本發(fā)明屬于血友病B領(lǐng)域，特別涉及一種高活性凝血因子IX突變體、重組蛋白與融合蛋白的制備與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

血友病B是由于高活性凝血因子IX缺陷所導(dǎo)致的出血性疾病，重型病人的因子IX活性往往低于正常的1％，經(jīng)常發(fā)生自發(fā)的出血導(dǎo)致肌肉血腫或者關(guān)節(jié)畸形。輸注因子IX制劑(目前通常是體外重組表達(dá)的因子IX蛋白)補(bǔ)充患者體內(nèi)的因子IX水平是目前唯一有效的治療方法，但是需要頻繁的給藥?；蛑委熓悄壳罢谂R床試驗(yàn)的治療方法，通過病毒載體將正常的因子IX基因?qū)牖颊唧w內(nèi)長(zhǎng)期表達(dá)，從而達(dá)到提高因子IX水平，預(yù)防出血的目的。目前進(jìn)行的基因治療臨床試驗(yàn)共三項(xiàng)。

2009年在意大利的padua的一個(gè)血栓性疾病的患者中發(fā)現(xiàn)一種突變的因子IX蛋白，Arg384Leu(R384L)，它的活性是正常人的7～9倍[X-Linked Thrombophilia with a Mutant Factor IX(Factor IX Padua),Paolo Simioni,The new england journal of medicine]。隨后的研究就把這種突變基因通過腺相關(guān)病毒載體(AAV)用于基因治療(PCT/EP2009/061935)，臨床試驗(yàn)獲得了非常好的效果，病人的因子IX水平達(dá)到了正常的20％左右。

在專利中(PCT/EP2009/061935)，共提及了三種突變，均位于384位氨基酸，分別是Arg384Leu(r384l)，Arg384Asp(R384D)和Arg384Gln(R384Q)，其中，除Arg384Leu為自然發(fā)生外，其他兩種為人工構(gòu)建。體外表達(dá)的重組R384L的活性比正常的因子IX高7～9倍，R384D高4～5倍，而R384Q高13倍以上。因?yàn)锳rg384Leu是在意大利的血栓患者中所發(fā)現(xiàn)的，除了形成血栓外，沒有造成其他疾患，也沒產(chǎn)生抗體，沒有安全隱患，最終被專利持有人用于臨床的基因治療。選擇Arg384Leu而不是活性更好的Arg384Gln的另外一條理由是擔(dān)心活性更高導(dǎo)致血栓形成。

1999年發(fā)表于j.biol.chem的論文[Protease and EGF1 Domains of Factor IXa Play Distinct Roles in Binding to Factor VIIIa，Vol.274,No.26,Issue of June 25,pp.18477–18486,1999]，也描述了因子IX突變Arg384Gln，文章作者在體外重組表達(dá)了這個(gè)蛋白，但是結(jié)果并沒有顯示高活性，僅為正常的(65％)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種高活性凝血因子IX突變體、重組蛋白與融合蛋白的制備與應(yīng)用，該突變體在人體中發(fā)現(xiàn)證實(shí)了凝血因子IX突變Arg384Gln確實(shí)導(dǎo)致因子IX活性升高，而且沒有導(dǎo)致除凝血機(jī)制異常之外的其他危害，對(duì)人體是安全的，打破了現(xiàn)有研究的技術(shù)偏見；經(jīng)過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)正進(jìn)行臨床試驗(yàn)的Arg384Leu活性相仿，具有很好的基因治療與重組蛋白替代治療前景。

本發(fā)明提供了一種高活性凝血因子IX突變體，核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，位置1151位的核苷酸為A而非G。

凝血因子IX表達(dá)編碼優(yōu)化序列如SEQ ID NO:3所示。

本發(fā)明還提供了一種高活性凝血因子IX的突變蛋白，位置384的氨基酸為Q而非R。

具體的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本發(fā)明還提供了一種編碼突變蛋白的核酸，或與所述編碼核酸長(zhǎng)度相同且與所述編碼核酸完全互補(bǔ)的核酸。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)突變蛋白(hFIXR384Q)進(jìn)行基因治療的載體rAAV-hFIXcoR384Q，其制備和檢驗(yàn)包括如下步驟：

(1)利用三質(zhì)粒方法制備AAV載體：將rAAV-hFIXcoR384Q載體質(zhì)粒，包含AAV的Rep/Cap的輔助質(zhì)粒及包含腺病毒輔助基因的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，然后將rAAV-hFIXcoR384Q載體純化及檢測(cè)滴度。其它載體rAAV-hFIXcoR384L和rAAV-hFIXco利用同樣的方法制備。

(2)將純化的rAAV-hFIXR384Q、rAAV-hFIXcoR384L和rAAV-hFIXco載體注射B型血友病小鼠。選用4-8周的血友病小鼠，通過尾靜脈將三種載體以4x10¹¹病毒顆粒/毫升分別注射6-7只小鼠。PBS注射3只小鼠為陰性對(duì)照。

(3)半凝固法檢測(cè)IX因子活性。在注射前和注射后第2周和第四周通過眼睛取血獲得血漿，然后通過半凝固法檢測(cè)血漿中的IX因子活性。

本發(fā)明還提供了一種高活性凝血因子IX的突變蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)將人野生型或因子IXArg384Gln突變的人凝血因子IX基因連入載體中，得到重組載體；

(2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組細(xì)胞克隆；

(3)于無血清培養(yǎng)基中連續(xù)灌流培養(yǎng)上述重組細(xì)胞克隆，誘導(dǎo)重組高活性凝血因子IX的突變蛋白的表達(dá)；

(4)分離純化、過濾，最后灌裝、凍干，得到所表達(dá)的高活性凝血因子IX的突變蛋白。

所述步驟(3)中的無血清培養(yǎng)基為“SAFC Biosciences EX-CELL^TM 302”(商品化的試劑)。

所述步驟(4)中的純化包括初純和精純。

本發(fā)明還提供了一種高活性凝血因子IX的突變蛋白的應(yīng)用，應(yīng)用于制備基因治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種高活性凝血因子IX的突變蛋白的應(yīng)用，應(yīng)用于制備血友病B或其他出血性疾病的重組蛋白治療藥物。

本發(fā)明還提供了一種高活性凝血因子IX的突變蛋白的應(yīng)用，應(yīng)用于制備融合蛋白延長(zhǎng)凝血因子IX突變體半衰期，正常凝血因子IX在血漿中的半衰期為22小時(shí)，肝臟蛋白質(zhì)水解以及受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用也將同樣清除外源引入的重組凝血因子IX自然突變體。與凝血因子IX自然突變體融合的蛋白包括但不局限于人白蛋白、免疫球蛋白Fc、轉(zhuǎn)鐵蛋白以及alpha1抗胰蛋白酶等。

有益效果

本發(fā)明證實(shí)了IX突變Arg384Gln確實(shí)導(dǎo)致因子IX活性升高，而且沒有導(dǎo)致除凝血機(jī)制異常之外的其他危害，對(duì)人體是安全的，打破了現(xiàn)有研究的技術(shù)偏見；經(jīng)過試驗(yàn)可以發(fā)現(xiàn)正進(jìn)行臨床試驗(yàn)的Arg338Leu活性相仿，具有很好的基因治療和重組蛋白替代治療前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明高活性凝血因子IX突變的示意圖；

圖2為本發(fā)明載體結(jié)構(gòu)的示意圖；

圖3為小鼠血漿凝血因子IX活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。

實(shí)施例1

高活性凝血因子IX的突變蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

高活性凝血因子IX的突變蛋白的制備方法，包括如下步驟：

(1)將人野生型或因子IXArg384Gln突變的人凝血因子IX基因連入載體中，得到重組載體；

(2)將上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得到重組菌株；

(3)于無血清培養(yǎng)基中連續(xù)灌流培養(yǎng)上述重組菌株，誘導(dǎo)重組高活性凝血因子IX的突變蛋白的表達(dá)；

無血清培養(yǎng)基為“SAFC Biosciences EX-CELL^TM 302”(商品化的試劑)。為保證產(chǎn)品安全，防止血液來源制劑傳播感染性疾病，故應(yīng)用無血清培養(yǎng)基用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)、蛋白表達(dá)，細(xì)胞經(jīng)對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，將細(xì)胞密度維持在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)，維持凝血因子IX高表達(dá)。

(4)分離純化與凍干，從而得到所表達(dá)的凝血因子IX突變蛋白即相關(guān)融合蛋白。

在培養(yǎng)基收集后，經(jīng)深層濾器澄清過濾并進(jìn)一步分離純化。純化步驟分為初純和精純兩個(gè)階段，初純：將過濾澄清的培養(yǎng)液在10倍超濾濃縮后通過有機(jī)溶劑/洗滌劑法滅活脂包膜病毒即HIV1/2、HCV以及HBV等；精純：以離子交換(陰離子和陽離子)和分子篩等色譜層析方法進(jìn)一步去除產(chǎn)品中殘留以宿主細(xì)胞分泌的其他蛋白為主的雜質(zhì)。純化蛋白經(jīng)過超濾換液、調(diào)節(jié)配方后再進(jìn)行即20nm納米膜除病毒過濾并凍干。凍干過程為速凍、淬火、冷凍、真空、主干燥、后干燥。凍干配方以甘氨酸、甘露醇、氯化鈉、氯化鈣等惰性糖類以及無機(jī)鹽為主(組成為甘氨酸、甘露醇、氯化鈉、氯化鈣等；凍干時(shí)間為30小時(shí))。

實(shí)施例2

高活性凝血因子IX的基因治療AAV載體的制備方法，包括如下步驟：

(1)利用三質(zhì)粒方法制備AAV載體。將rAAV-hFIXcoR384Q載體質(zhì)粒，包含AAV的Rep/Cap的輔助質(zhì)粒及包含腺病毒輔助基因的輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，然后將rAAV-hFIXcoR384Q載體進(jìn)行氯化銫超速離心純化及通過銀染和定量PCR檢測(cè)滴度。其它載體rAAV-hFIXcoR384L和rAAV-hFIXco利用同樣的方法制備。

(2)將純化的rAAV-hFIXR-384Q、rAAV-hFIXco-R384L和rAAV-hFIXco載體注射B型血友病小鼠。選用4-8周的血友病小鼠，通過尾靜脈將三種載體以4x10¹¹病毒顆粒/毫升分別注射6-7只小鼠。PBS注射3只小鼠為負(fù)對(duì)照。

(3)aPTT檢測(cè)IX因子活性。在注射前和注射后第2周和第4周通過眼睛取血獲得血漿，然后通過aPTT檢測(cè)血漿中的IX因子活性。小鼠血漿凝血因子IX活性見圖3。

凝血因子IX活性和抗原檢測(cè)方法：

①凝固法檢測(cè)凝血因子IX活性：

正?；旌涎獫{用OV Buffer分別進(jìn)行1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320稀釋，血漿待測(cè)樣本進(jìn)行1:10和1:20稀釋，細(xì)胞上清液不處理。取50微升稀釋的正常混合血漿、待測(cè)血漿樣本或轉(zhuǎn)染凝血因子IX表達(dá)載體的細(xì)胞上清液，加入50微升凝血因子IX基質(zhì)血漿，加入APTT試劑，37℃溫育3分鐘，再加入50微升氯化鈣，ST4半自動(dòng)血凝儀(Stago公司，法國(guó))上記錄凝固時(shí)間。以正?；旌涎獫{1:10稀釋的凝血因子IX活性為100％，以不同稀釋度對(duì)應(yīng)的凝固時(shí)間的log值和對(duì)應(yīng)的活性得log值建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，若相關(guān)系數(shù)R2大于0.95，則將待測(cè)樣本的值帶入計(jì)算，得到待測(cè)樣本的凝血因子IX活性。

②雙抗夾心法檢測(cè)凝血因子IX的抗原：

用包被液(1.59g/L碳酸鈉和2.94g/L碳酸氫鈉，pH 9.6)將包被抗體(F9ELISA試劑盒,Affinity Biologicals,EIA9-0035R1)1:100稀釋，加入稀釋抗體100ul/孔，室溫孵育2小時(shí)。重復(fù)洗滌3次。將正?；旌涎獫{用樣品稀釋液(23.8g HEPES(free acid)/L,5.84g/L NaCl,3.72g/L Na2EDTA,10g/L BSA,0.1％吐溫-20，Ph 7.2)分別1:100對(duì)倍稀釋至1:3200。待測(cè)血漿樣本以1:200,1:400和1:800稀釋，細(xì)胞上清液分別為原液、1:10和1:100稀釋。每孔加入100ul稀釋好的正混血漿或待測(cè)樣品，室溫放置90min。重復(fù)洗滌3次。將檢測(cè)抗體用樣品稀釋液1:100稀釋，每孔加入100ul的稀釋完的檢測(cè)抗體，室溫放置90min。重復(fù)洗滌3次。每孔加入100ul的OPD底物，待出現(xiàn)穩(wěn)定的黃色之后(約5-10min)，每孔加入100ul的終止液。用酶標(biāo)儀在450nm的波長(zhǎng)下讀取吸光度。建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算待測(cè)樣本的抗原值。

③F9基因外顯子擴(kuò)增及測(cè)序引物和反應(yīng)條件

1)PCR擴(kuò)增

(1)引物：

F9 E1F CAACCTTAAGAATCTGACAGTAAAAA

F9 E1R TGCTGTCAAATCATGTAATCAAAA

F9 E2_3F GATTTTGGCTCCATGCCCTA

F9 E2_3R GTTCCCACACTGGCATAACC

F9 E4F CAGCTGGCTTCCAGGTCAGT

F9 E4R GCTTCTTGAACTCATATCCTGAAA

F9 E5F AACATGAATGCCCCCAATGT

F9 E5R TGATTTCAAAAGGAAGCAGATTCA

F9 E6F AGGATGGGCCTCAATCTCAA

F9 E6R GGAGGCCTTCTCACATTGGT

F9 E7F CATTCCATTTCTGCCAGCAC

F9 E7R TGACCCTTCTGCCTTTAGCC

F9 E8F GGTCAGTGGTCCCAAGTAGTCA

F9 E8R GGCTGGGCCCTTAGAAATG

(2)反應(yīng)體系：包含1μl的10x HotStarTaq buffer，0.8μl的2.5mM dNTP，0.2μl的25mM Mg2+，0.06μl的5U/μl HotStarTaq polymerase，2μM的上下游引物各0.5μl，1μl的DNA模板，最后用H2O補(bǔ)足至10μl。

(3)反應(yīng)條件：95℃15min；94℃15s，62℃40s(每個(gè)循環(huán)減0.5℃)，72℃1min，11個(gè)循環(huán)；94℃15s，56℃30s，72℃1min，24個(gè)循環(huán)；72℃2min。

2)測(cè)序

(1)測(cè)序引物

F9 E1R TGCTGTCAAATCATGTAATCAAAA

F9 E2_3F GATTTTGGCTCCATGCCCTA

F9 E4F CAGCTGGCTTCCAGGTCAGT

F9 E5F AACATGAATGCCCCCAATGT

F9 E6R GGAGGCCTTCTCACATTGGT

F9 E7R TGACCCTTCTGCCTTTAGCC

F9 E8F GGTCAGTGGTCCCAAGTAGTCA

F9 E8R GGCTGGGCCCTTAGAAATG

(2)反應(yīng)體系：3μl BigDye3.1mIX,2μl濃度為1μM的測(cè)序引物，1-2μl純化的PCR產(chǎn)物。

(3)反應(yīng)條件：96℃1min；96℃10s，50℃5s，60℃4min，28個(gè)循環(huán)。

患者及其家系成員凝血因子IX活性和抗原水平見表1：

表1

注：患者服用凝血因子IX合成抑制劑華法林治療中，PT-INR 2.26。