本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

桑白皮為?？浦参锷?拉丁學(xué)名：Morus alba L.)的干燥根皮，別名桑根白皮、桑根皮、桑皮、白桑皮，秋末落葉時(shí)至次春發(fā)芽前采挖根部，刮去黃棕色粗皮，縱向剖開(kāi)，剝?nèi)「?，曬干。含黃酮類成分：桑素(mulberrin)，桑皮色烯素(mulberrochromene)，環(huán)桑素(cyclomulberrin)，環(huán)桑皮色烯素(cyclomulberro-chromene)，桑根皮素(morusin)，環(huán)桑皮素(cyclomorusin)，氧化二氫桑根皮素(oxydihydromomsin)，桑黃酮(kuwanon)A、B、C、D、E、F、G(即albanin F，moracenin B)、H(即albanin G，moracenin A)、I、K、L、Y、Z，桑白皮素(moracenin)C、D，桑根酮(sffnggenone)A～P；又含桑呋喃(mulberrofuran)A、B、C、K、N、0、M、P、Q，樺皮酸；香豆素類：5,7-羥基香豆素(5,7-dihydmxycoumarin)傘形花內(nèi)酯(umbelliferone)、東莨菪內(nèi)酯(即東莨菪素，scopoletin)、莨菪內(nèi)酯等成分。多糖類：粘液素、桑多糖、甲克素、殼聚糖；還含α-及β-香樹(shù)精、谷固醇、揮發(fā)油、鞣質(zhì)等。具有降壓、利尿、鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、抑制血小板聚集、降糖之功效，對(duì)人子宮頸癌JTC-26株的抑制率為70％左右，具有誘生干擾素作用。

LPS是內(nèi)毒素的主要成分，內(nèi)毒素進(jìn)入機(jī)體后通過(guò)誘發(fā)過(guò)度的炎癥反應(yīng)可引起急性肺損傷(acute lung injury，ALI)，LPS誘導(dǎo)的ALI是嚴(yán)重創(chuàng)傷或感染后出現(xiàn)最早、發(fā)病率最高的并發(fā)癥之一，肺血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是LPS導(dǎo)致急性肺損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此研究血管內(nèi)皮的受損及其修復(fù)對(duì)ALI的治療和防御具有顯著意義。內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)受損后會(huì)分泌多種細(xì)胞因子、炎癥因子，如趨化因子(MCP-1)、粘附因子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)、炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)等。同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞也能夠釋放各種活性物質(zhì)，協(xié)調(diào)血管舒張因子及收縮因子之間的平衡，如縮血管物質(zhì)ET-1及擴(kuò)血管物質(zhì)NO，ET-1/NO平衡的破壞是動(dòng)脈內(nèi)皮受損的顯著特征。iNOS是一種在炎癥因子刺激下產(chǎn)生的一種物質(zhì)，它的含量可以代表血管損傷的程度，最近的研究表明，活化的AMPK能夠顯著改善TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷中NF-κB的核移位，5-aminoimidazole-4-carboxamide-1-β-d-ribofuranoside(AICAR)也能夠通過(guò)激活A(yù)MPK抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。但至今未見(jiàn)有從桑白皮中提取有效活性部位桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)并用于制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷及其制備方法與應(yīng)用，可有效解決從桑白皮中提取桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)，以及在制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用問(wèn)題。

本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，所述的桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷是從桑白皮中提取的有效活性成分，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1所示，該桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷的制備方法是：

將桑白皮煎煮提取，提取液減壓濃縮得干燥物，干燥物加蒸餾水混懸，離心除去不溶物，得上清液；上清液上樹(shù)脂柱，依次用水、質(zhì)量濃度30％乙醇梯度洗脫，各個(gè)梯度洗脫液濃縮至干，干物用甲醇溶解，再加入硅膠，得載有樣品的硅膠；將載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，進(jìn)行梯度洗脫，將收集的流份經(jīng)過(guò)TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣A1、A2、A3；總樣A3用甲醇溶解，上Toyopearl HW-40柱，用甲醇洗脫，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，得到子流份A3-1，減壓濃縮、干燥，用甲醇溶解，上ODS柱，用甲醇洗脫，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，減壓濃縮，得到目標(biāo)成分棕色粉末桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(SP-19)：

該桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷有保護(hù)作用，有效用于制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷的藥物，實(shí)現(xiàn)桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷在制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明是從桑白皮中提取的一種有效活性成分桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)，其制備方法新穎獨(dú)特，易操作使用，其制備的桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷作為唯一活性部位在制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用，開(kāi)拓了桑白皮的新用途，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明的桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)的分子結(jié)構(gòu)圖。

圖2為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷的影響圖。

圖3為本發(fā)明AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19的影響圖。

圖4為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞TNF-α的影響圖。

圖5為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞IL-1β的影響圖。

圖6為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞IL-6的影響圖。

圖7為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ET-1的影響圖。

圖8為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞NO的影響圖。

圖9為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞iNOS的影響圖。

圖10為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ICAM-1的影響圖。

圖11為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞VCAM-1的影響圖。

圖12為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞E-selectin的影響圖。

圖13為本發(fā)明SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞MCP-1的影響圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合具體情況對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。

本發(fā)明在具體實(shí)施中，所述的桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷是從桑白皮中提取的有效活性成分，分子結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1所示，該桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷的制備方法是：

將桑白皮2.4kg每次用其重量8-12倍的蒸餾水煎煮提取3次，每次60min，合并提取液，減壓濃縮得干燥物，加干燥物重量體積2-3倍的蒸餾水混懸，重量體積是指固體物以g計(jì)，液體以mL計(jì)，6000r/min離心除去不溶物，得上清液；取7.0L Diaion HP-20大孔吸附樹(shù)脂填料，用質(zhì)量濃度95％乙醇浸泡24h裝柱，用蒸餾水洗至無(wú)醇味，上清液濃縮至50℃相對(duì)密度1.2-1.4，上樹(shù)脂柱，依次用水、質(zhì)量濃度30％乙醇洗脫，每個(gè)梯度洗脫液用量為10個(gè)柱體積，流速為2BVh-1，各個(gè)梯度洗脫液濃縮至干，得到30％乙醇洗脫組分和粗提物，加入50mL甲醇溶解，再加入過(guò)160-200目篩的硅膠40g，45℃減壓回收甲醇，得到載有樣品的硅膠；取過(guò)200-300目篩的硅膠500g，加入二氯甲烷800mL，轉(zhuǎn)移到80cm長(zhǎng)×8cm內(nèi)徑的色譜柱中，用二氯甲烷充實(shí)柱床，將液面降至距硅膠面5cm處，再將上述載有樣品的硅膠加入到色譜柱的液面上，依次加入體積比為100:3、100:5、100:10梯度的二氯甲烷-甲醇，每個(gè)梯度4L，進(jìn)行梯度洗脫，流速為10mL·min^-1，每100mL作為1個(gè)流份收集，將收集的流份經(jīng)過(guò)TLC分析，合并含有目標(biāo)成分的流份，減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的總樣A1、A2、A3，所述的TLC分析中使用的吸附劑為GF254，展開(kāi)劑為體積比20:1-5:1的二氯甲烷-甲醇；總樣A1用質(zhì)量濃度30％甲醇溶解，上Toyopearl HW-40C柱，用質(zhì)量濃度30％甲醇洗脫，流速為1mL·min^-1，每2mL為一個(gè)流份，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，得到子流份A1-1、A1-2；總樣A2用質(zhì)量濃度35％甲醇溶解，上Toyopearl HW-40柱，用質(zhì)量濃度35％甲醇洗脫，流速為1mL·min^-1，每2mL為一個(gè)流份，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，得到子流份A2-1、A2-2；總樣A3用質(zhì)量濃度50％甲醇溶解，上Toyopearl HW-40柱，用質(zhì)量濃度50％甲醇洗脫，流速為1mL·min^-1，每2mL為一個(gè)流份，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，得到子流份A3-1；所得各個(gè)子流份45℃減壓濃縮，得到含有目標(biāo)成分的樣品；子流份A3-1用質(zhì)量濃度26％甲醇溶解，上ODS柱，用質(zhì)量濃度26％甲醇洗脫，流速為5mL·min^-1，每10mL為一個(gè)流份，薄層檢識(shí)，合并含相同的流份，流份6-22在45℃減壓濃縮，得到目標(biāo)成分棕色粉末桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(SP-19)：

該桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷有保護(hù)作用，有效用于制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷的藥物，實(shí)現(xiàn)桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷在制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明方法從桑白皮中提取的有效活性成分，經(jīng)液相色譜法測(cè)定，其結(jié)構(gòu)式如圖1所示，命名為桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)，具有對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷有保護(hù)作用，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到了充分證明，有關(guān)資料如下：

材料與方法

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1細(xì)胞

HPAEC細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)

將HPAEC細(xì)胞培養(yǎng)在含體積分?jǐn)?shù)為10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中(含青霉素和鏈霉素100kU·L^-1)，置于37℃、5％CO₂飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3實(shí)驗(yàn)藥物：本發(fā)明方法制備的桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)。

1.4試劑

脂多糖(sigma)；醋酸地塞米松片，國(guó)藥準(zhǔn)字H12020686，生產(chǎn)批號(hào)13050102，(天津天藥藥業(yè)股份有限公司)；人TNF-α、IL-1β和IL-6ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1 ELISA(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司)；NO，iNOS試劑盒(南京建成)；1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)；胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)；水為超純水；PBS緩沖液等為自配；總蛋白提取試劑盒、BCA法蛋白定量試劑盒(北京普利來(lái)基因技術(shù)有限公司)；其他各種試劑均為市售分析純。

1.5儀器

Bio Mate 3S紫外分光光度計(jì)(Thermo Fisher Scientific)；AB204-N萬(wàn)分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)；Centrifuge-5804R小型高速低溫冷凍離心機(jī)(Eppendorf公司)；iMARK型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)。二氧化碳培養(yǎng)箱(上海STIK)；超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))；iMARK型酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD公司)；Arium 611 VF超級(jí)組合型超純水器(SARTORIUS)；倒置顯微鏡(Nikon)；PB-10酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、細(xì)胞凍存管(Corning公司)。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 LPS誘導(dǎo)HPAEC細(xì)胞損傷模型的建立

將HPAEC細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，待細(xì)胞貼壁后將原培養(yǎng)基移出，用PBS緩沖液洗一遍，更換不含血清的空白培養(yǎng)基饑餓12h，然后換上含1μg/mL LPS的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。24h后即形成HPAEC細(xì)胞損傷模型。

2.2 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷的影響

將HPAEC細(xì)胞用含10％胎牛血清的1640培養(yǎng)基接種于96孔板，待細(xì)胞完全貼壁后將原培養(yǎng)基移出，用PBS緩沖液洗一遍，更換不含血清的1640培養(yǎng)基饑餓12h后正常組換上新的1640培養(yǎng)基，模型組換上LPS濃度為1μg/mL的培養(yǎng)基，SP-19組換上1μg/mL LPS+SP-19的培養(yǎng)基，SP-19+Compound C組換上1μg/mL LPS+SP-19+Compound C(10μM)的培養(yǎng)基。培養(yǎng)24h后，每孔加入MTT溶液(5mg/mL)20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μL DMSO，震蕩10分鐘，使結(jié)晶物完全溶解。以DMSO調(diào)零，用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔的吸光度A。

2.3實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為5組，正常對(duì)照組(NC)；模型組(M)(用含1μg/mL的LPS培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24h)；地塞米松組(Dex)(地塞米松，0.5μM)；SP-19組(1μg/mL LPS+3μM SP-19)；SP-19+C組(1μg/mL LPS+3μM SP-19+10μM Compound C)。

2.4 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，向預(yù)先包被抗體的微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)恒溫溫浴，加入生物素抗體工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后，加入酶結(jié)合工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后加入底物溶液(TMB)，溫浴后加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中這些炎癥因子的活性。

2.5 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的影響

各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用適當(dāng)?shù)拿浇槿芙庵?，取制備好的?xì)胞總蛋白溶液，用BCA法測(cè)定其蛋白濃度，調(diào)整好蛋白濃度，接著向預(yù)先包被抗體的微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)恒溫溫浴，加入生物素抗體工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后，加入酶結(jié)合工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后加入底物溶液(TMB)，溫浴后加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組中蛋白的表達(dá)量。

2.6 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞趨化因子MCP-1的影響

各組細(xì)胞提取細(xì)胞總蛋白，用適當(dāng)?shù)拿浇槿芙庵?，取制備好的?xì)胞總蛋白溶液，用BCA法測(cè)定其蛋白濃度，調(diào)整好蛋白濃度，接著向預(yù)先包被抗體的微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)恒溫溫浴，加入生物素抗體工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后，加入酶結(jié)合工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后加入底物溶液(TMB)，溫浴后加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組中蛋白的表達(dá)量。

2.7 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ET-1的影響

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，向預(yù)先包被抗體的微孔板中加入標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣本，經(jīng)過(guò)恒溫溫浴，加入生物素抗體工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后，加入酶結(jié)合工作液，恒溫溫浴溫和洗滌后加入底物溶液(TMB)，溫浴后加終止液終止反應(yīng)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度(OD)值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各組中ET-1蛋白的表達(dá)量。

2.8硝酸還原酶法檢測(cè)細(xì)胞上清液中NO的含量

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒的操作檢測(cè)NO的含量。

2.9細(xì)胞上清液中iNOS含量的測(cè)定

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒的操作檢測(cè)iNOS的含量。

注：呈色物摩爾曉光系數(shù)為38.3×10⁶

2.10統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，各組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05表示有顯著性意義，P<0.01表示有極顯著性意義。

3結(jié)果

3.1 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷的影響

與空白對(duì)照組相比，LPS能顯著損傷HPAEC細(xì)胞(P<0.01)；與模型組相比，SP-19能改善HPAEC的細(xì)胞損傷狀況(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表1、圖2

表1 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3.2 AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19的影響

與空白對(duì)照組相比，LPS能顯著損傷HPAEC細(xì)胞(P<0.01)；與模型組相比，SP-19能改善HPAEC的細(xì)胞損傷狀況(P<0.01)，SP-19+C組改善作用消失(P<0.01)，結(jié)果見(jiàn)表2、圖3。

表2 AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3.3 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組TNF-α、IL-1β、IL-6水平極顯著性升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，SP-19能降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)，而SP-19+C組TNF-α、IL-1β、IL-6水平極顯著性升高(P<0.01)，SP-19降低炎癥因子的作用消失，結(jié)果見(jiàn)表3、圖4-6。

表3 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3.4 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ET-1，NO，iNOS的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組ET-1，iNOS水平極顯著性升高(P<0.01)，NO水平顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，SP-19組能降低ET-1，iNOS的水平(P<0.01)，升高NO的水平(P<0.01)；而SP-19+C組ET-1，iNOS水平極顯著性升高(P<0.01)，NO水平顯著降低(P<0.01)，SP-19降低ET-1，iNOS，升高NO的作用消失，結(jié)果見(jiàn)表4、圖7-9。

表4 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ET-1，NO，iNOS的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3.5 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組、SP-19+C組ICAM-1、VCAM-1、E-selectin蛋白的表達(dá)極顯著性升高(P<0.01)；與模型組相比，SP-19能降低ICAM-1、VCAM-1、E-selectin蛋白的表達(dá)(P<0.01)，而SP-19+C組ICAM-1、VCAM-1、E-selectin蛋白的表達(dá)極顯著性升高(P<0.01)，SP-19降低ICAM-1、VCAM-1、E-selectin蛋白表達(dá)的作用消失，結(jié)果見(jiàn)表5、圖10-12。

表5 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞ICAM-1、VCAM-1、E-selectin的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

3.6 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞MCP-1的影響

與空白對(duì)照組相比，模型組MCP-1蛋白的表達(dá)極顯著性升高(P<0.01)；與模型組相比，SP-19能降低MCP-1蛋白的表達(dá)(P<0.01)，而SP-19+C組MCP-1蛋白的表達(dá)極顯著性升高(P<0.01)，SP-19降低MCP-1蛋白的作用消失，結(jié)果見(jiàn)表6、圖12。

表6 SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞MCP-1的影響(n＝3)

注：與正常組相比，*表示P<0.05，**表示P<0.01；與模型組相比，#表示P<0.05，##表示P<0.01。

結(jié)論

急性肺損傷時(shí)血管內(nèi)皮細(xì)胞既是受損的主要靶器官，也是活躍的效應(yīng)細(xì)胞，有研究顯示肺血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary vasculary endothelial cell，PVEC)的改變?cè)诩毙苑螕p傷中十分重要。肺血管內(nèi)皮細(xì)胞在LPS、細(xì)胞因子、氧自由基等的作用下，其通透性增高，分泌和釋放各種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，使得促炎和抗炎介質(zhì)失衡。機(jī)體出現(xiàn)ALI時(shí)多種炎癥因子(如TNF-α、IL-1β、IL-6)、黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)、趨化因子(MCP-1)的表達(dá)均顯著升高。在這些介質(zhì)表達(dá)調(diào)控中，核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活和核移位是關(guān)鍵因素，內(nèi)毒素等作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞使胞漿中NF-κB被其抑制因子IκB釋放，成為其活性形式并迅速發(fā)生核移位，尋找特定靶基因啟動(dòng)子區(qū)的κB位點(diǎn)并與之結(jié)合，指導(dǎo)下游基因的表達(dá)調(diào)控。很多研究表明，阻斷NF-κB通路對(duì)LPS誘導(dǎo)小鼠的急性肺損傷有保護(hù)作用，同時(shí)AMPK也是炎癥調(diào)節(jié)過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵因素。盡管活化的AMPK被證明具有抗炎作用，但是AMPK是否能夠改善LPS誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞損傷呢？同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞也能夠釋放縮血管物質(zhì)ET-1及擴(kuò)血管物質(zhì)NO，ET-1/NO平衡的破壞是動(dòng)脈內(nèi)皮受損的顯著特征。iNOS的含量可以代表血管損傷的程度，故本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6)，黏附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-selectin)，趨化因子(MCP-1)的表達(dá)，ET-1，NO、iNOS的含量，同時(shí)檢測(cè)AMPK拮抗劑Compound C對(duì)其的影響，探討化合物SP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞損傷的影響，初步揭示其作用機(jī)制，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

LPS是細(xì)菌內(nèi)毒素的主要成分，其毒性作用主要通過(guò)激發(fā)宿主細(xì)胞產(chǎn)生過(guò)強(qiáng)的反應(yīng)來(lái)體現(xiàn)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出LPS能夠造成HPAEC細(xì)胞的損傷，而給予SP-19后能夠下注改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。同時(shí)為了闡釋AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19改善細(xì)胞損傷的影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)置了SP-19+C組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，加入AMPK拮抗劑Compound C后，SP-19改善細(xì)胞損傷的活性消失，這也初步證明SP-19改善LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷可能與AMPK/NF-κB通路有關(guān)。

LPS引起的HPAEC細(xì)胞損傷本質(zhì)是過(guò)度炎癥反應(yīng)，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出模型組TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著升高，給予SP-19后TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著下降，而SP-19+C組TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著升高，顯示SP-19降低炎癥因子的作用消失。

NO是內(nèi)皮功能穩(wěn)定的關(guān)鍵，具有舒張血管、抑制血小板的粘附、抑制平滑肌細(xì)胞增殖、聚集以及單核細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞的粘附等作用。而ET-1是目前所知作用最強(qiáng)的長(zhǎng)效血管收縮劑，可以促進(jìn)平滑肌細(xì)胞的增殖和巨噬細(xì)胞聚集、粘附。iNOS是一種在炎癥因子刺激下產(chǎn)生的一種物質(zhì)，其含量的多少可以代表血管損傷的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，LPS可以誘導(dǎo)HPAEC細(xì)胞的損傷，同時(shí)引起NO含量的降低，促進(jìn)ET-1、iNOS的生成，給予SP-19后NO含量顯著升高，ET-1、iNOS含量降低，而SP-19+C組NO含量降低，ET-1、iNOS含量升高，SP-19改善作用消失。

炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1等在ALI等疾病的發(fā)生發(fā)展中起了非常重要的作用，損傷的血管內(nèi)皮細(xì)胞可能通過(guò)增加粘附因子、趨化因子的分泌，促進(jìn)炎性細(xì)胞大量粘附于血管內(nèi)皮管壁并聚集，加速炎癥反應(yīng)，造成血管內(nèi)皮功能障礙，從實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出模型組ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1的表達(dá)顯著升高。給予SP-19后ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1表達(dá)顯著降低，而加入AMPK抑制劑后Compound C，SP-19降低粘附因子及趨化因子的作用消失。

由上述可以看出，本發(fā)明在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上建立LPS誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞損傷模型，篩選SP-19藥物活性，并通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，ET-1、NO、iNOS的含量，各組細(xì)胞中VCAM-1、ICAM-1、E-selectin的水平及MCP-1的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19的影響，研究SP-19對(duì)HPAEC細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制，特別是通過(guò)研究試驗(yàn)，桑白皮有效單體SP-19對(duì)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC)損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制。建立LPS誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞損傷模型，檢測(cè)SP-19對(duì)其的保護(hù)作用，同時(shí)檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)的水平，內(nèi)皮素(ET-1)、一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(iNOS)的含量，各組細(xì)胞的細(xì)胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)、細(xì)胞間粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、E-選擇素(E-selectin)的水平及單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)的表達(dá)，同時(shí)檢測(cè)AMPK拮抗劑Compound C對(duì)SP-19的影響，探討SP-19對(duì)HPAEC損傷的保護(hù)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，LPS能夠造成HPAEC細(xì)胞的損傷(P<0.01)，與正常組相比，模型組細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6的水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)，ET-1的水平及iNOS的含量升高(P<0.01)，NO的含量減少(P<0.01)，粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin及趨化因子MCP-1的水平顯著升高(P<0.01)。與模型組相比，SP-19能夠顯著改善HPAEC的細(xì)胞損傷狀況(P<0.01)，降低TNF-α、IL-1β、IL-6的水平(P<0.05或P<0.01)，降低ET-1的水平及iNOS的含量(P<0.01)，升高NO的含量(P<0.01)，降低粘附分子ICAM-1、VCAM-1、E-selectin及趨化因子MCP-1的水平(P<0.01)。SP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷具有保護(hù)作用，且其作用機(jī)制可能與AMPK/NF-κB通路有關(guān)。

總之，SP-19能夠顯著改善LPS引起的HPAEC細(xì)胞損傷，降低炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，升高NO含量，降低ET-1、iNOS含量，降低ICAM-1、VCAM-1、E-selectin、MCP-1表達(dá)，而加入AMPK抑制劑Compound C后，SP-19改善HPAEC損傷的作用消失，提示SP-19對(duì)LPS誘導(dǎo)的HPAEC細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，且其作用機(jī)制可能與AMPK/NF-κB有關(guān)。有效用于制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷的藥物，實(shí)現(xiàn)桑辛素M-3'-O-β-D-葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱SP-19)在制備治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物中的應(yīng)用，開(kāi)拓了桑白皮的藥用價(jià)值和新用途，是治療LPS誘導(dǎo)的HPAEC損傷藥物上的創(chuàng)新，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。