專利名稱：使用小檗堿抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移(cancer stem cells)的醫(yī)藥組成物及其應(yīng)用，尤其指一種含小檗堿化合物(berberine compounds)以抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物以及使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途。
背景技術(shù)：
癌癥是位于十大死因之一，已連續(xù)二十七年為居十大死因的榜首。引發(fā)癌癥起因主要為細(xì)胞變成異常，且持續(xù)的自行分裂，形成更多的異常細(xì)胞，就是癌癥。一般腫瘤細(xì)胞中，潛存些許具有干細(xì)胞特性的癌細(xì)胞，此種癌細(xì)胞雖然數(shù)量不多，但卻類似干細(xì)胞，可以不斷的進(jìn)行癌細(xì)胞分裂及分化，因此稱的為癌干細(xì)胞。由于癌干細(xì)胞 具有極高的抗藥性，西方醫(yī)學(xué)化學(xué)治療藥物難以將之毒殺。因此，常聽到許多經(jīng)過化療的病患，體內(nèi)癌癥復(fù)發(fā)的情形，目前生物醫(yī)學(xué)已知的標(biāo)準(zhǔn)癌癥療法，對(duì)癌干細(xì)胞根本束手無策。況且，目前西醫(yī)療法所使用的手術(shù)、放射線治療、化學(xué)療法、賀爾蒙療法、生物制劑療法等，常常對(duì)于患者身體產(chǎn)生強(qiáng)烈副作用，因此，若能使用比較溫和，且能抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的療法，進(jìn)行癌癥治療，對(duì)于病患而言將是一大福音?，F(xiàn)今，民眾普遍認(rèn)以中藥對(duì)患者進(jìn)行治療，屬于比較溫和的治療方法，且具有相當(dāng)高的市場(chǎng)接受度，而成為一種替代性療法(complementary alternative medicines)。因此，自眾多中藥材的中，經(jīng)篩選實(shí)驗(yàn)后，可證實(shí)某中藥材確實(shí)可阻止癌干細(xì)胞進(jìn)行分裂并抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，勢(shì)必可對(duì)于癌癥治療具有相當(dāng)?shù)膸椭?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，能顯著的減低癌細(xì)胞株的細(xì)胞存活率，如非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞(non-small-cell lungcarcinoma, NSCLC)，但在有效劑量下不會(huì)使正常細(xì)胞株受到影響，并且能有效抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的另一目的在于提供一種使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，此藥劑能降低癌細(xì)胞增生、轉(zhuǎn)移以及類癌干細(xì)胞的比例，藥劑亦包含預(yù)防與治療癌癥的保健食品與臨床治療用藥。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，包括一小檗堿化合物；以及一醫(yī)藥上可接受性載體。本發(fā)明的小檗堿化合物可以用于制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑。其中，該小檗堿化合物為小檗堿氯化物。
其中，該小檗堿化合物是包含于一黃連萃取物中。其中，該黃連萃取物是一黃連水萃取物或由該黃連水萃取物干燥而得。其中，該黃連水萃取物提供一黃連藥材，添加50倍至200倍該黃連藥材重量的水，形成一混合物后，對(duì)該混合物加熱萃取而得。其中，該萃取的時(shí)間為30分鐘至2小時(shí)。其中，該混合物加熱至體積成為原始體積的四分之一至二分之一。其中，該癌干細(xì)胞或該癌細(xì)胞為非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞。由上述可知，含有小檗堿化合物且用于抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物、抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的治療方法、以及小檗堿化合物用于制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，同樣落于本發(fā)明的范疇中，其中該癌干細(xì)胞或該癌細(xì)胞可為非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞。
綜上所述，本發(fā)明上述抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物、以及使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，可以突破癌癥治療中無法有效抑制癌干細(xì)胞的瓶頸，進(jìn)而發(fā)展成為預(yù)防與治療癌癥的保健食品與臨床治療用藥。


圖I為黃連萃取物對(duì)A549、NCI-H460、NCI-H520與MRC5等細(xì)胞株的測(cè)試結(jié)果。圖2A為小檗堿溶液與A549細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的MTT測(cè)試結(jié)果。圖2B為小檗堿溶液與NCI-H460細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的MTT測(cè)試結(jié)果。圖2C是小檗堿溶液與NCI-H520細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的MTT測(cè)試結(jié)果。圖3為黃連萃取物對(duì)A549細(xì)胞株的萘胺藍(lán)染劑測(cè)試結(jié)果。圖4為黃連萃取物處理后A549細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果。圖5A為黃連萃取物處理后⑶K4的表現(xiàn)結(jié)果。圖5B為黃連萃取物處理后⑶K6的表現(xiàn)結(jié)果。圖5C為黃連萃取物處理后cyclin D3的表現(xiàn)結(jié)果。圖為黃連萃取物處理后cyclin BI的表現(xiàn)結(jié)果。圖5E為黃連萃取物處理后Vimentin的表現(xiàn)結(jié)果。圖5F為黃連萃取物處理后ALDH1A1的表現(xiàn)結(jié)果。圖5G為黃連萃取物處理后P -catenin的表現(xiàn)結(jié)果。圖5H為黃連萃取物處理后ABCG2的表現(xiàn)結(jié)果。圖6為穿孔分析中黃連萃取物處理后全數(shù)15個(gè)顯微鏡觀察視野中單位視野的細(xì)
胞數(shù)量。圖7A為黃連萃取液處理后的SP分析結(jié)果。圖7B為小檗堿溶液處理后的SP分析結(jié)果。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明樣提供的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，包括一小檗堿化合物；以及一醫(yī)藥上可接受性載體。本發(fā)明提供了使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途。本發(fā)明抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物及上述用途中，該小檗堿化合物可以在市面上購買而得，例如小檗堿氯化物(berberine chloride)及其水合物、小檗堿硫酸鹽(berberine sulfate)、小檗堿半硫酸鹽(berberine hemisulfate)、小檗堿硫酸氫鹽(berberine bisulfate)等,或者利用黃連藥材萃取而得。若萃取黃連藥材，則小檗堿化合物包含于黃連萃取物中。舉例而言，可以提供黃連藥材，添加50倍至200倍該黃連藥材重量的水，形成一混合物后,對(duì)該混合物加熱萃取持續(xù)30分鐘至2小時(shí)，或直至該混合物加熱至體積成為原始體積的四分之一至二分之一，便可以得到一黃連水萃取物。如此，該黃連水萃取物便含有小檗堿化合物，且該黃連水萃取物可經(jīng)過干燥工藝，如噴霧干燥法、冷凍干燥法、科學(xué)中藥造粒法等，形成一干燥形式的萃取物。本發(fā)明將黃連藥材萃取而得的黃連萃取物，經(jīng)過一系列生物性測(cè)試實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)此可以抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，并對(duì)此黃連萃取物初步進(jìn)行成分分析，而發(fā)現(xiàn)黃連萃取物中主要成分為小檗堿，因此推測(cè)小檗堿化合物應(yīng)該同樣可以達(dá)到相同功效，故利用 堿與黃連萃取物皆可以達(dá)到抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功效。本發(fā)明所使用的「抑制」一詞，是指將一種含小檗堿化合物的醫(yī)藥組成物，投予患有癌癥、具有癌癥癥狀、或朝癌癥發(fā)展傾向的主體，以期達(dá)到治療、治愈、減輕、減緩、改變、醫(yī)治、改善、改進(jìn)、或影響此病癥、其癥狀、或朝癌癥發(fā)展的傾向?！赣行┝俊挂辉~是指能夠?qū)τ谑芤种浦黧w產(chǎn)生預(yù)期療效所需的活性藥劑量。對(duì)于有效劑量，本領(lǐng)域具有通常知識(shí)者可了解到其會(huì)根據(jù)投藥路徑、使用賦形劑、以及與其它藥劑共同使用的可能性而改變。本發(fā)明的方法可治療的癌癥，包含各種器官的實(shí)體或血液腫瘤兩者。實(shí)體腫瘤舉例包含胰腺癌；膀胱癌；大腸直腸癌；乳癌，包括轉(zhuǎn)移性乳癌；腎癌，例如包括轉(zhuǎn)移性腎細(xì)胞癌；肝癌；肺癌，例如包括非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cacinoma, NSCLC)、細(xì)支氣管肺泡癌(bronchioloalveolar carcinoma, BAC)、和肺腺癌；前列腺癌,包括雄激素依賴性和雄激素非依賴性前列腺癌癥；卵巢癌，例如包括進(jìn)行性上皮或原發(fā)性腹膜癌；神經(jīng)內(nèi)分泌癌，包括轉(zhuǎn)移性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤；腦腫瘤，例如包括神經(jīng)膠瘤、退化性寡軸突膠質(zhì)細(xì)胞瘤、多型性神經(jīng)膠母細(xì)胞瘤、以及成人退化性星細(xì)胞瘤；子宮頸癌；胃癌；食道癌；頭頸部癌，例如包括頭頸部的鱗狀細(xì)胞癌；黑色素瘤；骨癌；以及軟組織肉瘤。惡性血液疾病舉例包括急性骨髓性白血病(AML);慢性骨髓性白血病(CML)，包括加速性CML和CML的爆發(fā)階段(CML-BP);骨髓增生不良癥候群(myelodysplastic syndromes, MDS),包括頑抗性貧血(refractory anemia, RA)、伴有環(huán)狀含鐵胚細(xì)胞的頑抗性貧血(refractory anemiawith ringed siderblasts, RARS)、伴有過多胚細(xì)胞的頑抗性貧血(refractory anemiawith excess blasts, RAEB)、及轉(zhuǎn)變中的 RAEB(RAEB-T);非霍奇金氏病(non-HodgkinJ slymphoma, NHL)，包括濾泡型淋巴瘤、和外套細(xì)胞淋巴瘤；B細(xì)胞淋巴瘤；T細(xì)胞淋巴瘤；多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma, MM);急性淋巴母細(xì)胞性白血病(ALL);慢性淋巴母細(xì)胞性白血病(CLL);霍奇金氏病(Hodgkin’ s disease, HD);華爾登氏巨球蛋白血癥(Waldenstrom，s macroglobulinemia);以及骨髓增生性癥候群。本發(fā)明的醫(yī)藥組成物可還包含如細(xì)胞毒性劑的治療劑，或者與如放射性治療、或免疫性治療的治療法一起施用。舉例而言，此細(xì)胞毒性劑可為抗代謝藥物(antimetabolites)，包含如卡培他濱(capecitibine)、吉西他濱(gemcitabine)、5-氟尿啼卩定(5_f IuorouraciI)或5-氟尿啼卩定/白葉酸(Ieucovorin)、氟達(dá)拉濱(fludarabine)、阿拉伯糖基胞啼卩定(cytarabine)、巰基票呤(mercaptopurine)、硫代鳥口票呤(thioguanine)、噴司他丁 (pentostatin)、和胺甲葉酸(methotrexate);拓蹼異構(gòu)酶(topoisomerase)抑制劑，例如包括依妥普賽(etoposide)、坦尼坡賽(teniposide)、喜樹堿(camptothecin)、拓蹼替康(topotecan)、伊立替康(irinotecan)、阿德力霉素(doxorubcin)、和道諾魯比辛(daunorubicin);長(zhǎng)春花生物減(vinca alkaloid)，例如包括長(zhǎng)春新堿(vincristine)、和長(zhǎng)春堿(vinblastin);紫杉焼類(taxanes)，例如包括紫杉醇(paclitaxel)、和多西紫杉酉享(docetaxel);鉬劑(platinum agents)，例如包括順鉬(cisplatin)、卡鉬定(carboplatin)、和奧沙利鉬(oxaliplatin);抗生素(antibiotics)，例如包括放線菌素D(actinomycin D)、博來霉素(bleomycin)、絲裂霉素C (mitomycin C)、阿霉素(adriamycin)、道諾魯比辛(daunorubicin)、埃達(dá)魯比辛(idarubicin)、阿德力霉素(doxorubicin)、和聚乙二醇脂質(zhì)體阿德力霉素(pegylated liposomal doxorubicin)；焼基化劑(alkylatingagents)，如霉法蘭(melphalan)、氮芥苯丁酸(chlorambucil)、硫酸布他卡因(busulfan)、沙奧特帕(thiotepa)、依弗酰胺(ifosfamide)、卡氮芥(carmustine)、環(huán)己亞硝(Iomustine)、司莫司汀(semustine)、鏈球霉素(streptozocin)、·達(dá)卡巴仁(decarbazine)、和環(huán)憐酸胺(cyclophosphamide);沙利竇邁(thalidomide)和相關(guān)類似物，例如包括CC-5013和CC-4047 ;蛋白酪胺酸激酶抑制劑，例如包括甲磺酰伊麻替尼普(imatinib mesylate)、吉非替尼(gefitinib)、達(dá)沙替尼(dasatinib)、埃羅替尼(erlotinib)、拉帕替尼(Iapatinib)、舒尼替尼(sunitinib)、尼羅替尼(nilotinib)、以及索拉非尼(sorafenib);抗體，例如包括曲妥珠單抗(trastuzumab)、利妥西單抗(rituximab)、西妥昔單抗(cetuximab)、和貝伐珠單抗(bevacizumab);邁杜蔥酮(mitoxantrone);地塞米松(dexamethasone);普賴松(prednisone);以及替莫唑胺(temozolomide)。為實(shí)行本發(fā)明所述的方法，上述醫(yī)藥組成物可經(jīng)由口服、非口服、噴霧吸入、局部、經(jīng)直腸、經(jīng)鼻、舌下、陰道、或經(jīng)由植入型藥盒(implanted reservoir)等方式投藥。于此使用的「非口服」(parenteral)是指皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射、動(dòng)脈內(nèi)注射、關(guān)節(jié)液內(nèi)注射、胸腔內(nèi)注射、脊髓內(nèi)注射、疾病部位內(nèi)注射、及顱內(nèi)注射或注入技術(shù)。無菌可注射的組成物，例如無菌可注射水性或油性懸浮液，可根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)，使用適合的分散劑或濕潤(rùn)劑(如Tween 80)及懸浮劑來配制。無菌可注射的配制液可為無菌可注射的溶液、或是懸浮于無毒的非口服注射稀釋液或溶劑中，例如1，3_ 丁二醇的溶液?？墒褂玫目山邮茌d體及溶劑為甘露醇(mannitol)、水、林格氏溶液(Ringer’ ssolution)或等滲透的氯化鈉溶液。除此之外，非揮發(fā)油系習(xí)用的溶劑或是懸浮介質(zhì)(例如合成單甘油酯或雙甘油酯)。脂肪酸如油酸(oleic acid)與其甘油酯衍生物，亦可用于制備注射劑，天然醫(yī)藥可接受的用油，例如橄欖油或蓖麻油，特別是其多氧乙基化的型態(tài)，同樣可用于制備。這些油酯溶液或懸浮液，可包含長(zhǎng)鏈醇類稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素、或類似的分散劑。其它常用的界面活性劑，如Tween或Spans、或其它相似乳化劑、或一般醫(yī)藥制造業(yè)所使用于醫(yī)藥可接受的固態(tài)、液態(tài)或其它可用于劑型開發(fā)目的的劑量型式的生物可利用增強(qiáng)劑。用于口服投藥的組成物可為任何一種口服可接受的劑型，包括膠囊、錠片、乳化液與水懸浮液、分散液與溶液，但不限于此。以錠片為例，一般所使用的載體為乳糖或是玉米淀粉，潤(rùn)滑劑(如硬脂酸鎂)亦常被添入其中。以口服膠囊投藥型式而言，可用的稀釋劑包括乳糖與干燥玉米淀粉。當(dāng)以水懸浮液或乳化液經(jīng)口投藥時(shí)，活性成分可懸浮或是溶解于混有乳化劑或懸浮劑的油狀界面中。如果需要，可添加適度的甜味劑、風(fēng)味劑或是色素。鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據(jù)醫(yī)藥劑型領(lǐng)域中已知技術(shù)進(jìn)行制備。例如，此組成物可制備為鹽溶液，應(yīng)用苯甲醇(benzyl alcohol)或其它適合的防腐劑、增強(qiáng)生物可利用性的促吸收劑、碳氟化合物、及/或該領(lǐng)域中其它技術(shù)中已知的溶解劑或分散劑。含小檗堿化合物的醫(yī)藥組成物，亦可以栓劑方式進(jìn)行直腸投藥。醫(yī)藥組成物的載體必須為「可接受性」，即其必須與組成物的活性成份兼容(較佳是能穩(wěn)定活性成份)，并且不能對(duì)被治療的試體造成傷害。一種或多種能與小檗堿化合物形成溶解性更佳的復(fù)合物的溶解劑(如環(huán)糊精)，也可用為傳遞活性化合物的醫(yī)藥載體。其它載體舉例包括膠質(zhì)氧化硅、硬脂酸鎂、纖維素、月桂硫酸鈉與D&C黃色10號(hào)。
以下由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟習(xí)本技術(shù)的人士，可由本說明書所揭示的內(nèi)容，輕易地了解本發(fā)明的其它優(yōu)點(diǎn)與功效，亦可了解以下實(shí)施例僅為說明用，并非用于限制本發(fā)明范圍。本發(fā)明亦可由其它不同的具體實(shí)施例加，以施行或應(yīng)用，本說明書中的各項(xiàng)細(xì)節(jié)，亦可基于不同觀點(diǎn)與應(yīng)用，在不悖離本發(fā)明的精神下進(jìn)行各種修飾與變更。黃連萃取物的制備取11. 25克黃連藥材(Coptis chinensis),加入I. 2公升的水，煮沸萃取持續(xù)I小時(shí)后，大約可得到450ml的萃取產(chǎn)物，分成數(shù)份儲(chǔ)存于4°C。除上述直接儲(chǔ)存水萃產(chǎn)物于4 °C之外，亦可使用冷凍干燥儲(chǔ)存萃取產(chǎn)物。于進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)前，儲(chǔ)存于4°C的萃取產(chǎn)物先行使用0. 22 y m的濾膜過濾。小檗堿溶液的制備使用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMS0)作為溶劑，溶解小檗堿氯化物(berberine chloride,購自Sigma, B3251),以制備不同濃度的小檗喊溶液。細(xì)胞培養(yǎng)自中國(guó)臺(tái)灣生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and ResearchCenter,BCRC)購得非小細(xì)胞型肺癌(non-small cell lung cacinoma,NSCLC)細(xì)胞株A549、NCI-H460與NCI-H520以及正常肺細(xì)胞株MRC5，其中A549以F12K培養(yǎng)基(21127，GIBC0,Carlsbad, U. S. A.)培養(yǎng)，NCI-H460 與 NCI-H520 兩者皆以 RPMI 1640 培養(yǎng)基(23400，GIBC0，Carlsbad, U. S. A.)陪養(yǎng)，MRC5 則以 MEM 培養(yǎng)基(41500, GIBC0, Carlsbad, U. S. A.)培養(yǎng)。上述所有培養(yǎng)基皆含有10% FBS (10437，GIBC0, Carlsbad, U. S. A.)，且所有細(xì)胞培養(yǎng)皆在37°C>5% CO2 的培養(yǎng)箱(Thermo forma 370，Waltham, U. S. A.)中進(jìn)行。高效液相層析分析使用裝配有逆相管柱(reverse-phaseZorbax ODS TT , 1 50mm x 4. 6mm, 5 U m)的高效液相層析系統(tǒng)(High-performance liquid chromatography system, HPLC system,Hitachi)，于管柱溫度為40°C下進(jìn)行分析。樣本注射體積為10 u 1，流速為I. 0ml/min,并測(cè)量流出液的UV吸收值(346nm)。憐酸氫鉀(Potassiumhydrogen phosphate, I. 36g)溶解于 1000ml 水，并以憐酸(orthophosphoric acid)將pH值調(diào)整至pH 2. 5,以作為緩沖液A,其中緩沖液A與緩沖液B (乙腈)濃度比例調(diào)整為0. 01min，A B = 80 20 — 20min，A B = 50 50 — 26min，A : B = 80 : 20。將上述小檗堿溶液與黃連萃取物進(jìn)行HPLC分析，其結(jié)果顯示小檗堿吸收峰的滯留時(shí)間大約在9. 5分,而黃連萃取物在滯留時(shí)間大約在9. 5分的位置同樣具有一大片吸收峰，此表示本發(fā)明的黃連萃取物含有大量的小檗堿化合物。統(tǒng)計(jì)分析以下測(cè)試?yán)玫臄?shù)據(jù)，全數(shù)皆以平均值土標(biāo)準(zhǔn)差(mean土SE)表示，并使用SPSS軟件，以學(xué)生氏測(cè)試法(Student，s test)與變異數(shù)分析法(Analysis of variance,AN0VA)判定各群組的差異顯著與否，其中當(dāng)P值小于0. 05時(shí)，則視為顯著差異。測(cè)試?yán)患?xì)胞增殖測(cè)試于24孔盤中，每孔培養(yǎng)I X IO4個(gè)待測(cè)細(xì)胞，待培養(yǎng)16小時(shí)后，將黃連萃取物或不同濃度的小檗堿溶液等待測(cè)樣本直接加入24孔盤內(nèi)，再于37°C下培養(yǎng)24小時(shí)、48小時(shí)與72小時(shí)。MTT分析法使用經(jīng)0. 22 μ m過濾膜過濾的PBS，配置出濃度為5. 5mg/ml的溴噻唑藍(lán)溴化四唑(Thiazolyl blue tetrazolium bromide, MTT, m5655, Sigma, St. Louis, U. S. A.)溶液。配置所得的MTT溶液，取50 μ I加入經(jīng)過24小時(shí)、48小時(shí)與72小時(shí)培養(yǎng)的Α549、NCI-H460、NCI-H520與MRC5等細(xì)胞株的24孔盤內(nèi)，再于37°C下培養(yǎng)2小時(shí)后，移除所有的培養(yǎng)液。每孔再加入500 μ 1DMS0,以溶解MTT與粒線體中去氫酶反應(yīng)所得的產(chǎn)物甲臜(formazan)。以 吸液器反復(fù)吸吐使甲臜完全溶解，將200 μ I所得溶液轉(zhuǎn)至96孔ELISA盤，使用微孔盤測(cè)量?jī)x(Microplate Autoreader EL311, Bio-Tek Instruments, Winooski, U.S.A.)偵測(cè)吸光值(0. D. 570nm)，其結(jié)果如圖I、圖2A、圖2B及圖2C所示。參考圖1，其為黃連萃取物(0. 6% v/v)對(duì) A549、NCI-H460、NCI-H520 與 MRC5 等細(xì)胞株的測(cè)試結(jié)果，其中*代表P < 0. 05。由圖I可知添加黃連萃取物經(jīng)過48小時(shí)培養(yǎng)后，便可以明顯看到相較于正常細(xì)胞的存活率，癌細(xì)胞的存活率明顯下降，持續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)后，癌細(xì)胞的存活率更是顯著下降，此表示本發(fā)明的黃連萃取物可以在不影響正常細(xì)胞的前提下毒殺癌細(xì)胞，使其存活率下降。參考圖2A，其為小檗堿溶液(3μΜ、6μΜ、9μΜ、12μΜ)與Α549細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的測(cè)試結(jié)果。如圖2Α所示，對(duì)于Α549細(xì)胞株的抑制隨著小檗堿溶液的濃度增加而增加，且其半抑制濃度(halfmaximal inhibitory concentration, IC50)約為 7 μ Μ。參考圖2Β，其為小檗堿溶液(10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ)與NCI-H460細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的測(cè)試結(jié)果。如圖2Β所示，對(duì)于NCI-H460細(xì)胞株的抑制隨著小檗堿溶液的濃度增加而增加，且其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約為40 μ Μ。參考圖2C，其為小檗堿溶液(10μΜ、20μΜ、30μΜ、40μΜ)與NCI-H520細(xì)胞株培養(yǎng)48小時(shí)后的測(cè)試結(jié)果。如圖2C所示，對(duì)于NCI-H520細(xì)胞株的抑制隨著小檗堿溶液的濃度增加而增加，且其半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration, IC50)約為20 u M0由圖2A、圖2B與圖2C可知小檗堿化合物類似于本發(fā)明黃連萃取物，同樣可以毒殺癌細(xì)胞，使其存活率下降。萘胺藍(lán)染劑分析使用萘胺藍(lán)染劑(Trypanblue, T10282, Invitrogen, Carlsbad, U.S. A.),對(duì)經(jīng)過黃連萃取物(0.6% v/v)處理的A549細(xì)胞株染色，然后將細(xì)胞染色液轉(zhuǎn)至細(xì)胞計(jì)數(shù)腔室玻片上(Countess Cell Counting Chamber Slide, C10228, Invitrogen, Carlsbad,U. S. A.),再使用自動(dòng)化細(xì)胞計(jì)數(shù)器(Countess Automated Cell Counter, C10227,Invitrogen, Carlsbad, U. S. A.)測(cè)量細(xì)胞數(shù)目，其結(jié)果如圖3所示。參考圖3，其為黃連萃取物(0. 6% v/v)對(duì)A549細(xì)胞株的測(cè)試結(jié)果，其中*代表p <0. 05。由圖3可知添加黃連萃取物經(jīng)過48小時(shí)培養(yǎng)后，便可以明顯看到相較于無處理組(控制組，ctrl)的存活率，處理組癌細(xì)胞的存活率明顯下降，持續(xù)培養(yǎng)至72小時(shí)后，癌細(xì)胞的存活率更是顯著下降，此結(jié)果同于圖1，因此更加證明本發(fā)明的黃連萃取物可以在不影響正常細(xì)胞的前提下毒殺癌細(xì)胞，使其存活率下降。測(cè)試?yán)?xì)胞周期測(cè)試于IOcm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 X IO5個(gè)A549細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)(Iogarithmical)生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞數(shù)目便足以進(jìn)行分析。待16小時(shí)后，此細(xì)胞以黃連萃取物處理24小時(shí)、48小時(shí)與72小時(shí),再以胰蛋白酶處理(trypsinization)以收集細(xì)胞。使用冰乙醇(70% )于-20°C下將細(xì)胞固定過夜后，使用PBS清洗細(xì)胞以移除乙醇。將PI染色緩沖液(PBS :RNasedOu g/ml) PI (I u g/ml) = 97 I 2)加入細(xì)胞液，其中每 I X IO6 個(gè)細(xì)胞添加Iml PI染色緩沖液，以確保DNA完全染色，于37°C下避光持續(xù)震蕩染色30分鐘。使用尼龍篩(35pm)過濾細(xì)胞，防止細(xì)胞群集。然后，將樣本移入圓底管并盡快以流式細(xì)胞儀(FACSCalibur)分析，并制訂單細(xì)胞閘以排除聚集的細(xì)胞。每樣本收集一萬五千個(gè)細(xì)胞，以完成細(xì)胞周期分布，再使用Modfit軟件(Verity Software House, Topsham, U. S. A.),計(jì)算不同細(xì)胞周期階段的百分比，其結(jié)果如圖4所示。參考圖4，其為黃連萃取物處理后A549細(xì)胞株的細(xì)胞周期分析結(jié)果，其中*代表p
<0. 05，*林代表p < 0. 001。由圖4可知黃連萃取物處理24小時(shí)后，A549細(xì)胞株的細(xì)胞周期明顯阻斷在Gl階段，而黃連萃取物處理48小時(shí)后，A549細(xì)胞株的細(xì)胞周期則明顯阻斷于G2階段，此表示本發(fā)明的黃連萃取物可抑制癌細(xì)胞持續(xù)分裂。測(cè)試?yán)鞣绞宵c(diǎn)墨測(cè)試于IOcm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3 X IO5個(gè)A549細(xì)胞株，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)(Iogarithmical)生長(zhǎng)期時(shí)，細(xì)胞數(shù)目便足以進(jìn)行分析。細(xì)胞以IC5tl劑量的黃連萃取物或小檗堿處理48小時(shí)，收集細(xì)胞并以 RIPA 緩沖液(IOmM Tris (pH 7. 4), 150mM NaCl,5mM EDTA(pH 8.0)，0. I % SDS, I % DOS, I % NP40)溶解，再混入蛋白酶抑制劑混合組(protease inhibitorcocktail, Pierce, Rockford, U. S. A.)、憐酸酶抑制劑混合組(phosphatase inhibitorcocktail, Sigma, St. Louis,U. S. A.),而后以 13, 000g、4°C離心 30 分鐘，以將細(xì)胞殘洛離心而沉降于底部，離心后收集上清液，再混入樣本緩沖液(IOOmM Tris-Cl (pH 6. 8),4% (w/v) SDS,0. 2% (w/v)溴酚藍(lán)，20% (v/v)甘油，200mM P -巰基乙醇，儲(chǔ)存于_80°C直至使用為止)。根據(jù)制造商操作手冊(cè)，以BCA蛋白質(zhì)分析套組(BCA protein assay kit, 23250,Thermo Scientific, Waltham, U. S. A.)定量蛋白質(zhì)濃度，每一樣本取20 μ g的蛋白質(zhì)，以10%至15%的SDS-PAGE進(jìn)行電泳，SDS-PAGE的濃度系根據(jù)與偵測(cè)的蛋白質(zhì)的分子量決定。而后將SDS-PAGE，以400mA轉(zhuǎn)印至硝酸纖維(nitrocellulose，NC)膜，持續(xù)I至2小時(shí)。轉(zhuǎn)印膜置于含5 % 脫脂奶粉的 TBST (Tris Buffered Saline with O. 05 %Tween-20)中，在室溫下浸泡I小時(shí)。而后，轉(zhuǎn)印膜以TBST清洗兩次，每次五分鐘，以去除多余的牛奶，而后在4°C下，將轉(zhuǎn)印膜泡在適當(dāng)稀釋之一級(jí)抗體并緩和震蕩持續(xù)過夜。轉(zhuǎn)印膜以TBST清洗三次，去除過多一級(jí)抗體后，再將轉(zhuǎn)印膜浸泡于對(duì)應(yīng)HRP鍵結(jié)的二級(jí)抗體持續(xù) I 小時(shí)。最后，膜上添加 HRP 基質(zhì)(WBKLS0050, Millipore, Billerica, U. S. A.)，以顯現(xiàn)蛋白質(zhì)表現(xiàn)圖型，再利用影像系統(tǒng)(Fuji LAS-3000imaging system)抓取影像,而后使用軟件(Multi Gauge software (FUJIFILM, Tokyo, Japan)對(duì)墨點(diǎn)影像定量,其結(jié)果如圖 5A、圖5B、圖5C、圖5D、圖5E、圖5F、圖5G、圖5H所示。
參考圖5A、圖5B、圖5C、5E、圖5F、圖5G、圖5H，其分別為黃連萃取物處理后 CDK4、CDK6、cyclin D3(G1/S 調(diào)控蛋白)、cyclin BI (G2/M 調(diào)控蛋白)、Vimentin (間葉標(biāo)幟蛋白)與ALDH1A1、i3_catenin、ABCG2(三者為癌干細(xì)胞標(biāo)幟蛋白)的表現(xiàn)結(jié)果，其中* 代表 P < 0. 05, ** 代表 P < 0. 01, *** 代表 P < 0. 001,胞內(nèi)控制組(internal ctrl)為β-肌動(dòng)蛋白。由圖5Α、圖5Β、圖5C、5Ε、圖5F、圖5G、圖5H可知黃連萃取物處理后，上述
調(diào)控蛋白與標(biāo)幟蛋白的表現(xiàn)量皆顯著減少，此表示本發(fā)明的黃連萃取物可以抑制癌干細(xì)胞及其轉(zhuǎn)移作用。測(cè)試?yán)拇┛?Transwell)分析于24孔穿孔盤(Coming, Lowell,U. S. A.)中，每孔使用不含血清的培養(yǎng)基100 μ I培養(yǎng)2Χ IO4個(gè)Α549細(xì)胞，每一 6. 5mm嵌插件的上方部分設(shè)有孔，尺寸為8 μ m，底間隔填滿有500μ I含10% FBS的F12K培養(yǎng)基。以黃連萃取物(0.6% v/v)處理四小時(shí)后，以對(duì)甲醒(paraformaldehyde, PFA)固定細(xì)胞10分鐘,然后使用4' ,6_ 二脒_(dá)2_苯基Π引哚(DAPI PBST, = I 10000,PBST =Phosphate Buffered Saline with 0. 2% Tween-20)染色10分鐘。嵌插件以PBST清洗三次每次10分鐘，而后以活細(xì)胞影像系統(tǒng)(Leicajetzlar，Germany)觀察，并用 MetaXpress 軟件(Molecular Devices, Sunnyvale, U. S. A.)定出細(xì)胞數(shù)量，其結(jié)果如圖6所示。參考圖6，其為黃連萃取物處理后全數(shù)15個(gè)顯微鏡觀察視野中單位視野的細(xì)胞數(shù)量，其中***代表P < 0. 001。由圖6結(jié)合圖5E，可知相較于控制組，黃連萃取物可以明顯減少癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。測(cè)試?yán)鍌?cè)族群(Side population)分析于IOcm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3X IO5個(gè)A549細(xì)胞株，獲得足以進(jìn)行分析的細(xì)胞數(shù)目。細(xì)胞以IC5tl劑量的黃連萃取物或小檗堿處理48小時(shí)，以胰蛋白酶處理收集細(xì)胞后離心，細(xì)胞重新懸浮于含2% FBS的培養(yǎng)基，其中每一毫升含有I X IO6個(gè)細(xì)胞。將50 μ M作為阻斷劑的 reserpine (Sigma, St. Louis, U. S. A.)連同 Hoechst33342 染劑(Invitrogen, Carlsbad,U. S. A. , 5 μ g/ml)加入細(xì)胞，或上述染劑單獨(dú)加入細(xì)胞。所得樣本在37°C下緩和震蕩培養(yǎng)2小時(shí)，以確保染色均勻。以PBS清洗細(xì)胞后，使用PI染色(20ng/ml)判定活/死細(xì)胞。為了設(shè)定熒光補(bǔ)償，亦制備單染色及無染色群組。以35 尼龍篩過濾樣本，防止細(xì)胞群聚。PI陽性反應(yīng)的死細(xì)胞首先排除，以避免偽陽性，然后赫斯特藍(lán)(Hoechst blue)與赫斯特紅點(diǎn)繪制可判定側(cè)族群。對(duì)于樣本兩組群(reserpine添加族群與無reserpine添加組群)減少的區(qū)域則定亦為側(cè)族群，側(cè)族群的百分比則以Flowjo軟件(TreeStar,Ashland,U. S. A.)分析，其結(jié)果如圖7A與7B所示。參考圖7A與圖7B，其分別為黃連萃取液與小檗堿溶液處理后的SP分析結(jié)果。由圖7A與圖7B可知經(jīng)過黃連萃取液與小檗堿溶液處理后，側(cè)族群大幅減少；結(jié)合參考圖5F、圖5G、圖5H，可知黃連萃取液可以抑制癌干細(xì)胞。上述實(shí)施例僅是為了方便說明而舉例而已，本發(fā)明所主張的權(quán)利范圍自應(yīng)以申請(qǐng) 的權(quán)利要求范圍所述為準(zhǔn)，而非僅限于上述實(shí)施例。
權(quán)利要求
1.一種抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，包括 一小檗堿化合物；以及 一醫(yī)藥上可接受性載體。
2.如權(quán)利要求I所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該小檗堿化合物為小檗堿氯化物。
3.如權(quán)利要求I所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該小檗堿化合物是包含于一黃連萃取物中。
4.如權(quán)利要求3所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該黃連萃取物是一黃連水萃取物或由該黃連水萃取物干燥而得。
5.如權(quán)利要求4所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該黃連水萃取物提供一黃連藥材，添加50倍至200倍該黃連藥材重量的水，形成一混合物后，對(duì)該混合物加熱萃取而得。
6.如權(quán)利要求5所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該萃取的時(shí)間為30分鐘至2小時(shí)。
7.如權(quán)利要求5所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該混合物加熱至體積成為原始體積的四分之一至二分之一。
8.如權(quán)利要求I所述的抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物，其中，該癌干細(xì)胞或該癌細(xì)胞為非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞。
9.一種使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途。
10.如權(quán)利要求9所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該小檗堿化合物為小檗堿氯化物。
11.如權(quán)利要求9所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該小檗堿化合物是包含于一黃連萃取物中。
12.如權(quán)利要求11所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該黃連萃取物是一黃連水萃取物或由該黃連水萃取物干燥而得。
13.如權(quán)利要求12所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該黃連水萃取物提供一黃連藥材，添加50倍至200倍該黃連藥材重量的水，形成一混合物后，對(duì)該混合物加熱萃取而得。
14.如權(quán)利要求13所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該萃取的時(shí)間為30分鐘至2小時(shí)。
15.如權(quán)利要求13所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該混合物加熱至體積成為原始體積的四分之一至二分之一。
16.如權(quán)利要求9所述的使用黃連萃取物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑的用途，其中，該癌干細(xì)胞或該癌細(xì)胞為非小細(xì)胞型肺癌細(xì)胞。
全文摘要
一種抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的醫(yī)藥組成物及其應(yīng)用，該醫(yī)藥組成物包括一小檗堿化合物；以及一醫(yī)藥上可接受性載體。該應(yīng)用為使用小檗堿化合物制造抑制癌干細(xì)胞生長(zhǎng)或癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的藥劑。
文檔編號(hào)A61P35/00GK102824344SQ20111016608
公開日2012年12月19日 申請(qǐng)日期2011年6月14日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月14日
發(fā)明者謝秀梅, 李政育, 沈志謙, 王天駿 申請(qǐng)人:謝秀梅, 李政育