本發(fā)明屬于化合物的生物活性技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種黃酮類化合物，尤其是涉及一種分離自葛根的黃酮類化合物及其制備方法和應(yīng)用，且該黃酮類化合物在制備降血糖的藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

葛根(Pueraria lobata(Willd.)Ohwi)為藤本植物野葛的塊狀根，野葛廣泛分布于我國除新疆、青海及西藏外的其他地區(qū)。自古以來野葛的莖皮纖維、根等部位均得到廣泛應(yīng)用，據(jù)明朝李時珍《本草綱目》記載，葛根性甘、辛、平、無毒，可用于傷寒、煩躁熱渴、心熱吐血、熱毒下血、酒醉不醒的治療。

目前，針對葛根的化學(xué)成分的研究中，已經(jīng)報道的包括：(1)異黃酮及其苷類化合物：除淀粉外，葛根的主要化學(xué)成分為異黃酮類化合物，采用回流提取、硅膠柱色譜法從鮮葛根中分離得到了葛根素和大豆苷兩種有效成分。李國輝，張慶文等用硅膠柱色譜結(jié)合制備高效液相色譜分離得到了大豆苷元，3'-甲氧基大豆苷元、芒柄花苷、3'-羥基大豆苷元、染料木苷、大豆苷、8-甲氧基芒柄花苷、5-羥基芒柄花苷(李國輝，張慶文，王一濤，等.葛根的化學(xué)成分研究[J].中國中藥雜志，2010，35(23):3156.)；(2)香豆素類及葛酚苷類化合物：香豆素大部分是以異黃酮類化合物的最高氧化形式coumestan存在于葛屬植物中，Junei、柴田承二等先后從野葛中分離得到了擬雌內(nèi)酯和葛香豆雌酚(董英，徐斌，林琳，等.葛根的化學(xué)成分研究[J].食品與機(jī)械，2005，21(6):85.)；(3)三萜類：Arao等從葛根中分離得到了葛根皂苷(SA1-SA4)、葛根皂苷SB1、葛根皂苷(A1-A5)和葛根皂苷C1(陳荔炟，陳樹和，劉焱文，等.葛根資源、化學(xué)成分和藥理作用研究概況[J].時珍國醫(yī)國藥，2006，17(11):2305.)；(4)其他成分：葛根中還含有尿囊素、氯化膽堿、生物堿卡塞因、甘露醇、5-甲基海因、膽堿和乙酰膽堿以及十六酸甲酯等脂肪酸酯類成分。

黃酮類化合物是一類多酚類抗氧化劑，是葛根、補骨脂、黃芩、銀杏、沙棘、槐米等臨床常用中藥材的主要活性成分。該類化合物不僅數(shù)量眾多，而且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有許多重要的生理活性，如抗氧化、抗癌、抗炎、抗菌、抗病毒、抗過敏、抗糖尿病并發(fā)癥等。天然黃酮類化合物雖然生理活性豐富并且廣泛存在于自然界，但已知的黃酮類化合物因其藥效差等缺點而限制了它們的臨床應(yīng)用。本發(fā)明從葛根中分離得到了一種具有強(qiáng)烈抑制α-葡萄糖苷酶活性的雙羥基黃酮化合物，該化合物至今尚未見到相關(guān)報道。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的第一個目的在于提供一種分離自葛根的黃酮類化合物。

另外，本發(fā)明的第二個目的在于提供一種提取工藝簡單的黃酮類化合物的制備方法。

再者，本發(fā)明的第三個目的在于所提供上述黃酮類物質(zhì)在制備藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。

本發(fā)明的第一個目的是通過如下技術(shù)方案完成的：一種黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷，該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)式如下所示：

本發(fā)明的第二個目的是通過如下技術(shù)方案完成的：一種黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)將葛根干燥粉碎得粉末，用體積分?jǐn)?shù)95％的乙醇加熱回流提取3～5次，所得提取液經(jīng)減壓濃縮得浸膏，將浸膏用去離子水懸浮，依次用水飽和的乙酸乙酯萃取2～4次、水飽和過的正丁醇萃取2～4次，減壓濃縮分別得到乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；

(2)將正丁醇萃取物經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿:甲醇＝5:1～1:1為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析及254nm紫外檢測和碘顯色，將相同部分合并得到10個部分Fr 1～Fr10，F(xiàn)r7經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿:甲醇＝15:1～0:1為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)薄層層析及254nm紫外檢測和碘顯色，將相同部分合并得到得到7個部分Fr7-1～Fr7-7，F(xiàn)r7-1經(jīng)制備液相色譜分離，以60％～70％的乙腈水溶液為流動相進(jìn)行洗脫，流速為12～16mL/min，得到目標(biāo)化合物。

優(yōu)選地，如上所述黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述的水飽和過的乙酸乙酯萃取步驟、水飽和過的正丁醇萃取步驟均為等體積萃取。

優(yōu)選地，如上所述黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的制備方法，其特征在于，步驟(2)中第一次梯度洗脫時按體積比計的梯度設(shè)置如下：先以氯仿:甲醇＝5:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，然后以氯仿：甲醇＝4:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，再以氯仿：甲醇＝3:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，再以氯仿：甲醇＝2:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，最后以氯仿：甲醇＝1:1為洗脫劑洗脫1個柱體積。

優(yōu)選地，如上所述黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的制備方法，其特征在于，步驟(2)中第二次梯度洗脫時按體積比計的梯度設(shè)置如下：先以氯仿:甲醇＝15:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，然后以氯仿：甲醇＝10:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，再以氯仿：甲醇＝5:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，再以氯仿：甲醇＝1:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，最后以氯仿：甲醇＝0:1為洗脫劑洗脫2個柱體積。

另外，本發(fā)明通過多次體外活性試驗發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，是陽性對照物質(zhì)阿卡波糖的1117倍，動力學(xué)實驗表明其抑制類型為不可逆性抑制。因此，本發(fā)明的第三個目的是通過如下技術(shù)方案完成的：黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷在制備抑制α-葡萄糖苷酶的藥物中的應(yīng)用。黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷在制備治療糖尿病的藥物、保健品或食品中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的黃酮類化合物2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷是一種結(jié)構(gòu)新穎的、具有顯著降血糖活性的物質(zhì)，不但具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，而且對糖苷酶的抑制類型為不可逆性抑制，有望在將來被開發(fā)成為安全有效的降血糖、調(diào)節(jié)飲食失調(diào)、治療超重或肥胖等營養(yǎng)性疾病的藥物。另外，本發(fā)明的提取方法條件溫和、操作方便，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的IR紅外譜圖；

圖2為2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃酮的紫外譜圖；

圖3為2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃酮的質(zhì)譜圖；

圖4為2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃酮的酶動力學(xué)曲線圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。但本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。另外，實施例中未注明具體技術(shù)操作步驟或條件者，均按照本領(lǐng)域內(nèi)的一般文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市購獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例1：2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的制備

將葛根(采自秦嶺山區(qū))常溫下干燥粉碎得粉末10kg，用體積分?jǐn)?shù)為95％的乙醇50L加熱回流提取三次，合并提取液，減壓濃縮得浸膏1021.7g，將浸膏用去離子水10L懸浮，依次用水飽和過的乙酸乙酯10L萃取3次、水飽和過的正丁醇10L萃取3次，萃取物經(jīng)減壓濃縮分別得到乙酸乙酯萃取物268.5g和正丁醇萃取物501.6g。

將正丁醇萃取物501.6g經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿:甲醇＝5:1-1:1為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，按體積比計的梯度設(shè)置如下：先以氯仿:甲醇＝5:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，然后以氯仿:甲醇＝4:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，再以氯仿:甲醇＝3:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，再以氯仿:甲醇＝2:1為洗脫劑洗脫2個柱體積，最后以氯仿:甲醇＝1:1為洗脫劑洗脫1個柱體積。經(jīng)薄層層析點板分析及254nm紫外檢測和碘顯色，將相同部分合并得到10個部分Fr 1～Fr 10。Fr7(4.7g)經(jīng)硅膠柱層析，以氯仿:甲醇＝15:1～0:1為洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，按體積比計的梯度設(shè)置如下：先以氯仿:甲醇＝15:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，然后以氯仿:甲醇＝10:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，再以氯仿：甲醇＝5:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，再以氯仿：甲醇＝1:1為洗脫劑洗脫3個柱體積，最后以氯仿：甲醇＝0:1為洗脫劑洗脫2個柱體積。經(jīng)薄層層析點板分析及254nm紫外檢測和碘顯色，將相同部分合并得到得到7個部分Fr7-1～Fr7-7。Fr7-1(79.0mg)經(jīng)制備液相，以乙腈(A)-水(B)為流動相(60％A-70％A(30min))，流速為15mL/min，得到目標(biāo)化合物(50.7mg，t_R＝15.8min)(產(chǎn)物的氫譜、碳譜數(shù)據(jù)見表1，IR紅外譜圖見圖1，紫外譜圖見圖2，質(zhì)譜圖見圖3)。

表1：2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷的¹H-NMR、¹³C-NMR數(shù)據(jù)

實施例2：2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷對α-糖苷酶的抑制活性研究

(1)樣品濃度以1mg/mL為起始濃度，運用半倍稀釋法將樣品化合物稀釋為不同的濃度梯度；

(2)實驗分為三組，分別為樣品組、空白組和控制組，每組分別做三組平行實驗，96孔板中進(jìn)行試驗，在樣品組、空白組和控制組的各孔中分別依次加入0.1U/mLα-葡萄糖苷酶(20μL)、0.1mol/L磷酸緩沖溶液(PBS)(20μL，pH 6.8)和樣品液(20μL)在37℃預(yù)培養(yǎng)15min(其中空白組將樣品液用PBS替換，控制組酶用PBS替換)；

(3)依次加入2.5mmol/Lα-PNPG(20μL)在37℃反應(yīng)15min；

(4)依次加入0.2mol/L Na₂CO₃(80μL)終止反應(yīng)；

(5)反應(yīng)終止后，立即在酶標(biāo)儀下選擇讀板模式(405nm，T＝37℃)測出每個孔的OD值；

(6)運用抑制率計算公式：計算樣品各個濃度時的抑制率。

表2：2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷和陽性對照阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶的抑制活性(IC₅₀)

實施例3：2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃烷對α-糖苷酶的酶動力學(xué)研究

(1)配置不同活度的酶

0.1U/mL，0.2U/mL，0.3U/mL，0.4U/mL，0.5U/mL，0.6U/mL，0.7U/mL，0.8U/mL，0.9U/mL；

(2)在96孔板中分別加入50μlPBS+50μl酶+50μlα-PNPG(1.5mmol)+50PBS/50μl抑制劑(樣品)，平行做三組；

(3)加樣完成后，立即在酶標(biāo)儀下選擇動力學(xué)模式測定(405nm，T＝37℃，t＝10(10min取11個數(shù)據(jù)，即0-10min各測一次))。

試驗結(jié)果顯示，2′,3-環(huán)氧-4,4,4′,7-四羥基-5′-香葉基-黃酮具有較高的α-葡萄糖苷酶抑制活性，是陽性對照阿卡波糖的1117倍(見表2)，動力學(xué)實驗表明其抑制類型為為不可逆性抑制(見圖4)。