專利名稱：一種抑制癌細胞株的中藥制劑及其制備方法
技術領域：
本發(fā)明是關于一種抑制癌細胞株的中藥制劑及其制備方法，尤其指利用四種中藥 材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得的中藥物。
背景技術：
樟芝(Antrodia camphorate)，為屬于非褶菌目、多孔科、多年生蕈菌類。為珍 貴的藥材或食材。邇來被重視用于養(yǎng)生保健。因為樟芝往往依附在牛樟樹Cirmamomum kanehirai Hay，所以又稱牛樟芝或牛樟菇。至于樟芝對于肝病的療效，根據資料所稱，土著 人飲酒導致肝病，都是飲用樟芝所制作的湯汁，得到很好療效。因此在口耳相傳之下，受到 極大的重視。此外也受到生化、中西醫(yī)藥界及政府、學界相關機構的重視與證實，例如(但 不限于)論文類1、牛樟芝不同極性區(qū)分保肝機能性之研究——中山醫(yī)學大學營養(yǎng)研究所92碩士 論文。2、牛樟芝輔助肝癌化學治療與改善抗藥性表現(xiàn)的藥理活性暨分子機制探討—— 南臺科技大學生科技所94碩士論文。3、牛樟芝輔助肝癌化學治療與改善抗藥性表現(xiàn)的藥理活性暨分子機制探討—— 南臺科技大學生科技所94碩士論文。4、牛樟芝萃取物抑制微小膠質細胞發(fā)炎機制的探討——臺北醫(yī)學大學醫(yī)學研究 所94碩士論文。5、不同樟芝菌種發(fā)酵液在肝癌細胞的毒殺性比較——國立臺灣海洋大學食品科 學所94碩士論文。6、以細胞培養(yǎng)模式評估固態(tài)培養(yǎng)牛樟芝菌取物的之抗肝癌生物活性及其機 制——國立臺灣海洋大學食品科學所94碩士論文。7、樟芝的保肝功效與保肝有效成分純化的研究——國立成功大學藥理學研究所 94碩士論文。8、中草藥對肝炎的研究探討——實踐大學食品營養(yǎng)所93碩士論文。臺灣大學食 科所92碩士論文。期刊類1、生物科技——顧肝保肝牛樟芝，中華文化雙周報，陳相訓，94. 042、正確認識生技食品牛樟芝，中華文化雙周報，陳俊志，94. 023、靈芝與樟芝之研發(fā)與市場現(xiàn)況，農業(yè)世界，王伯徹，民94. 01頁20-32Taiwanofungus，A Polypore New Genus，中華真菌學會會刊，吳聲華等，93. 124、樟芝活性成分的研究及應用，食品工業(yè)，王薇猗，93. 125、樟芝的牛樟樹宿主專一性，食品工業(yè)，林永浩，93. 056、靈芝和牛 樟，明道文藝，徐基東，92. 12前案類
申請案號093113387 —種可抑制B型肝炎抗原之化合物及其醫(yī)藥或食品組合物申請案號092106890 —種可提高人體運動能力與抗疲勞的人工栽培樟芝萃取 制造方法與其新用途由上述等深入的研究以及臨床實驗，皆可證實樟芝良好的功效。雖然樟芝受到重視，但是因為樟樹在家俱、雕刻業(yè)以及樟腦油業(yè)大量需求下遭大 量砍伐，以至實際上「樟芝子實體」的產量相當有限，所以目前實際上使用的比較多的「樟 芝菌絲體」的的產物?！刚林プ訉嶓w」與「樟芝菌絲體」的區(qū)別，根據日本東京農大生化應用資深研究員藍 蒼洲指出，所謂「樟芝子實體」指的是已出菇的樟芝，具備完整的「生理結構及活性」，是最 接近野生樟芝的；而「菌絲體」指的未出菇的樟芝，屬于不成熟且不完整的生理結構，與野 生的成分相差非常大，原本樟芝的主要價值在「樟芝子實體」。由于前述野生樟芝數量極少，近年來更因為盜墾而瀕臨絕種，所以生物界積極投 入人工樟芝子實體的培育技術，經歷十多年的研究。例如目前市面上所呈現(xiàn)的牛樟芝膠囊， 等即是由菌絲體作成，然而利用不同的液態(tài)或固態(tài)(如葡萄糖-液態(tài)五谷豆皮、洋菜等)培 養(yǎng)的菌絲商品，因為培養(yǎng)基不同，因此菌絲體功效并不相同，而有良窳之分。
發(fā)明內容本發(fā)明目的在于解決上述不足，提供一種抑制癌細胞株的中藥制劑及其制備方 法，其能很好地培養(yǎng)樟芝菌絲體的培養(yǎng)基。為達成上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于以包括當歸、川芎、熟地黃、白芍所混合的 四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得。四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其培養(yǎng)至發(fā)酵的步驟包括A、取當歸川芎熟地黃白芍為1 5 1 5 1 5 1 5種類以及重 量比例；B、用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用；C、取藥渣并為脫水，成為固形物；D、混入碳酸鈣，該碳酸鈣固形物重量為1 5% 100%;混入米糠，該米糠固 形物重量為1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，該蛋白胴(ρ印tone)固形物重量為 1 5% 100%E、經滅菌后，該中間制備物加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例為中間制備物樟 芝菌絲體菌液為1 50 1 ；F、發(fā)酵其發(fā)酵條件為溫度15-50°C濕度30_95%培養(yǎng)天婁7_50天；取得樟芝四物藥 材。本發(fā)明的有益之處在于提供一種抑制癌細胞株的中藥制劑及其制備方法，這種抑 制癌細胞株的中藥制劑，是以當歸、川芎、熟地黃、白芍所混合的四種中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲 體發(fā)酵，并由萃取方法所取得。主要是以中藥材為木質化的藥材，加入具有強烈纖維素分解 酵素，而作為固體發(fā)酵用菌種，可有效將殘留于中藥藥渣的一些成份，再予以分解及合成可能有功效性的特殊成份出來，本方案特別是以上述中藥材中所混合的四物中藥材培養(yǎng)樟芝 菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得。本發(fā)明主要是由具有強烈纖維素分解酵素及木質素分解酵素的高等真菌，特別是 菇類，作為固體發(fā)酵用菌種，可有效將殘留于中藥藥渣的一些成份，再予以分解及合成可能 有功效性的特殊成份出來，透過功能性評估試驗，可以有突破性的發(fā)現(xiàn)。領取四物藥材(當歸川彎熟地黃白芍=1 5 1 5 1 5 1 5) 用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用。領取藥渣，脫水(形成固形物)，混合(加 入碳酸鈣、米糠、蛋白胴(peptone))，充填，取混合后四物藥材(或藥渣)，經滅菌后，取四 物藥材，加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例為1-50 1，發(fā)酵后收成，其發(fā)酵條件為溫度 15-50°C濕度30-95%培養(yǎng)天數7_50天。 本發(fā)明的樟芝四物藥材，可以利用以下幾種萃取液來達到萃取的目的，例如第一 種萃取液為水酒精=100% 0%、第二種萃取液為水酒精=50士3% 50士3%、第三 種萃取液為水酒精=5士3% 95士3%，而經過實驗證實，以第三種萃取液為較佳。本發(fā)明實驗過程，可以容許第一種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Ig;第二種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Ig ；第三種萃取液 與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Igo該樟芝四物藥材由第一種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至發(fā)酵 物第一種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第二種萃取液與該樟芝四物藥材 中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第二種萃取液1 30g Iml;該樟芝四物藥材由 第三種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第三種萃取液1 30g 1ml。
以下結合附圖對本發(fā)明詳細說明
圖1是本發(fā)明動物小鼠體內試驗示意圖一；圖2是本發(fā)明動物小鼠體內試驗示意圖一；圖3是灌食本發(fā)明萃取物的老鼠狀態(tài)圖；圖4是尚未灌食本發(fā)明萃取物的老鼠狀態(tài)圖；圖5是顯示肝癌增生細胞的KI-67抗體染色圖；圖6是喂食樟芝四物(J20)萃取物后，KI-67抗體與肝癌增生細胞產生的紅點減 少示意圖；圖7是本發(fā)明四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法流程示意圖。
具體實施例方式以下結合附圖及實施例對本發(fā)明詳述本發(fā)明是關于一種抑制癌細胞株的中藥制劑，是以包括當歸、川芎、熟地黃、白芍 所混合的四種中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得。而該四物、其功效以及其 主治，包括當歸
功效補血活血，滋養(yǎng)強壯，調經止痛，潤燥滑腸。主治風濕痹痛，經閉腹痛，崩漏眩暈，腸燥便難，癰疽瘡瘍，跌打損傷。川芎功效頭痛眩暈，胸脅脹痛，筋攣寒痹，腰腳軟弱，腹內冷痛，瀉痢，癰疽，月經不調。主治行氣開郁，驅風止痛，理氣活血，排膿長肉，燥濕，上行頭面，外達肌膚，為治 痛常用藥。白芍功效瀉肝火，和血脈，斂陰平肝，緩中止痛。主治血虛頭暈，崩漏虛汗，胸腹疼痛，月經不調，四肢攣急，瀉痢。熟地黃功效補精益髓，滋陰強壯，養(yǎng)肝明目。主治月經不調，胎產崩漏，遺精消渴，潮熱盜汗，耳聾目昏。由于該四物具有高度營養(yǎng)，因此做為培養(yǎng)基極為恰當，該四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌 絲體發(fā)酵方法，其培養(yǎng)至發(fā)酵的步驟，請參閱第圖7所示，包括A、取當歸川芎熟地黃白芍=1 5 1 5 1 5 1 5種類以及重
量比例。B、用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用；萃取溫度可以選擇為 50-150°C，2-5 小時。C、取藥渣并為脫水，成為固形物；濾液可以供其它藥品使用。該固形物仍然可以保 持部分水分于占固型量1_30%。該水分由于微量，仍然界定于該固形物的范圍。D、混入碳酸鈣，該碳酸鈣固形物重量=1 5% 100%混入米糠，該米糠固 形物重量=1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，該蛋白胴(ρ印tone)固形物重量= 1 5% 100%E、經滅菌后，該中間制備物加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例中間制備物樟芝 菌絲體菌液=1 50 1 ；可以利用機器充填至發(fā)酵瓶。滅菌條件可以設為121°C，1_5小 時。F、發(fā)酵其發(fā)酵條件為溫度15-50°C濕度30_95%培養(yǎng)天數7_50天；取得樟芝四物藥 材。該培養(yǎng)較佳是在無塵室里(Hepa)中進行。即可得到發(fā)酵后的樟芝四種藥材(后簡稱 為「樟芝四物」)。
本發(fā)明的樟芝四種藥材，可以利用以下幾種萃取液來達到萃取目的，例如第一種 萃取液為水酒精=100% 0%、第二種萃取液為水酒精=50士3% 50士3%、第三種 萃取液為水酒精=5士3% 95士3%，而經過實驗證實，以第三種萃取液為較佳。至于 本發(fā)明實驗過程，可以容許第一種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml lg； 第二種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Ig ；第三種萃取液與該樟芝四 物藥材的萃取濃度=1 30ml Igo該樟芝四物藥材由第一種萃取液與該樟芝四物藥 材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第一種萃取液1 30g Iml;該樟芝四物藥材由 第二種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第二種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第三種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第三種萃取液1 30g Iml0水及水酒以70-100°C萃取1_3小時，95%酒 精則以浸漬或超音波震蕩方式萃取，浸漬方式為24-48小時，超音波的話為1-3小時。而本發(fā)明是一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其步驟包括:A、取當 歸川芎熟地黃白芍=1 5:1 5:1 5:1 5種類以及重量比例；B、 用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用；C、取藥渣并為脫水，成為固形物；D、混入 碳酸鈣，該碳酸鈣固形物重量=1 5% 100% ；混入米糠，該米糠固形物重量= 1 30% 100% 混入蛋白胴(P印tone)，該蛋白胴(ρ印tone)固形 物重量=1 5% 100% ;E、經滅菌后，該中間制備物加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例為中間制備物 樟芝菌絲體菌液=1 50 1;F、發(fā)酵其發(fā)酵條件為溫度15-50°C濕度30-95%培養(yǎng)天 數7-50天；取得樟芝四物藥材。而本發(fā)明是一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵的樟芝四物藥材萃取方法， 其特征在于，該以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其萃取液系選自第一種萃取液為 水酒精=100% 0%，第二種萃取液為水酒精=50士3% 50士3%第三種萃取液為 水酒精=5士3% 95士3%的一萃取液萃取。該第一種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取 濃度=1 30ml Ig;第二種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Ig ；第 三種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度=1 30ml Igo該樟芝四物藥材由第一種萃 取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第一種萃取液1 30g Iml ； 該樟芝四物藥材由第二種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材 第二種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第三種萃取液與該樟芝四物藥材中以真 空減壓濃縮至樟芝四物藥材第三種萃取液1 30g Iml0值得一提的是，真空減壓濃縮的原理主要系利用標準狀況下，若大氣壓力降低時， 沸點也會呈現(xiàn)以倍數的比例降低，使溶劑在較低的溫度(低于溶劑沸點)甚至是常溫時， 即沸騰蒸發(fā)成氣體，且在另一端冷凝成液態(tài)溶劑，而溶質由于沸點遠大于溶劑，因而留在熱 端，當溶劑量減少但溶質量不變時，則濃度就提高(濃縮)了，旨在移除溶液中多余的溶劑， 或是溶質在高溫時容易分解，則采用此法，相當于減壓蒸餾的原理。實驗結果體外試驗(細胞試驗)結果參見下表 分別取三種萃取液(a 水萃、b :95%酒精、c 水酒(50% ))進行抑制血小板凝集 及癌細胞毒殺能力試驗(三種癌細胞，肝癌、肺癌及乳癌)，其結果得知四物藥材培養(yǎng)樟芝 以95%酒精萃取后，其抑制癌細胞能力的效果最佳。體內試驗(動物小鼠試驗)參見圖1，樟芝四物(J20)萃取液能有效抑制癌細胞生 長，使得患有肝癌細胞的小鼠存活率提高。樟芝四物(J20)萃取液對肝癌細胞株有抑制作用，可抑制癌細胞的體積增大，圖2 為喂食第17天后，對照組(PBS)與實驗組(J20)的肝癌細胞體積的大小。圖中橫線為代表 平均值。該對照組(PBS)為磷酸緩衛(wèi)溶液(phosphate-buffered Saline)，功用為類似生理 食鹽水，以便作為常態(tài)的比較組。請參閱圖3所示，顯示利用本發(fā)明實施于老鼠，而灌食樟芝四物藥材萃取物的老 鼠(第十七天)，肝癌細胞已明顯縮小。請參閱圖4所示，未灌食樟芝藥材萃取物的老鼠(第十七天)，肝癌細胞體積未見縮小。請參閱圖5所示，顯示肝癌增生細胞的KI-67抗體染色，未喂食前，圖中的紅點為 肝癌增生細胞與KI-67抗體染色的后所產生。請參閱圖6所示，喂食樟芝四物(J20)萃取物后，可以發(fā)現(xiàn)KI-67抗體與肝癌增生 細胞產生的紅點已明顯減少，代表細胞未有肝癌的增生細胞大量產生。另外也證明此萃取 液對正常細胞并也毒殺作用。
權利要求
抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于以包括當歸、川芎、熟地黃、白芍所混合的四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得。
2.如權利要求1所述的抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于該四物中藥材培養(yǎng)樟芝 菌絲體發(fā)酵方法，其培養(yǎng)至發(fā)酵的步驟包括A、取當歸川芎熟地黃白芍為1 5 1 5 1 5 1 5種類以及重量比例；B、用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用；C、取藥渣并為脫水，成為固形物；D、混入碳酸鈣，該碳酸鈣固形物重量為1 5% 100%;混入米糠，該米糠固形物 重量為1 30% 100%混入蛋白胴(ρ印tone)，該蛋白胴(ρ印tone)固形物重量為1 5% 100%E、經滅菌后，該中間制備物加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例為中間制備物樟芝菌絲 體菌液為1 50 1 ；F、發(fā)酵其發(fā)酵條件為溫度15-50°C濕度30-95%培養(yǎng)天婁7_50天；取得樟芝四物藥材。
3.如權利要求1所述的抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于該樟芝四物藥材的萃取 系選自第一種萃取液為水酒精為100% 0% ； 或第二種萃取液為水酒精為50士3% 50士3% ； 或第三種萃取液為水酒精為5士3% 95士3% ； 之一的萃取液萃取。
4.如權利要求3所述的抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于 第一種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Ig ； 或第二種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Ig ； 或第三種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Igo
5.如權利要求4所述的抑制癌細胞株的中藥制劑，其特征在于該樟芝四物藥材由第一種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥 材第一種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第二種萃取液與該樟芝四物藥材中 以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第二種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第三 種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至發(fā)酵物第三種萃取液1 30g Iml0
6.抑制癌細胞株的中藥制劑的方法，其為一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方 法，其步驟包括A、取當歸川芎熟地黃白芍為1 5 1 5 1 5 1 5種類以及重量比例；B、用水煎煮萃取后過濾，過濾后藥材的藥渣備用；C、取藥渣并為脫水，成為固形物；D、混入碳酸鈣，該碳酸鈣固形物重量為1 5% 100%;混入米糠，該米糠固形物 重量為1 30% 100% 混入蛋白胴(P印tone)，該蛋白胴(ρ印tone)固形物重量為 1 5% 100% ；Ε、經滅菌后，該中間制備物加入樟芝菌絲體菌液，其重量比例為中間制備物樟芝菌 絲體菌液為1 50 1 ；F、發(fā)酵其發(fā)酵條件為溫度15-50°C濕度30-95%，培養(yǎng)天數7_50天；取得樟芝四物藥材。
7.如權利要求6所述的一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其特征在于該樟 芝四物藥材的萃取系選自第一種萃取液為水酒精為100% 0% ；或第二種萃取液為水酒精為50士3% 50士3% ；或第三種萃取液為水酒精為5士3% 95士3%之一的萃取液萃取。
8.如權利要求7所述的一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其特征在于該第一種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Ig ；第二種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Ig ；第三種萃取液與該樟芝四物藥材的萃取濃度為1 30ml Igo
9.如權利要求8所述的一種以四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵方法，其特征在于該 樟芝四物藥材由第一種萃取液與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第 一種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第二種萃取液與樟芝四物藥材中以真空減 壓濃縮至樟芝四物藥材第二種萃取液1 30g Iml ；該樟芝四物藥材由第三種萃取液 與該樟芝四物藥材中以真空減壓濃縮至樟芝四物藥材第三種萃取液1 30g Iml0
全文摘要
本發(fā)明是關于一種抑制癌細胞株的中藥制劑及其制備方法，主要是以中藥材中所混合的四物中藥材培養(yǎng)樟芝菌絲體發(fā)酵，并由萃取方法所取得作為抑制癌細胞株的中藥制劑，并且關于其制備方法中的發(fā)酵以及萃取，提供較佳的方法。
文檔編號A61K36/804GK101837027SQ20091011985
公開日2010年9月22日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權日2009年3月20日
發(fā)明者林嘉鎮(zhèn) 申請人:華昌制藥生化科技股份有限公司