技術領域

本發(fā)明屬于基因工程領域，涉及一種酸性環(huán)境下纖維素外切酶在乳桿菌中表達的方法。

背景技術：

纖維素酶在對生物資源的利用方面具有巨大的價值。纖維素酶能降解天然的纖維素，轉化成葡萄糖，進而生產多種化工原料或生物制品。纖維素經(jīng)過酸或堿的預處理能明顯提高酶解的效率。然而現(xiàn)在纖維素酶的主要生產菌株一般不能耐受較高的酸度，這樣生產纖維素酶的菌株在生產纖維素酶應用的時候，必須把酸預處理和酶解分成兩步，先酸處理后再調節(jié)pH為產纖維素酶菌株適宜的酸度，否則產纖維素酶菌株會因為過高的酸度死亡或衰亡。如果生產纖維素酶的菌株能夠耐受較高的酸度，那么可以實現(xiàn)一邊降解纖維素，一邊生產纖維素酶，從而維持纖維素酶較高的活性。

嗜酸的微生物中，乳桿菌能在高酸度下進行正常的生長繁殖，而且乳桿菌是一種食品安全的微生物，若用乳桿菌生產纖維素酶，這樣乳桿菌不僅可以高酸度體系下持續(xù)表達纖維素酶，而且不需要經(jīng)過分離純化把乳桿菌去除掉。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種酸性環(huán)境下纖維素外切酶在乳桿菌中表達的方法。本發(fā)明的目的還在于提供一種酸性環(huán)境下表達纖維素外切酶的乳桿菌。

本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：

一種酸性環(huán)境下纖維素外切酶在乳桿菌中表達的方法，包括如下步驟：將由SD序列、信號肽編碼序列和纖維素外切酶基因組成的表達單元，通過同源重組整合到乳桿菌基因組上；優(yōu)選通過同源重組將所述表達單元置換乳桿菌基因組上的熱激蛋白基因。所述的酸性環(huán)境優(yōu)選pH為3.0；所述的纖維素外切酶基因優(yōu)選來源于黑曲霉。

所述的SD序列優(yōu)選如SEQ ID NO.1所示；所述的信號肽編碼序列優(yōu)選如SEQ ID NO.2所示；所述的纖維素外切酶基因的序列優(yōu)選如SEQ ID NO.3所示。

優(yōu)選的，所述的酸性環(huán)境下纖維素外切酶在乳桿菌中表達的方法，包括如下步驟：將SEQ ID NO.4所示序列通過限制性內切酶SacI、XbaI及DNA連接酶連接到pHT01載體上；用所構建的載體轉化嗜酸乳桿菌CCTCCAB96031，篩選同源重組成功的菌株。

一種酸性環(huán)境下表達纖維素外切酶的乳桿菌，通過上述方法得到。

本發(fā)明以嗜酸乳桿菌為表達宿主，通過同源重組將其熱激蛋白基因置換成由SD序列、信號肽編碼序列和纖維素外切酶基因組成的表達單元，即將該表達單元置于高溫啟動的啟動子下，從而讓嗜酸乳桿菌在高溫下啟動表達纖維素外切酶。本發(fā)明實現(xiàn)了纖維素外切酶在嗜酸乳桿菌中的酸性條件下的溫控表達。

具體實施方式

下面結合實施例對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。

實施例1

1、材料

嗜酸乳桿菌CCTCCAB96031，大腸桿菌DH5α，質粒pHT01，SEQ ID NO.4所示的DNA序列1（包括上下游同源臂、SD序列、信號肽編碼序列和纖維素外切酶基因，由生物公司合成）。

質粒提取試劑盒（B518188）購自上海生物工程股份有限公司。膠回收試劑盒（Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0）、限制性內切酶和T4 DNA Ligase購自Takara公司。

MLB培養(yǎng)基：蛋白胨（Tryptone）10g/L，酵母提取物（Yeast extract）5g/L，牛肉膏 5g/L，乙酸鈉5g/L，檸檬酸銨2.5g/L，MgSO₄ 0.5g/L，MnSO₄ 0.25g/L，KH₂PO₄ 0.5g/L。MLB固體培養(yǎng)基再加入瓊脂粉15g/L。

2、質粒pHT01的提取

含有質粒pHT01大腸桿菌DH5а，在含氯霉素5mg/L的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h，培養(yǎng)溫度為30℃，用質粒提取試劑盒（B518188）提取質粒。提取步驟如下：

（1）取0.5mL菌液，10000rpm離心3min收集菌體，倒盡或吸干培養(yǎng)基。

（2）在菌體沉淀中加入700μL Lysis Buffer UF，吸打或振蕩至徹底懸浮菌體，室溫放置3min。

（3）將裂解液全部小心移入吸附柱，室溫放置1min，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（4）向吸附柱中加入500μL Prewash Solution，8000rpm離心2min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（5）向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（6）重復向吸附柱中加入500μL Wash Solution，8000rpm 離心1min。倒掉收集管中的液體，將吸附柱放入同一個收集管中。

（7）將吸附柱和收集管放入離心機，8000rpm離心2min。

（8）將吸附柱放入干凈的1.5mL離心管中，在吸附膜中央加入50μL Elution Buffer，室溫靜置2min，8000rpm離心2min。將所得到的質粒DNA溶液置于-20℃保存。

3、質粒pHT01和SEQ ID NO.4所示DNA序列1的酶切

往25μL提取的質粒pHT01中加入SacI和XbaI酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及ddH₂O 24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到質粒pHT01酶切液。

DNA序列1用雙蒸水稀釋10倍，取25μL，加入SacI和XbaI酶各0.2μL，加入酶切緩沖液及ddH₂O 24.6μL，在30℃保溫60min，加入5μL Loading Buffer，60℃保溫10min，得到DNA序列1酶切液。

4、酶切液電泳

（1）電泳試劑配制

1）5×TBE（tris-硼酸及EDTA）緩沖液的配制（1000mL）：Tris 54g，硼酸27.5g，0.5mol/L EDTA 20mL，將pH調到8.0，定容至1000mL。4℃冰箱保存，用時稀釋5倍。

2）加樣緩沖液的配制：0.25%溴酚藍，40%（W/V）蔗糖水溶液，4℃冰箱保存。

3）溴化乙錠的配制：稱取0.1g溴化乙錠，溶于10mL水，配成終濃度為10mg/mL的母液，4℃冰箱保存。染色時，吸取12.5μL的母液，加入250mL的水中，使其終濃度為0.5μg/mL，混合均勻。

4）100×TE緩沖液的配制：1mol/L Tris-HCl（pH8.0），100mmol/L EDTA。稱取Tris 121.1g，EDTA-Na 237.23g，先用800mL雙蒸水，加熱攪拌溶解后，再用鹽酸調pH至8.0（大約加入鹽酸20mL），然后定容至1000mL。

5）100×電泳緩沖液的配制：4mol/L Tris-HCl（pH8.0），2mol/L醋酸鈉，200mmol/L EDTA。稱取Tris 242.2g，無水乙酸鈉82.03g，EDTA-Na 237.23g，先用400mL雙蒸水加熱攪拌溶解后，再用冰乙酸調pH至8.0（大約加入冰乙酸50mL），然后定容至500mL。用時稀釋100倍。

（2）電泳方法

1）安裝電泳槽：將有機玻璃的電泳凝膠床洗凈，晾干，用膠帶將兩端的開口封好，放在水平的工作臺上，插上樣品梳。

2）1%瓊脂糖凝膠的制備：稱取瓊脂糖溶解在電泳緩沖液中，置微波爐或沸水浴中加熱至完全溶化，取出搖勻。

3）灌膠：將冷卻到60℃的瓊脂糖溶液輕輕倒入電泳槽水平板上。

4）待瓊脂糖膠凝固后，在電泳槽內加入電泳緩沖液，然后拔出梳子。

5）加樣：將DNA樣品與加樣緩沖液按體積比4:1混勻后，用微量移液器將混合液加到樣品槽中，每槽加20μL，記錄樣品的點樣次序和加樣量。

6）電泳：安裝好電極導線，點樣孔一端接負極，另一端接正極，打開電源，調電壓至3-5V/cm，電泳1-3hr，當溴酚藍移到距凝膠前沿1-2cm時，停止電泳。

7）染色和觀察：取出凝膠，放在含有溴化乙錠的染色液中染色30min，即可在254nm的紫外燈下觀察，有橙紅色熒光條帶的位置，即為DNA條帶。

質粒pHT01酶切液電泳后，經(jīng)染色觀察有兩條帶，兩條帶中回收較長的條帶。DNA序列1酶切液電泳后，經(jīng)染色觀察有一條帶，回收該電泳條帶。

5、酶切片段的回收和純化

使用Takara的膠回收試劑盒購回收純化酶切的DNA片段。在紫外燈下切出含有目的DNA的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面的液體。

稱量膠塊重量，計算膠塊體積。向膠塊中加入膠塊溶解液Buffer GM，Buffer GM的加量3凝膠體積。均勻混合后室溫25℃溶解膠塊10min。當凝膠完全溶解后，加入3M醋酸鈉溶液（pH5.2）10μL，均勻混合至溶液恢復黃色。將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上。0.2mL膠溶解液轉移至Spin Column中，12000rpm離心1分鐘，棄濾液。將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。再次將700μL的Buffer WB加入Spin Column中，室溫12000rpm離心30秒鐘，棄濾液。將Spin Column安置于Collection Tube上，室溫12000rpm離心1min。將Spin Column安置于新的1.5mL的離心管上，在Spin Column膜的中央處加入30μL滅菌蒸餾水或Elution Buffer，室溫靜置1分鐘。室溫12000rpm離心1min洗脫DNA。

6、連接

連接體系為：酶切回收的DNA序列1 7μL，酶切回收的pHT01質粒1μL，T4 DNA ligase 1μL，Buffer 1μL。4℃連接24小時。

7、轉化

取一管-80℃保存的大腸桿菌DH5α（不含質粒）感受態(tài)細胞50μL，置冰上融化，加入5μL上述連接產物，輕輕旋轉離心管以混勻內容物，冰浴30min；將離心管置于42℃熱擊60-90秒，然后迅速置冰浴3分鐘。向離心管中加入500μL液體LB培養(yǎng)基（不含氯霉素），混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45分鐘（150轉/分鐘）；目的是使質粒上相關的抗性標記基因表達，使菌體復蘇。吸取100μL培養(yǎng)液加到含氯霉素5mg/L的LB固體培養(yǎng)基上，用無菌的彎頭玻棒輕輕將細胞均勻涂開。將平板置于室溫直至液體被吸收，倒置平板，37℃培養(yǎng)12-16小時。挑選單菌落，保藏得到的轉化子。

轉化子在含氯霉素5mg/L的LB培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)12h。用質粒提取試劑盒（B518188）提取質粒。所提取質粒進行酶切、測序鑒定，鑒定正確的重組質粒命名為pHT01-1e。

8、質粒pHT01-1e轉化嗜酸乳桿菌

（1）嗜酸乳桿菌感受態(tài)細胞的制備

培養(yǎng)基A（100mL）：蛋白胨1g，酵母粉0.5g，NaCl 1g，山梨醇9g，pH值為6.5。

溶液B（100mL）：山梨醇9g，甘露醇9.25g，葡萄糖10g。

溶液C（10mL）：9mL溶液B+1mL甘油。

1）嗜酸乳桿菌選育

嗜酸乳桿菌CCTCCAB96031接菌種于2mL培養(yǎng)基A中，37℃、200rpm過夜培養(yǎng)，約10h。然后接種于不含抗生素的MLB平板，挑選單菌落，挑選的單菌落表面較為光滑，菌落比一般菌落大。

挑選的菌落在接菌種于2mL培養(yǎng)基A中，37℃、200rpm過夜培養(yǎng)，約10h。得到過夜培養(yǎng)的菌液。

2）將2mL過夜培養(yǎng)的菌液添加到98mL培養(yǎng)基A中，37℃、200rpm培養(yǎng)3～4h。

3）將菌液冰水浴10～15min，然后4℃、5000rpm離心10min收集菌體。

4）用20mL預冷的溶液B重懸，如此漂洗3次。

5）將洗滌后的菌體重懸于600μL溶液C中，混勻后按60μL每管分裝于預冷的EP管中，得到嗜酸乳桿菌感受態(tài)細胞。

（2）電轉化

將質粒pHT01-1e加入嗜酸乳桿菌感受態(tài)細胞中并冰上預冷10min后加入到預冷的電轉化杯中。在電壓為1.5kV（P.LENGTH＝100μs，PULSES=04，INTERVAL=555ms）條件下電擊后，迅速加入500μL培養(yǎng)基A，再轉至EP 管中，37℃、200rpm培養(yǎng)3h后涂布于含氯霉素5mg/L的MLB平板上。30℃培養(yǎng)32h，從平板上生長的單菌落中篩選同源重組成功的轉化子，同源重組成功的轉化子即為要構建的嗜酸乳桿菌工程菌。

將所篩選的嗜酸乳桿菌工程菌接種于裝有100mL MLB培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，用鹽酸調節(jié)pH為3.0，30℃搖床培養(yǎng)24h，測培養(yǎng)液纖維素外切酶酶活為0.00018 U/mL，該結果表明嗜酸乳桿菌工程菌構建成功。

纖維素外切酶酶活測定方法為：取2g微晶纖維素粉末，溶于10mL 0.2M醋酸-醋酸鈉緩沖液（pH4.8）中，加入培養(yǎng)液0.5mL，50℃水浴30min，DNS法（見文獻，甄靜, 王繼雯, 謝寶恩, 等. 一株纖維素降解真菌的篩選、鑒定及酶學性質分析[J]. 微生物學通報, 2011, 38(5): 709?714.）測定生成還原糖的量。酶活定義：每分鐘水解微晶纖維素生成1μM還原糖所需酶的量為1U。

9、嗜酸乳桿菌工程菌熱控表達

（1）用直徑約0.2cm的接種環(huán)將嗜酸乳桿菌工程菌接種于裝有MLB培養(yǎng)基（鹽酸調節(jié)pH為3.0）的250mL三角瓶中，接種量為1環(huán)/50mL，裝液量為100mL。30 ℃搖床培養(yǎng)24h得到培養(yǎng)液，測得培養(yǎng)液纖維素外切酶酶活為0.00018U/mL。

（2）按照上述條件將嗜酸乳桿菌工程菌接種到MLB培養(yǎng)基（鹽酸調節(jié)pH為3.0）中，先30℃搖床培養(yǎng)10h，再40℃培養(yǎng)14h得到培養(yǎng)液，測得培養(yǎng)液纖維素外切酶酶活0.0025U/mL。

從不同培養(yǎng)溫度可以看出，在30℃下纖維素外切酶酶活較低，說明沒有增強表達纖維素外切酶；在分段前期30℃后期40℃培養(yǎng)條件下，纖維素外切酶酶活增加，說明纖維素外切酶的表達在高溫下被增強，這說明在酸性高溫下可以增強纖維素酶的表達。上述內容表明本發(fā)明實現(xiàn)了纖維素外切酶在嗜酸乳桿菌中的熱控表達。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

SEQUENCE LISTING

<110> 湖北工業(yè)大學

<120> 酸性環(huán)境下纖維素外切酶在乳桿菌中表達的方法

<130> 1

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> SD序列

<400> 1

agtcagtctt cagtcttcaa aaataaataa ggagtgtcaa aaa 43

<210> 2

<211> 90

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 信號肽編碼序列

<400> 2

atgattcaaa aacgaaagcg gacagtttcg ttcagacttg tgcttatgtg cacgctgtta 60

tttgtcagtt tgccgattac aaaaacagcc 90

<210> 3

<211> 1518

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> 纖維素外切酶基因序列

<400> 3

atgcaccacc agcgcgcttt attattctct gctttattaa ctgctgtacg cgctcaacag 60

gctggtactt taactgaaga ggttcaccca tctttaactt ggcaaaaatg tacatcagtt 120

ggatcttgta ctgagcaatc tggatctgta gttattgatt ctaattggcg ttggactcac 180

tcagttgacg actctactaa ctgttataca ggaaatactg tttctttaat cggaacttac 240

gttttacatt ggttaactca tattactgtt ggttttaatt cattaccttg acgttgaaat 300

ttatgtgatc agttacgtcc aggtcgttct cgtttacgtg ttcatttacg ttaccatcat 360

tgacgtcgtt ttatcgatac agagatccgc cattggtttc agtgctggtt agcttgcgtt 420

tcacacggtc atgaatgacg tgagatccct gatgtacgtt tagcatgacg tcgtgtacat 480

ttctgacgcc gttgcgttta accacctatg tggatcgagt ggcgtgcagt tttacattgt 540

aacggtcgtc gttggcgtca tttaaaagtt ccttgtaagc agggacgttc tcaggttcgt 600

gatcgtatct tatgattacc tatgtctgct cgtccaaagg tacaccagcg tcgttctatg 660

tagtctttaa aggcttcttc taaattaatc tgttaaccag agcctggaca gcgccgttgg 720

ttaggtactt tttagcagca gtgacagcat cgttaccgtc agcctcgttt tttattacct 780

tgaaacggtt acttaggttc tcagtaagac ttagatcgta tcgatactcc ttctttacgt 840

caacaacaac ctgatcacgt ttgaggataa cagttacgtt ggaatgtttt aggttgatct 900

ttacgtcgtt atgaatgttt agaccgttct tcttcttgga tgttccgttt aaaccctatt 960

actggtactt gtgatccaga tggatgtgat tttaatcctt atcgtatggg aaatgagtca 1020

ttttatggag caggaaaaat tgtagatact ggttctaaaa tgactgtagt tactcagttt 1080

attacagacg gatcttcttc tttatctgaa attaaacgct attatgttca aaatggtaag 1140

gtaatcgcta atgctgaatc ttctatttca ggtgttacag gtaattctat tactactgat 1200

ttttgtacag ctcaaaaaaa agctttcgga gatgatgacg tttttgcagc tcacaacgga 1260

ttagcaggaa tttctgacgc tatgtcatct atggtattaa ttttatcttt atgggacgac 1320

tattactctt ctatggaatg gttagattct gattaccctg aaaatgcaac tgcaactgat 1380

cctggagtag ctcgtggtac ttgtgattct gaatctggag ttccagctac tgttgaaggg 1440

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ttttctgcat ctgcttaa 1518

<210> 4

<211> 3326

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> DNA序列1

<400> 4

ccctctagac catagctaac agtggaacgt ggcaatattt acttgatacc cataagatcg 60

gaaaattacc tgcagaacaa atgaatgtga ttgagcctgg gcaaactaaa acttttggag 120

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ttgagggtac aattgaggat gcagacgcct atatgatgga attcaattac gatacgatga 300

tgcttagaga tggcccttat tcttggtcat taaagcagcg aattttgtca gatgtggggc 360

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aagacttaga tcgtatcgat actccttctt tacgtcaaca acaacctgat cacgtttgag 1620

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gtgattttaa tccttatcgt atgggaaatg agtcatttta tggagcagga aaaattgtag 1800

atactggttc taaaatgact gtagttactc agtttattac agacggatct tcttctttat 1860

ctgaaattaa acgctattat gttcaaaatg gtaaggtaat cgctaatgct gaatcttcta 1920

tttcaggtgt tacaggtaat tctattacta ctgatttttg tacagctcaa aaaaaagctt 1980

tcggagatga tgacgttttt gcagctcaca acggattagc aggaatttct gacgctatgt 2040

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tcaaggatga atagtgaaag tttgtgaaaa atcgctttca caaatagtca aaatataaaa 2640

gaaatacaaa aaaattttca aaaaagtata aatacaattt gtggtaggga ataaatataa 2700

ataccacaaa atatagattg actcttgaga gattgtggaa aaacaatata gaatttttgg 2760

gaaacaatgt taaaatagac cattatgaat ataaaaattg tttgtgttgg aaaattaaaa 2820

gaaaaatatt ttaaagatgc gattgcggaa tatcaaaagc gtttaagccg ttttgctaaa 2880

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gaaaaggtaa aagagattga gggacaacga atcctgagta agattaaaga taaagaatat 3000

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