圖可以看出發(fā)酵液中微量成分的峰，物質(zhì)種類基本相同，但其在個(gè)發(fā)酵液中所占組分各不相同。

發(fā)酵液中酯類成分的GC-MS分析結(jié)果見表6。

表6：發(fā)酵液中酯類成分的GC-MS分析結(jié)果

由表6可以看出：Y2菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出34種物質(zhì)，其中醇類6種，占面積的62.12%；酯類18種，占面積的18.75%；醛類7種，占面積的0.43%；酮類1種，占面積的0.01%；醚類1種，占面積的2.3%；呋喃1種，占面積的0.155%；其它化合物占面積的18.7%。

Y14菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出34種物質(zhì)，其中醇類6種，占面積的63.48%；酯類16種，占面積的26.12%；醛類9種，占面積的0.48%；酮類1種，占面積的0.004%、醚類1種，占面積的2.86%；呋喃1 種，占面積的0.140%；其他化合物占面積的9.92%。

Y18菌株發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出33種物質(zhì)，其中醇類7種，占面積的61.85%；酯類18種，占面積的18.31%；醛類7種，占面積的0.74%；呋喃1種，占面積的0.208%；其他化合物占面積的19.1%。

原大曲發(fā)酵液中的揮發(fā)性香氣成分經(jīng)質(zhì)譜分析出28種物質(zhì)，其中醇類5種，占面積的60.74%；酯類15種，占面積的12.92%；醛類7種，占面積的0.62%；呋喃1種，占面積的0.168%；其他化合物占面積的25.72%。上述其他化合物主要包括烴類、含氮化合物等。

三株菌的發(fā)酵液與對(duì)照相比分別多出8、7、6種物質(zhì)，但這些物質(zhì)都是微量。主要的揮發(fā)性香氣成分種類基本相同，醇類主要有乙醇、異戊醇等，酯類主要包括乙酸乙酯、己酸乙酯、棕櫚酸乙酯等，主要成分種類基本相同可能是因?yàn)檫@三高產(chǎn)酯的株菌均源自于大曲，同時(shí)與大曲共發(fā)酵。

雜醇油是三個(gè)碳以上的一元醇類物質(zhì)的總稱，盡管具有呈香作用，但白酒中如果雜醇油含量過高，對(duì)人體有毒窖作用，它對(duì)人體的中毒和麻醉作用比乙醇強(qiáng)，能使神經(jīng)系統(tǒng)充血，使人感覺頭痛。雜醇油的主要成份中以異戊醇、異丁醇毒性比較高，不僅對(duì)人體有害，而且還給酒的風(fēng)味帶來邪雜昧。雜醇油是中國(guó)白酒苦味或澀味的主要來源之一，同時(shí)雜醇油也是造成我國(guó)白酒出現(xiàn)白色渾濁的原因之一。白酒中雜醇油含量最大的是異戊醇、異丁醇、正丙醇等。異戊醇通常是雜醇油中含量最多，研究的也最多的一種成份，一般要占雜醇油總量的45％以上，甚至高達(dá)65％以上。當(dāng)飲料酒中異戊醇含量過高時(shí)，可刺激飲用者的眼睛和呼吸道，使人頭部充血、頭疼、眩暈、惡心、嘔吐、腹瀉，是導(dǎo)致人醉酒上頭的主要原因之一。國(guó)標(biāo)規(guī)定，白酒中的雜醇油含量不得超過0.20g/100ml(以異丁醇，異戊醇計(jì))。本研究通過Y2、Y14、Y18強(qiáng)化大曲，使酒精發(fā)酵液中的乙醇含量顯著增加，異戊醇的含量顯著降低。

由表還可知，Y2、Y14、Y18強(qiáng)化大曲發(fā)酵液中的乙醇和乙酸乙酯的含量顯著高于大曲單獨(dú)發(fā)酵，且含量最多的雜醇油，即異戊醇的含量也顯著降低。酯類中除丁酸乙酯和乙酸異丁酯外，其他酯類含量均有不同程度的提高。主體酯類成分中，與其它菌種強(qiáng)化發(fā)酵液及對(duì)照相比，Y14強(qiáng)化大曲發(fā)酵液中的乙酸乙酯含量最多，至少是對(duì)照的2.3倍；Y18發(fā)酵液中的乙酸異戊酯和正己酸乙酯的含量最多，分別至少為對(duì)照的1.48倍和1.15倍，而Y2強(qiáng)化大曲發(fā)酵液中的辛酸乙酯和乙酸異戊酯含量最多。由此可見，不同菌株強(qiáng)化大曲進(jìn)行發(fā)酵，酒精發(fā)酵液中的各種風(fēng)味物質(zhì)在總風(fēng)味物質(zhì)的比例發(fā)生了變化，因而呈現(xiàn)出不同的感官品質(zhì)。

4.高產(chǎn)酯土著生香酵母菌強(qiáng)化大曲，進(jìn)行醋酸發(fā)酵：

4.1實(shí)驗(yàn)室規(guī)模：

采用稀釋至10⁷/ml的高產(chǎn)酯土著生香酵母Y2、Y14、Y18強(qiáng)化大曲，然后進(jìn)行發(fā)酵，強(qiáng)化時(shí)高產(chǎn)酯土著生香酵母菌菌液的總ml數(shù)等于大曲用量的總g數(shù)，其中Y14和Y18聯(lián)合雙菌株中Y14和Y18的用量各占高產(chǎn)酯土著生香酵母菌菌液總ml數(shù)的50%。

酒精發(fā)酵結(jié)束后添加輔料稻殼、麩皮，將發(fā)酵醪拌成固態(tài)，原料、稻殼及麩皮的添加量比例為1:1.2:1.6。將酒精發(fā)酵醪轉(zhuǎn)入塑料桶中，按照山西老陳醋實(shí)際生產(chǎn)比例加入填充料（每100公斤主料，添加細(xì)谷糠175公斤，粗谷糠50公斤），控制水分含量在 57%-58%，攪拌均勻，接入6%的醋醅（醋廠發(fā)酵第二天的醋醅），蓋上自制的透氣性較好的草墊，置于25℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行醋酸發(fā)酵，每天測(cè)量醋醅中心及周邊的溫度，時(shí)刻掌握醋酸發(fā)酵的進(jìn)度。發(fā)酵開始前兩天為醋醅起火的階段，不用翻醅，等第三天醋醅溫度升高之后開始翻醅，為醋酸發(fā)酵提供氧氣，每天定時(shí)翻醅一次，到發(fā)酵第9天結(jié)束醋酸發(fā)酵。

淋醋：醋酸發(fā)酵第9天加鹽（原料的5%）以結(jié)束醋酸發(fā)酵，加入與醋醅等質(zhì)量的水，攪拌均勻，浸泡24h，用100目篩子淋醋。

測(cè)定所釀醋的基本五項(xiàng)指標(biāo)，總酸 GB/T5009.41-2003、不揮發(fā)酸 GB18187-2000、還原糖 GB19777-2005、總酯 GB19777-2005、氨基態(tài)氮 GB/T5009.39-1996。

在實(shí)驗(yàn)室條件下模擬山西老陳醋前液后固的發(fā)酵方式釀醋，共釀出7種醋，分別為：山西老陳醋大曲所釀制醋（對(duì)照）、Y2、Y14、Y18單菌株分別與大曲共發(fā)酵所釀制醋、雙菌株復(fù)合與大曲共發(fā)酵所釀制醋、三株菌復(fù)合與大曲共發(fā)酵所釀制醋，由于Y2和Y18均屬Candida ethonalic(乙醇假絲酵母)，因此雙菌種組合試驗(yàn)中沒有設(shè)置Y2+Y18組合，而分別將其與Y14，Pichia manshurica進(jìn)行組合，五項(xiàng)指標(biāo)顯著性分析結(jié)果如表7所示。

表7：醋的五項(xiàng)指標(biāo)及差異性分析

由上表可知，Y2、Y14、Y18單菌株強(qiáng)化或復(fù)合強(qiáng)化大曲，均可使醋液中的總酸和總酯含量在1%水平上極顯著增加。對(duì)于提高醋液中的總酯含量，3菌株復(fù)合強(qiáng)化優(yōu)于雙菌株復(fù)合強(qiáng)化，雙菌株復(fù)合強(qiáng)化優(yōu)于單菌種強(qiáng)化。對(duì)于總酸，雙菌株復(fù)合強(qiáng)化顯著優(yōu)于三菌株復(fù)合強(qiáng)化。醋液中不揮發(fā)酸的含量，除Y18單菌種強(qiáng)化外，均有下降趨勢(shì)。差異顯著性分析表明，Y14+Y18強(qiáng)化組與大曲單獨(dú)發(fā)酵組和Y2+Y14組差異不顯著，Y2、Y14單菌種強(qiáng)化以及三菌種強(qiáng)化組醋液中的不揮發(fā)酸顯著低于對(duì)照組，且三菌種強(qiáng)化組中的不揮發(fā)酸含量最低，故對(duì)不揮發(fā)酸來講，也是雙菌種復(fù)合強(qiáng)化優(yōu)于三菌種復(fù)合強(qiáng)化。對(duì)于醋液中的還原糖含量，Y14+Y18雙菌種強(qiáng)化可使其顯著增加，Y18單菌種強(qiáng)化以及Y2+Y14雙菌種強(qiáng)化與對(duì)照差異不顯著，而三菌種強(qiáng)化與Y2、Y14單菌種強(qiáng)化則使其顯著降低。對(duì)于氨基態(tài)氮含量，只有Y2單菌種強(qiáng)化顯著高于對(duì)照組，Y2+Y18以及Y14+Y18雙菌種強(qiáng)化組與對(duì)照組差異不顯著，而三菌種強(qiáng)化則使氨基態(tài)氮含量顯著降低。

綜合考察醋液中的總酸、總酯、不揮發(fā)酸、還原糖和氨基態(tài)氮五項(xiàng)指標(biāo)，從大曲中分離出的三株高產(chǎn)酯酵母Y2、Y14及Y18,無論是單菌種強(qiáng)化，雙菌種強(qiáng)化還是三菌種強(qiáng)化均可使醋液中的總酸和總酯含量顯著增加。Y14+Y18雙菌種強(qiáng)化及Y18單菌種強(qiáng)化還可使醋液中的還原糖含量含量顯著增加，而對(duì)氨基態(tài)氮和不揮發(fā)酸含量無顯著影響；Y14+Y2則對(duì)還原糖含量和氨基態(tài)氮無顯著影響，不揮發(fā)酸量顯著降低；Y2+Y14+Y18除對(duì)不揮發(fā)酸無影響外，則使還原糖和氨基態(tài)氮的含量顯著降低。綜合考慮，強(qiáng)化效果Y14+Y18優(yōu)于Y14+Y2，且雙菌種強(qiáng)化優(yōu)于三菌種強(qiáng)化；Y18的單菌種強(qiáng)化效果也很好，但其對(duì)總酯的增強(qiáng)效果顯著低于雙菌種強(qiáng)化，而總酯是決定食醋品質(zhì)及口感的一個(gè)重要因素。Y2和Y14單獨(dú)強(qiáng)化雖然可使醋液中的總酸、總酯含量顯著增加，對(duì)氨基態(tài)氮含量無顯著影響，但可使醋液的不揮發(fā)酸、還原糖含量顯著降低，影響醋體的感官品質(zhì)。

總之，從上述五項(xiàng)指標(biāo)來評(píng)價(jià)醋的品質(zhì)，Y14+Y18雙菌種強(qiáng)化及Y18單菌種強(qiáng)化由于大曲單獨(dú)發(fā)酵醋，整體上Y14+Y18>Y18>大曲>Y2+Y14>Y2+Y14+Y18>Y2/Y14。

4.2醋廠實(shí)踐規(guī)模：

在實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選擇強(qiáng)化效果較好的Pichia manshurica(Y14)和Candida ethanolica (Y2和Y18)雙菌種強(qiáng)化組合（Y14+Y2、Y14+Y18）以及Y18單菌種強(qiáng)化用于山西釀造醋的發(fā)酵生產(chǎn)。菌種強(qiáng)化時(shí)依然根據(jù)主料用量確定大曲和強(qiáng)化菌種的用量。用于強(qiáng)化的菌種活化后在YEPD液體培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)20h，計(jì)數(shù)后用冷卻至室溫滅菌水稀釋至10⁷/ml待用。強(qiáng)化時(shí)酵母菌菌種的總ml數(shù)與大曲用量的g數(shù)相等，雙菌種強(qiáng)化時(shí)其中的單一菌株各占總ml數(shù)的50%。前醪后固工藝實(shí)際生產(chǎn)中Y14+Y18、Y14+Y2雙菌種強(qiáng)化以及Y18單菌種強(qiáng)化對(duì)醋5項(xiàng)基本指標(biāo)（g/100ml）的影響結(jié)果見表8，全固態(tài)發(fā)酵工藝實(shí)際生產(chǎn)中Y14+Y18、Y14+Y2雙菌種強(qiáng)化以及Y18單菌種強(qiáng)化對(duì)醋5項(xiàng)基本指標(biāo)（g/100ml）的影響結(jié)果見表9。

由表8和表9可知，無論是前醪后固工藝，還是全固態(tài)發(fā)酵工藝；無論以高粱為原料還是玉米為原料，數(shù)據(jù)依然呈現(xiàn)了實(shí)驗(yàn)室小試規(guī)模的規(guī)律，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)室規(guī)模試驗(yàn)的原料處理、溫度控制，操作手法完全模擬了實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模?？傊?，在實(shí)際生產(chǎn)中，Y14+Y18組合的雙菌種強(qiáng)化效果最好，其次為Y18，這兩種強(qiáng)化均可顯著提高醋液的總酸、總酯和還原糖含量，而對(duì)有機(jī)酸和氨基態(tài)氮含量無顯著影響。但Y18的曾酯效果顯著低于雙菌種強(qiáng)化。Y14+Y2組合在實(shí)際生產(chǎn)中依然使不揮發(fā)酸的含量顯著降低。與實(shí)驗(yàn)室規(guī)模不同的是在全固態(tài)發(fā)酵工藝中，Y14+Y2組合可顯著提高醋中的氨基態(tài)氮含量，在前醪后固工藝中，氨基態(tài)氮的含量也有增加的趨勢(shì)。

表8：前醪后固工藝實(shí)際生產(chǎn)中Y14+Y18、Y14+Y2雙菌種強(qiáng)化以及Y18單菌種強(qiáng)化對(duì)醋5項(xiàng)基本指標(biāo)（g/100ml）的影響

注：*表示在同列中與大曲單獨(dú)發(fā)酵相比，差異顯著（P<0.05)；a表示與Y18單菌種強(qiáng)化相比，總酯含量差異顯著（P<0.05）。

表9：全固態(tài)發(fā)酵工藝實(shí)際生產(chǎn)中Y14+Y18、Y14+Y2雙菌種強(qiáng)化以及Y18單菌種強(qiáng)化對(duì)醋5項(xiàng)基本指標(biāo)（g/100ml）的影響

注：*表示在同列中與大曲單獨(dú)發(fā)酵相比，差異顯著（P<0.05)；a表示與Y18單菌種強(qiáng)化相比，總酯含量差異顯著（P<0.05）。

序列表

<110> 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種利用高產(chǎn)酯土著生香酵母強(qiáng)化大曲提高食醋總酸總酯、還原糖含量的方法

<160>4

<170> PaUentIn Version 3.5

<210> 1

<211> 514

<212> RNA

<213> 人工序列

<223> 畢赤酵母屬（Pichia manshurica）Y14的rRNA 基因D1/D2區(qū)序列

<400> 1

1 AAATCGTGTT TCGGCACGAG TTGTAGAGTG TAGGCGGGAG TCTCTGTGGA GCGCGGTGTC

61 CAAGTCCCTT GGAACAGGGT GCCTGAGAGG GTGAGAGCCC CGTAGGGTGC TGCGCGAAGC

121 TTTTGAGGCC CTGCTGACGA GTCGAGTTGT TTGGGAATGC AGCTCCAAGC GGGTGGTAAA

181 TTCCATCTAA GGCTAAATAT TGGCGAGAGA CCGATAGCGA ACAAGTACTG TGAAGGAAAG

241 ATGAAAAGCA CTTTGAAAAG AGAGTGAAAC AGCACGTGAA ATTGTTGAAA GGGAAGGGTA

301 TTGGGCTCGA CATGGGGGGT GCGCACCGCT GTCTCTTGTA GGCGGCGCTC TGGGCGCCCT

361 CTGGGCCAGC ATCGGTTCCT GCTGCGGGAG AAGGGGCTCC GGAAAGTGGC TCTTCGGAGT

421 GTTATAGCCG GGGCCAGATG CCGCGTGTGG GGACCGAGGA CTGCGGCTTC TGTCTCGGAT

481 GCTGGCATAA CGGCGCAATA CCGCCCGTCT TGAA

<210> 2

<211> 534

<212> RNA

<213>人工序列

<223> 乙醇假絲酵母(Candida ethonolic)Y18的rRNA 基因D1/D2區(qū)序列

<400> 2

1 AAGCGGCAAG AGCTCAGATT TGAAATCGTG TTTCGGCACG AGTTGTAGAG TGTAGGCTGG

61 AGTCTCTGTG GAGCGCGGTG TCCAAGTCCC TTGGAACAGG GTGCCTGAGA GGGTGAGAGC

121 CCCGTGGGGT GCTGCGCGAA GCTTTGAGGC CCTGCTGACG AGTCGAGTTG TTTGGGAATG

181 CAGCTCTAAG CGGGTGGTAA ATTCCATCTA AGGCTAAATA TTGGCGAGAG ACCGATAGCG

241 AACAAGTACT GTGAAGGAAA GATGAAAAGC ACTTTGAAAA GAGAGTGAAA CAGCACGTGA

301 AATTGTTGAA AGGGAAGGGT ATTGGGCCCG ACATGGGGAG TGCGCACCGC TGTCTCTTGT

361 AGGCGGCGCT CTGGGCGCTC TCTGGGCCAG CATCGGTTCT TGCTGCGAGA GAAGTGGCGC

421 CGGAAAGTGG CTCTTCGGAG TGTTATAGCC GGTGCCGGAT GTCGCGTGCG GGGACCGAGG

481 GCTGCGACAT CTGTCTCGGA TGCTGGCACA ACGGCGCAAT ACCGCCCGTC TTGA

<210> 3

<211> 516

<212> DNA

<213>人工序列

<223> 乙醇假絲酵母(Candida ethonolic)Y2的26s rDNA 基因D1/D2區(qū)序列

<400> 3

1 AAATCGTGTT TCGGCACGAG TTGTAGAGTG TAGGCGGGAG TCTCTGTGGA GCGCGGTGTC

61 CAAGTCCCTT GGAACAGGGT GCCTGAGAGG GTGAGAGCCC CGTGGGGTGC TGCGCGAAGC

121 TTTGAGGCCC TGCTGACGAG TCGAGTTGTT TGGGAATGCA GCTCTAAGCG GGTGGTAAAT

181 TCCATCTAAG GCTAAATACT GGCGAGAGAC CGATAGCGAA CAAGTACTGT GAAGGAAAGA

241 TGAAAAGCAC TTTGAAAAGA GAGTGAAACA GCACGTGAAA TTGTTGAAAG GGAAGGGTAT

301 TGGGCCCGAC ATGGGGAGTG CGCACCGCTG TCTCTTGTAG GCGGCGCTCT GGGCGCTCTC

361 TGGGCCAGCA TCGGTTCTTG CTGCGAGAGA AGTGGCGCCG GAAAGTGGCT CTTCGGAGTG

421 TTATAGCCGG TGCCGGATGT CGCGTGCGGG GACCGAGGGC TGCGACATCT GTCTCGGATG

481 CTGGCACAAC GGCGCAATAC CGCCCGTCTT GAACC

<210> 4

<211> 421

<212> DNA

<213>人工序列

<223> Y2（Candida ethonolic）26s rDNA ITS 序列

<400> 4

1 ATCTGAGGTC GAGCTCATAG TGCTCGGAGA CCCCAAGCGT CCTGTTCTAG TTCGCTCGTG

61 GCCTCGTTTC TTTTCGGCGG GGCCGTGGCC GGGCCAGCTC TGCGCAACTC TCGTCTTGCA

121 AGAAGGAAAC GACGCTCAGA CAGGCATGCC CGCCGGAATG CCGACGGGCG CAATGTGCGT

181 TCAAGAACTC GATGATTCAC GATGGCTGCA ATTCACACTA GGTATCGCAT TTCGCTGCGC

241 TCTTCATCGA TGCGAGAACC AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTGTGTTA AAATAAAAAC

301 TCCTGAACTA GTATACGTGT TTGTGTGTTG TGTGCGCTCA CGCAGTGTGG AACAATAATC

361 ACAGTAATGA TCCTTCCGCA GGTTCACCTA CGGAAACCTT GTTACGACtT TTTTACTTCC A