本發(fā)明涉及一種半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針，尤其涉及一種能檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)源性二氧化硫衍生物的熒光探針及其應(yīng)用；屬于有機(jī)小分子熒光探針技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

黃酮醇是具有ESIPT(激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移)現(xiàn)象的、具有較高的熒光量子產(chǎn)率的熒光結(jié)構(gòu)，是很重要的綠色熒光染料，經(jīng)過修飾后用于發(fā)光材料、化學(xué)傳感器以及標(biāo)記生物分子。近幾年利用熒光變化檢測活體細(xì)胞中的二氧化硫衍生物研究得到不斷發(fā)展。

細(xì)胞可以利用半胱氨酸等底物及細(xì)胞內(nèi)酶的作用下產(chǎn)生二氧化硫衍生物——亞硫酸鹽及亞硫酸氫鹽，可參與細(xì)胞內(nèi)多種生理過程，比如改變心率、降低血壓及參與炎癥反應(yīng)等。但是體內(nèi)二氧化硫衍生物含量過高會引起一系列不良反應(yīng)，對人體健康造成危害。同時，二氧化硫是非常有害的空氣污染物。所以對它的準(zhǔn)確檢測及控制具有重要的意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的問題是提供一種以半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針，且該探針具有高選擇性和高靈敏度從而具有實際應(yīng)用價值。

本發(fā)明所述的以半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針，其特征在于：所述熒光探針簡稱是L-HF1，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

上述熒光探針化合物L(fēng)-HF1由如下方法制得：

鄰羥基苯乙酮與對羧基苯甲醛經(jīng)二步反應(yīng)關(guān)環(huán)得到黃酮醇熒光團(tuán)，然后通過酰胺鍵的構(gòu)建引入芳香醛基，進(jìn)而與吲哚鹽縮合得到化合物L(fēng)-HF1。

實驗證實：本發(fā)明所述的二氧化硫衍生物比例熒光探針L-HF1可以與半川菁熒光團(tuán)中的烯鍵發(fā)生Michael加成反應(yīng)，從而阻斷半川菁熒光團(tuán)的共軛，使得其紅色熒光減弱直至消失，而黃酮醇熒光團(tuán)的特征綠色熒光由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的阻斷而得以重現(xiàn)，同時半川菁的特征紫外吸收峰消失，從而達(dá)到檢測的效果，見圖1。

本發(fā)明所述以半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針在檢測液體或細(xì)胞中的二氧化硫衍生物的應(yīng)用。

其中：所述液體或細(xì)胞優(yōu)選是PBS/DMF緩沖體系、L-02細(xì)胞、HepG2細(xì)胞或Hela細(xì)胞。

具體的，配制L-HF1在PBS/DMF緩沖體系(pH＝7.4，DMF體積分?jǐn)?shù)25％)中的溶液，分別定量加入微升級的陰離子(F^-,Cl^-,Br^-,I^-,HCO₃^-,NO₃^-,NO₂^-,N₃^-,AcO^-,H₂PO₄^-,ClO^-,ClO₃^-,SO₄^2-,HSO₄^-,HS^-,SCN^-,S₂O₃^2-,HSO₃^-及SO₃^2-)和各種氨基酸分子(glutamate，histidine，lysine，tryptophan，valine，arginine，sarcosine，aspartic acid，cysteine，homocysteine，glutathione)的水溶液。通過熒光分光光度法測試對不同氨基酸、人體常見陰離子的選擇性和響應(yīng)能力，結(jié)果見圖2、圖3。

往活HeLa細(xì)胞或L-02細(xì)胞中加入探針L-HF1，然后用亞硫酸氫鈉培育細(xì)胞，對照加入亞硫酸氫鈉前后細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像變化，結(jié)果見圖4、圖5。

本發(fā)明所述以半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針在檢測肝癌細(xì)胞內(nèi)源性二氧化硫衍生物中的應(yīng)用。

往活HepG2細(xì)胞中加入探針L-HF1，然后加入硫代硫酸鈉及GSH以刺激該類細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)生的亞硫酸氫鹽，采集刺激前后細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像變化，結(jié)果見圖6。

本發(fā)明設(shè)計合成的L-HF1，可以與二氧化硫衍生物發(fā)生親核加成反應(yīng)，從而使溶液熒光由紅色變?yōu)榫G色，肉眼可分辨，且具有很好的選擇性與專一性，同時具有極高的靈敏度，實現(xiàn)了對二氧化硫衍生物的微量高靈敏度檢測，具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1：為探針L-HF1的PBS/DMF緩沖體系(pH＝7.4，DMF體積分?jǐn)?shù)25％，5μM)中加入不同10當(dāng)量的亞硫酸氫鈉的熒光圖譜及紫外吸收圖譜隨時間的變化。其中：a為熒光圖譜，b為紫外吸收圖譜。

圖2：為探針L-HF1的PBS/DMF緩沖體系(pH＝7.4，DMF體積分?jǐn)?shù)25％，5μM)中加入不同種類的陰離子的熒光發(fā)射圖譜。其中：a為熒光曲線圖譜，b為對應(yīng)的比例熒光柱狀圖譜。

圖3：為探針L-HF1的PBS/DMF緩沖體系(pH＝7.4，DMF體積分?jǐn)?shù)25％，5μM)中加入不同種類的氨基酸的熒光發(fā)射圖譜。其中：其中：a為熒光曲線圖譜，b為對應(yīng)的比例熒光柱狀圖譜。

圖4：為探針L-HF1在活HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。HeLa細(xì)胞是在37℃條件下，于加入5μM的探針L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用不同濃度的亞硫酸氫鈉細(xì)胞培養(yǎng)液培育0.5小時。其中：a為細(xì)胞成像效果圖，b為對應(yīng)的比例熒光信號統(tǒng)計數(shù)據(jù)柱狀圖。

圖5：為探針L-HF1在活L-02細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。L-02細(xì)胞是在37℃條件下，于加入5μM的探針L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用不同濃度的亞硫酸氫鈉細(xì)胞培養(yǎng)液培育0.5小時，或用硫代硫酸鈉和GSH培育0.5小時。其中：a為細(xì)胞成像效果圖，b為對應(yīng)的比例熒光信號統(tǒng)計數(shù)據(jù)柱狀圖。

圖6：為探針L-HF1在活HepG2細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像圖。HepG2細(xì)胞是在37℃條件下，于加入5μM的探針L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用硫代硫酸鈉和GSH培育0.5小時。HepG2細(xì)胞是在37℃條件下，于加入5μM的探針L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulphonate)培育細(xì)胞0.5小時，再用硫代硫酸鈉及GSH培育細(xì)胞0.5小時。其中：a為細(xì)胞成像效果圖，b為對應(yīng)的比例熒光信號統(tǒng)計數(shù)據(jù)柱狀圖。

具體實施方式

實施例1本發(fā)明所述以半川菁及黃酮醇為熒光團(tuán)的二氧化硫衍生物比例熒光探針的制備

鄰羥基苯乙酮與對羧基苯甲醛經(jīng)二步反應(yīng)關(guān)環(huán)得到黃酮醇熒光團(tuán)，然后通過酰胺鍵的構(gòu)建引入芳香醛基，進(jìn)而與吲哚鹽縮合得到化合物L(fēng)-HF1。

上述反應(yīng)過程反應(yīng)式如下：

將化合物1(1mmol)，化合物2(1mmol)，DMAP(0.1mmol)和EDC(1mmol)加入到30mL二氯甲烷中，室溫反應(yīng)8小時后，用鹵水洗滌有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥，抽濾，液相旋干，硅膠柱柱層析(二氯甲烷：乙酸乙酯＝1:1)，得化合物3，產(chǎn)率82％，熔點：238-239℃。

紅外測定(KBr,cm^-1):3270,3000,2918,2850,2809,2724,1731,1664,1633,1603,1568,1483,1421,1288,1227,1159,1006,753。

核磁共振氫譜測定：¹H NMR(300MHz,CDCl₃):δ9.83(s,1H),8.36(d,J＝8.7Hz,2H),8.27(dd,J＝8.1,1.5Hz,1H),7.80(d,J＝8.7Hz,2H),7.75-7.72(m,1H),7.64-7.61(m,3H),7.45(t,J＝7.8Hz,1H),7.12(s,1H),6.97(d,J＝8.7Hz,2H),3.97-3.49(m,8H)。

核磁共振碳譜測定：¹³C NMR(75MHz,CDCl₃):δ190.4,173.5,169.7,155.4,154.5,143.5,138.9,136.4,134.0,132.7,131.8,128.0,127.9,127.4,125.5,124.7,120.6,118.3,114.1。

高分辨質(zhì)譜：m/z calculated for C₂₇H₂₃N₂O₅⁺455.1607,found 455.1602。

把化合物3(0.5mmol)和4(0.6mmol)溶在20mL無水乙醇中，加熱至回流。TLC跟蹤反應(yīng)至化合物3消失。旋蒸出去乙醇，硅膠柱層析(CH₂Cl₂:MeOH＝30:1到15:1)得紅色固體，即本發(fā)明的熒光探針L-HF1，產(chǎn)率：79％。

紅外測定(KBr,cm^-1):3014,2919,2850,1729,1611,1571,1522,1466,1384,1297,1237,1190,1115,1004。

核磁共振氫譜測定：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)8.37(d,J＝8.4Hz,2H),8.27(d,(d,J＝7.6Hz,1H),8.24(d,J＝7.2Hz,2H),8.09(d,J＝15.6Hz,1H),7.75-7.63(m,5H),7.53-7.45(m,5H),7.14(s,1H),6.99(d,J＝6.8Hz,2H)。

核磁共振碳譜測定：¹³C NMR(CDCl₃,100MHz)δ180.3,173.5,169.7,155.3,154.7,154.5,143.6,142.2,141.6,138.9,136.2,134.9,134.0,132.7,129.3,128.5,127.9,127.5,125.3,124.7,124.1,122.4,120.5,118.4,114.1,113.5,107.2,51.45,46.84,35.79,27.43。

高分辨質(zhì)譜：m/z calculated for C₃₉H₃₆N₃O₄⁺610.2706,found 610.2702。

實施例2

用微量注射器向10mL配好的探針L-HF1的PBS/DMF緩沖液(pH＝7.4，DMF體積分?jǐn)?shù)為25％，5μM)中，分別定量加入最終濃度為50μM的各種陰離子(F^-,Cl^-,Br^-,I^-,HCO₃^-,NO₃^-,NO₂^-,N₃^-,AcO^-,H₂PO₄^-,ClO^-,ClO₃^-,SO₄^2-,HSO₄^-,HS^-,SCN^-,S₂O₃^2-,HSO₃^-及SO₃^2-)和最終濃度為1mM的各種氨基酸分子(glutamate，histidine，lysine，tryptophan，valine，arginine，sarcosine，aspartic acid，cysteine，homocysteine，glutathione)，作用5分鐘后進(jìn)行熒光分光光度法測試，顯示探針對亞硫酸鈉與亞硫酸氫鈉有很好的選擇性，加入亞硫酸鈉與亞硫酸氫鈉前后對照顯示具有明顯的熒光發(fā)射變化。見圖1，2，3。

實施例3

細(xì)胞內(nèi)熒光成像測試：

HeLa細(xì)胞：在37℃條件下，HeLa細(xì)胞在加入5μM的L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時；再在加入不同濃度的亞硫酸氫鈉的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5小時。熒光成像顯示探針L-HF1可滲透進(jìn)細(xì)胞，且隨亞硫酸氫鈉濃度的增大綠色熒光與紅色熒光的強度之比逐漸增大。見圖4。

L-02細(xì)胞：在37℃條件下，L-02細(xì)胞在加入5μM的L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，再在加入不同濃度的亞硫酸氫鈉的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)0.5小時。熒光成像顯示探針L-HF1可滲透進(jìn)細(xì)胞，且隨亞硫酸氫鈉濃度的增大綠色熒光與紅色熒光的強度之比逐漸增大。往活L-02細(xì)胞中加入5μM的探針L-HF1，然后用硫代硫酸鈉及GSH培育細(xì)胞，熒光成像顯示加入硫代硫酸鈉及GSH前后細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像變化，見圖5。

HepG2細(xì)胞：在37℃條件下，HepG2細(xì)胞在加入5μM的L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用硫代硫酸鈉及GSH培育細(xì)胞，熒光成像顯示加入硫代硫酸鈉及GSH前后細(xì)胞內(nèi)熒光顯微成像發(fā)生變化。在37℃條件下，HepG2細(xì)胞在加入5μM的L-HF1的細(xì)胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)1小時，然后用TNBS(2,4,6-trinitrobenzenesulphonate)培育細(xì)胞0.5小時，再用硫代硫酸鈉及GSH培育細(xì)胞，熒光成像顯示此情形下熒光顯微成像未見明顯變化，見圖6。