本發(fā)明涉及雜交鵝掌楸遺傳轉(zhuǎn)化方法，具體涉及一種以懸浮細胞原生質(zhì)體為受體的雜交鵝掌楸高效的瞬間基因表達方法。

背景技術(shù)：

鵝掌楸屬于古老的木蘭科植物，從系統(tǒng)發(fā)生上看，屬于原始的被子植物。對木蘭科植物基因及其功能的研究，將對闡明被子植物的系統(tǒng)發(fā)生有著重要的影響。而目前利用常見的模式植物擬南芥、煙草的轉(zhuǎn)基因體系對鵝掌楸的基因功能和信號傳導(dǎo)開展研究可能存在異源系統(tǒng)帶來的假陽性等問題，因此建立鵝掌楸的轉(zhuǎn)基因體系對于鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究都有著重要意義。轉(zhuǎn)基因體系主要包括穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)基因體系和瞬間表達基因體系，受木本植物生長周期長特點的影響，瞬間表達基因體系為植物基因功能高通量研究提供了一個快速方便的操作平臺。目前，瞬間轉(zhuǎn)化體系主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化、基因槍法、PEG介導(dǎo)或者電穿孔法介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。聚乙烯亞胺（PEI）是一種常用的陽離子聚合物，是動物細胞轉(zhuǎn)基因中常用的體外或體內(nèi)非病毒基因載體，但其在植物基因轉(zhuǎn)染中開展的研究較少。目前認為聚乙烯亞胺是基于PEI/DNA復(fù)合物被細胞內(nèi)吞后，引起外源質(zhì)子內(nèi)流，隨后水分大量涌入導(dǎo)致內(nèi)吞囊泡裂解、釋放出的PEI/DNA復(fù)合物穿過核膜進入細胞核這樣一個過程完成基因轉(zhuǎn)染的。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，本發(fā)明的目的是提供一種以懸浮細胞原生質(zhì)體為受體的雜交鵝掌楸高效的瞬間基因表達方法，建立起PEI介導(dǎo)的雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)化體系，為鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究提供又一種快速方便的操作平臺。

技術(shù)方案：為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種以懸浮細胞原生質(zhì)體為受體的雜交鵝掌楸高效的瞬間基因表達方法，包括以下步驟：

1）使用QIAGEN Plasmid Midi Kits抽提純化質(zhì)粒，將其調(diào)整到1 μg/μl的濃度后，-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

2）雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體的分離純化，獲得濃度為10⁶/mL的原生質(zhì)體；

3）取3 μg質(zhì)粒于2 mL離心管中，加入1μg PEI，并加入PBS（pH7.0）至體系為50μL，通過超聲波超聲2分鐘充分混勻，然后室溫靜置反應(yīng)30分鐘，制備PEI/DNA基因載體復(fù)合物；然后加入200uL雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體，用手指輕輕敲打使溶液混勻，室溫靜置轉(zhuǎn)化5～10 min，然后加入800 uL W5溶液輕輕上下顛倒混勻，終止轉(zhuǎn)染反應(yīng)，1100rpm 離心2min，用槍頭吸出上清，收集轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體細胞1mL WI溶液輕輕懸浮原生質(zhì)體，并轉(zhuǎn)移到細胞培養(yǎng)板上

4）將細胞培養(yǎng)板放在23℃黑暗靜置培養(yǎng)18 h后，置于熒光顯微鏡下觀察。

步驟1）中，質(zhì)粒制備的具體過程為：

1）挑取平板中分散良好的單菌落，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的2 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)8 h；

2）取搖好的菌液，按1:500的比例加到含有100 mg/L氨芐青霉素的50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)12～16 h；

3）在4℃用6000×g離心15分鐘收集菌體沉淀，完全棄除上清液；

4）用4 mL Buffer P1重懸菌體；

5）加入4 mL Buffer P2，上下顛倒4-6次完全混勻，室溫靜置裂解5 min；

6）加入4 mL 預(yù)冷的Buffer P3，立即顛倒4-6次混勻，冰浴靜置沉淀15min;

7）在4℃用≥20000×g離心30 min，將含有質(zhì)粒的上清液小心地轉(zhuǎn)移到一個新的干凈的離心管中；并在4℃用≥20000×g再次離心15 min；

8）將4 mL Buffer QBT加入到QIAGEN-tip 100離心柱上，靠重力作用待其完全流過離心柱。

9）將7）中含有質(zhì)粒的上清液立即轉(zhuǎn)移到平衡好的QIAGEN-tip 100離心柱上，依靠重力的作用將質(zhì)粒結(jié)合到離心柱的樹脂上；

10）加入2×10 mL Buffer QC 清洗離心柱；

11）加入5 mL Buffer QF將離心柱的樹脂上結(jié)合的質(zhì)粒洗脫到一個干凈的離心管中；

12）向質(zhì)粒洗脫液中加入3.5 mL室溫放置的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，完全混勻后，在4 ℃用≥15000×g離心30 min沉淀質(zhì)粒DNA，小心棄除上清液；

13）用2 mL 室溫放置的70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，用≥15000×g離心10 min，小心棄除上清液不要擾動離心管底部的沉淀；

14）室溫干燥5～10 min后；加入30 uL滅菌的ddH₂O，溶解質(zhì)粒；

15）用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測質(zhì)粒的濃度和純度后，將其調(diào)整到1 μg/μL后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

步驟2）中，于無菌操作臺上取繼代后第3-5天的處于對數(shù)生長期的懸浮系細胞于50 mL的量筒中靜置10 min，傾去所有上清液，取2 g沉淀于量筒底部的懸浮系細胞至培養(yǎng)皿中，加入10 mL原生質(zhì)體酶解液，置于28℃黑暗條件下，45 rpm輕微振蕩2 hr進行酶解；酶解完成后，加入適量W5溶液，輕輕搖晃，使用300目篩子過濾除去未酶解充分的細胞團；濾液經(jīng)1100 rpm離心2 min，棄上清液，用2 mL冰預(yù)冷的W5溶液洗原生質(zhì)體2次后，加入2 mL冰預(yù)冷的W5溶液重懸原生質(zhì)體，冰上靜置30 min，1100 rpm離心2 min，棄上清液，加入MMg溶液懸浮原生質(zhì)體，并調(diào)整原生質(zhì)體濃度至10⁶/mL。

酶解液的準備：稱取Cellulase R-10 0.15 g，Macerozyme R10 0.1 g和Pectolase Y-23 0.01 g 于6.25 mL 0.8 M甘露醇、2.5 mL 80 mM KCl、1 mL 200 mM MES（pH5.7）的溶液中，攪勻，置4℃冰箱過夜充分溶解；再加入0.1 mL 1 M CaCl₂、0.01 g BSA，定容至10 mL；用0.45 μm的滅菌過濾器過濾上述溶液，備用。

有益效果：與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明以雜交鵝掌楸懸浮系細胞作為原生質(zhì)體的來源，通過PEI介導(dǎo)，以GFP基因作為報告基因，建立起了雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體高效的瞬間表達體系；為鵝掌楸及木蘭科植物基因功能的研究提供又一種快速方便的操作平臺。

附圖說明：

圖1是雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體的顯微照片圖；

圖2是PEI介導(dǎo)雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的的顯微照片圖；左圖是明場視野，中圖是GFP視野，右圖是疊加后。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明作進一步的說明。以下實施例用到的試劑的下：

液體培養(yǎng)基配方：3/4MS，附加2,4-D 2.0 mg/L，6-BA 0.2 mg/L，CH 0.5 g/L，蔗糖30 g/L。

PEI溶液（2mg/mL），50 mL：0.1g PEI，50 mL PBS。

W5溶液：154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES（pH5.7），5mM葡萄糖。

MMg溶液：0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，4mM MES（pH5.7）。

WI溶液：4mM MES（pH5.7），0.5M甘露醇，20mM KCl。

實施例1 質(zhì)粒制備

質(zhì)粒的純度和濃度對原生質(zhì)體的瞬間轉(zhuǎn)化有重要的影響。純度低，轉(zhuǎn)化很難獲得成功。濃度過低，轉(zhuǎn)化效率也會很低，因此，質(zhì)粒的純度和濃度是影響轉(zhuǎn)化效率的關(guān)鍵因素之一。本實例采用QIAGEN Plasmid Midi Kits抽提純化質(zhì)粒（PJIT166-GFP），可以方便快速地獲得純度較高的質(zhì)粒。具體過程為：

1）挑取平板中分散良好的單菌落，接種于含有100 mg/L氨芐青霉素的2 mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)8 h；

2）取搖好的菌液，按1:500的比例加到含有100 mg/L氨芐青霉素的50 mL的LB培養(yǎng)基中，37 ℃，300 rpm，振蕩培養(yǎng)12～16 h；

3）在4℃用6000×g離心15分鐘收集菌體沉淀，完全棄除上清液；

4）用4 mL Buffer P1重懸菌體；

5）加入4 mL Buffer P2，上下顛倒4-6次完全混勻，室溫靜置裂解5 min；

6）加入4 mL 預(yù)冷的Buffer P3，立即顛倒4-6次混勻，冰浴靜置沉淀15min;

7）在4℃用≥20000×g離心30 min，將含有質(zhì)粒的上清液小心地轉(zhuǎn)移到一個新的干凈的離心管中；并在4℃用≥20000×g再次離心15 min；

8）將4 mL Buffer QBT加入到QIAGEN-tip 100離心柱上，靠重力作用待其完全流過離心柱。

9）將7）中含有質(zhì)粒的上清液立即轉(zhuǎn)移到平衡好的QIAGEN-tip 100離心柱上，依靠重力的作用將質(zhì)粒結(jié)合到離心柱的樹脂上；

10）加入2×10 mL Buffer QC 清洗離心柱；

11）加入5 mL Buffer QF將離心柱的樹脂上結(jié)合的質(zhì)粒洗脫到一個干凈的離心管中；

12）向質(zhì)粒洗脫液中加入3.5 mL室溫放置的異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA，完全混勻后，在4 ℃用≥15000×g離心30 min沉淀質(zhì)粒DNA，小心棄除上清液；

13）用2 mL 室溫放置的70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀，用≥15000×g離心10 min，小心棄除上清液不要擾動離心管底部的沉淀；

14）室溫干燥5～10 min后；加入30 uL滅菌的ddH₂O，溶解質(zhì)粒；

15）用瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測質(zhì)粒的濃度和純度后，將其調(diào)整到1 μg/μL后，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

實施例2 雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體的分離純化

分離獲得大量高活性的原生質(zhì)體是進行原生質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，而植物材料的生長狀態(tài)、酶的種類和純度、酶解時間和溫度等諸多因素都會影響分離到的原生質(zhì)體的效率和質(zhì)量。

本實例以雜交鵝掌楸懸浮系細胞作為材料，基于專用酶解液、滲透壓、酶解時間等參數(shù)，建立了有效的制備雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體的方法，具體步驟如下：

1）酶解液的準備：稱取Cellulase R-10 0.15 g，Macerozyme R10 0.1 g和Pectolase Y-23 0.01 g 于6.25 mL 0.8 M甘露醇、2.5 mL 80 mM KCl、1 mL 200 mM MES（pH5.7）的溶液中，攪勻，置4℃冰箱過夜充分溶解；再加入0.1 mL 1 M CaCl₂、0.01 g BSA，定容至10 mL；用0.45 μm的滅菌過濾器過濾上述溶液，備用。

2）參照現(xiàn)有的基本技術(shù)路線（陳金慧, 施季森, 諸葛強, 等. 雜交鵝掌楸體細胞胚胎發(fā)生研究[J]. 林業(yè)科學(xué), 2003, 39(4): 49-53。陳志, 陳金慧, 邊黎明, 等. 雜交鵝掌楸胚性細胞懸浮系的建立[J]. 分子植物育種, 2007, 5(1): 137-140.），用新采集的未成熟的胚誘導(dǎo)獲得胚性愈傷組織，并在固體培養(yǎng)基上繼代保存。于無菌操作臺上取1 g左右的胚性愈傷，置于盛有50 mL液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，搖床轉(zhuǎn)速為100 rpm，培養(yǎng)溫度為23±2℃，光照條件為黑暗。

3）懸浮培養(yǎng)系細胞用作原生質(zhì)體制備材料來源時至少已經(jīng)懸浮繼代2次以上，繼代時傾去所有上清液，將其等量分別倒入到兩個250 mL 三角瓶中，并補充新鮮培養(yǎng)液至50 mL，每7天繼代一次。

4）取繼代后第3-5天的處于對數(shù)生長期的懸浮系細胞于50 mL的量筒中靜置10 min，傾去所有上清液，取2 g沉淀于量筒底部的懸浮系細胞至培養(yǎng)皿中，加入10 mL原生質(zhì)體酶解液。于28℃，45 rpm搖床上酶解2 h。

5）酶解完成后，輕輕搖晃數(shù)秒促進消化，加入適量W5溶液，輕輕搖晃，使用300目篩子過濾除去未酶解充分的細胞團。

6）濾液經(jīng)1100rpm離心2min，用槍頭吸出上清，可見原生質(zhì)體沉淀于底部。

7）向所得的沉淀中加入2 mL冰預(yù)冷的W5溶液重懸原生質(zhì)體，1100rpm離心2min，用槍頭吸出上清，輕輕搖晃使原生質(zhì)體懸浮。

8）再重復(fù)一次。

9）再次加入2mL冰預(yù)冷的W5溶液重懸原生質(zhì)體，冰上靜置30min。1000rpm離心2min，用槍頭吸出上清，輕輕搖晃使原生質(zhì)體懸浮。

10）加入所需體積的MMg溶液（每個反應(yīng)約需200μL）懸浮原生質(zhì)體。取一滴重懸液進行鏡檢，觀察原生質(zhì)體的質(zhì)量和濃度，并調(diào)整原生質(zhì)體濃度至10⁶/mL。最終獲得的雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體的顯微照片，如圖1所示。

實施例3 轉(zhuǎn)化

以PEI介導(dǎo)的雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體瞬間轉(zhuǎn)化的方法，具體步驟如下：

1）對于單個反應(yīng)，加入質(zhì)粒DNA共3μg于2mL離心管中。

2）加入1μg PEI儲存液，添加PBS至體系達到50μL，通過超聲波超聲2分鐘充分混勻，然后室溫靜置反應(yīng)30分鐘，制備PEI/DNA基因載體復(fù)合物。

3）吸取200uL 雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體同PEI/DNA基因載體復(fù)合物混合，用手指輕輕敲打使質(zhì)粒DNA及原生質(zhì)體溶液混勻（或用寬口槍頭輕輕吸打），使其充分混勻，室溫靜置轉(zhuǎn)化5～10 min。

4）加入1mL W5溶液輕輕上下顛倒混勻，終止轉(zhuǎn)染反應(yīng)，1100rpm 離心2min，用槍頭吸出上清，收集轉(zhuǎn)化的原生質(zhì)體細胞，反復(fù)兩次。然后加入1mL WI溶液，輕輕懸浮原生質(zhì)體，并轉(zhuǎn)移到6孔細胞培養(yǎng)板上。

轉(zhuǎn)到6孔細胞培養(yǎng)板中于黑暗條件下培養(yǎng)過夜，在蔡司熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白在雜交鵝掌楸懸浮系細胞原生質(zhì)體中的表達情況并計算轉(zhuǎn)化效率。

結(jié)果如圖2所示，在明場下，可以觀察到完整的原生質(zhì)體，在GFP下，可以看到綠色熒光分布在整個原生質(zhì)體內(nèi)，以視野下發(fā)綠色熒光的原生質(zhì)體占所觀察到的原生質(zhì)體的比例計算的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化率達到了55%。