技術(shù)特征：

1.一種新的H5亞型禽流感卵黃抗體代替血清抗體監(jiān)測的方法，其特征在于：

1)卵黃原料采集步驟

雞蛋采集是在養(yǎng)禽場中隨機采集雞蛋20枚或以上，保證采集的雞蛋來自整個雞群的分散度；將禽蛋用鑷子在殼上輕輕敲開直徑約1cm的小洞，撕開殼膜將蛋清完全倒出，再打開蛋殼將蛋黃完整倒入培養(yǎng)皿，進而挑開卵黃囊，用注射器直接避開表面蛋清抽取卵黃，將抽取到的卵黃注入到小燒杯中，玻棒攪勻使全部提取卵黃充分混勻，備用；

2)卵黃抗體提取

A、磷酸鹽緩沖液提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，再加入2ml磷酸鹽緩沖液，充分振蕩混勻，室溫放置1h，得到渾濁的卵黃抗體提取液A，備用；

B、氯仿提取卵黃中抗體

吸取2ml提取卵黃加入離心管中，加入2ml磷酸鹽緩沖液，混合后加入4ml氯仿，充分振蕩混勻，室溫放置1h，期間攪拌混勻3次，再通過3000r/min離心10min，出現(xiàn)分層，上層為卵黃抗體提取液B，分離備用；

3)兩種提取方式卵黃液的混合

將步驟2所得到的卵黃抗體提取液A與B按等量比例混合得混合液，即為監(jiān)測用卵黃抗體樣品；

4)血凝試驗

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS，吸取一定倍數(shù)稀釋的抗原25μl加于第1列孔，充分混合后移出25μl至第2列孔，依次類推做等量倍比稀釋至第11列孔，第11列孔棄去25μL；設(shè)立第12列孔為紅細胞對照；每孔再加25μl PBS；每孔各加入0.75％雞紅細胞懸液25μl；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；觀察數(shù)次，直至對照的紅細胞全部沉淀為一個圓點，將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無淚珠樣流掛，根據(jù)血凝圖像判定結(jié)果；血凝效價高于2¹¹時可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以出現(xiàn)完全凝集的抗原最大稀釋度為該抗原的血凝效價，此時血凝效價為2ⁿ，n>11，再根據(jù)初始稀釋度計算抗原的血凝單位；并根據(jù)測定的抗原的血凝效價，計算4個血凝單位抗原的稀釋倍數(shù)，制備4個血凝單位抗原；

5)血凝抑制試驗與效價確認(rèn)

在微量血凝板上，自第1列孔至第12列孔，每孔加25μl PBS；

將步驟3的混合液，取體積25μl于第1列孔，混勻后由左向右順序倍比稀釋至第11列孔，最后棄去25μl；第1列孔至第12列孔分別加25μl含4個血凝單位的抗原；立即置微型振蕩器上混合1min，或手持血凝板繞圓圈混勻1min；在室溫下作用30min，或在4℃下作用60min；每孔加0.75％雞紅細胞懸液25μl；混合后置室溫下作用40min或在4℃下作用60min，此時對照的紅細胞已沉淀為一個圓點；血凝抑制效價高于2¹¹時可繼續(xù)增加稀釋的孔數(shù)，以完全抑制紅細胞凝集的最大稀釋倍數(shù)為該混合液的血凝抑制效價，測定抗體效價加上修訂系數(shù)即為卵黃抗體替代血清抗體的血凝抑制效價；

6)主要試劑及配制

PBS：

配制20倍PB：稱量5.157g Na₂HPO₄.12H₂O和0.874g NaH₂PO₄.2H₂O，加蒸餾水至100ml；配制1倍PBS：量取50ml 20倍PB，加入8.5g NaCl，加蒸餾水至1000ml；用NaOH或HCl調(diào)pH值至7.2；121℃高壓蒸汽滅菌15min；

0.75％雞紅細胞懸液：

采集至少3只SPF公雞或無疫病抗體的健康公雞的血液與等體積紅細胞保存阿氏液混合，用前述PBS液洗滌3次，每次均以1000r/min離心10min，洗滌后用前述PBS配成0.75％紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆茫?.75％均為體積比。

2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中所述抗原是H5亞型禽流感抗原，步驟3中的按等量比例，是卵黃抗體提取液A：50％，卵黃抗體提取液B：50％。

3.如權(quán)利要求1所述的制備方法，前述步驟6中的阿氏液配方為：

紅細胞保存阿氏液：稱葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g，加蒸餾水至100ml，溶解后調(diào)pH值至6.1，115℃高壓蒸汽滅菌20min，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于：

所述步驟5得到的血凝抑制效價，加上修訂系數(shù)，修訂系數(shù)受疫苗、免疫時期、免疫程序等影響，修訂后的效價作為卵黃抗體替代血清抗體的H5亞型禽流感血凝抑制效價。