本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母及構(gòu)建方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白色污染是全球所有城市都存在的一種環(huán)境污染，主要是指人們在日常生活中隨意丟棄的塑料垃圾對環(huán)境造成的破壞，包括常見的塑料杯、一次性飯盒、塑料袋等。這些塑料類產(chǎn)品以石油為原料，采用聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙烯等高分子化合物制成，難以進(jìn)行降解，再加上生活中的塑料包裝大多呈白色，被人們使用并隨意丟棄后會呈現(xiàn)出丑、臟、亂、雜等無秩序、不協(xié)調(diào)的特點，干擾和刺激人們的視覺，讓人產(chǎn)生厭煩心理，所以被稱為白色污染。而白色污染物的很大一部分是PET(聚對苯二甲酸乙二醇酯)制品。目前，世界上PET的年產(chǎn)量達(dá)到了2700多萬噸，雖然PET不會直接對環(huán)境造成危害，但其廢棄物對大氣和微生物的抵抗性很強(qiáng)，在自然環(huán)境中的存在周期為16-48年，而且隨著PET產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，其廢棄物的數(shù)量極其巨大，從環(huán)境行為和生態(tài)效應(yīng)考慮，PET廢棄物已成為全球性的環(huán)境污染有機(jī)物。

目前降解PET的方法主要有化學(xué)降解和生物降解兩大類，在實際應(yīng)用中PET的化學(xué)分解法主要有水解法和醇解法，此外還有氨解、胺解和熱解等。但是這些方法通常成本較高、效率較低并且不環(huán)保，避免不了降解PET后給環(huán)境帶來二次污染；而生物降解方法相對化學(xué)降解工藝更簡單、更節(jié)能環(huán)保、且不會造成二次污染。因此生物降解將是從根本上解決廢棄PET污染的最好方法。

聚對苯二甲酸乙二醇酯分解酶(PETase)是目前唯一一個在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)的能降解PET的酶，分子量約為32KD，能將PET降解為單(2-羥乙基)對苯二甲酸或?qū)Ρ蕉姿?，其最大的?yōu)勢是，與其他能降解PET的真菌中的酶LCC、TfH、FsC相比，其在低溫段(20～40℃)的酶活顯著高于其他酶，這意味著在實際應(yīng)用中較容易達(dá)到適宜的反應(yīng)條件，工業(yè)應(yīng)用前景較好。

疏水蛋白HGF1/HFB1是一種絲狀真菌產(chǎn)生的小分子量(12KD左右)蛋白質(zhì)，最主要的功能之一就是能夠自主裝在任何親/疏水界面形成一層兩親性的膜來改變界面的性質(zhì)，并且該蛋白具較強(qiáng)耐高溫、耐酸堿和較低免疫原性等的特點。但目前尚未有細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組菌的報道。

參考文獻(xiàn)：

[1]Shosuke Yoshida,Kazumi Hiraga,Toshihiko Takehana,Ikuo Taniguchi,Hironao Yamaji,Yasuhito Maeda,Kiyotsuna Toyohara,Kenji Miyamoto,Yoshiharu Kimura,Kohei Oda.A bacterium that degrades and assimilates poly(ethylene terephthalate)[J].science，2016(351)：1196-1199.

[2]Li Xiuhua,Wang Ziying.Research Progress on Degradation of PET[J].塑料科技，2011(4):110-114.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的構(gòu)建。

本發(fā)明的第三個目的是提供一種細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案概述如下：

細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母的構(gòu)建，包括如下步驟：

(1)從畢赤酵母GS115基因組中克隆出錨定蛋白基因；化學(xué)合成疏水蛋白基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因；

(2)利用PCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將錨定蛋白基因的核苷酸序列和疏水蛋白基因連接得到融合序列2；

(3)將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體上，得到融合表達(dá)載體2；

(4)將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

錨定蛋白基因優(yōu)選：SEQ ID No.3所示的GCW51、SEQ ID No.4所示的GCW61或SEQ ID No.8所示的GCW21。

疏水蛋白基因優(yōu)選SEQ ID NO.2所示的HGF1基因、SEQ ID NO.9所示的HFB1基因、SEQ ID NO.10所示的SC3基因或SEQ ID NO.11所示的HFB2基因。

畢赤酵母表達(dá)載體優(yōu)選：ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC。

上述構(gòu)建方法構(gòu)建的細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母。

上述細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母在全細(xì)胞催化分解PET的用途。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明應(yīng)用整合載體進(jìn)行表達(dá)，避免了選擇壓力且載體不容易丟失。當(dāng)PETase在細(xì)胞表面表達(dá)時，相當(dāng)于做了酶的固定化，將其固著定位于細(xì)胞表面。經(jīng)固定化后的酶與游離酶相比具有穩(wěn)定性高、回收方便、易于控制、可反復(fù)使用、成本低廉等優(yōu)點，避免了蛋白純化的繁瑣。而利用疏水蛋白與PETase在畢赤酵母中進(jìn)行共展示，由于疏水蛋白具有雙親性，會自發(fā)以親水面與酵母細(xì)胞表面結(jié)合，疏水面朝外，增強(qiáng)重組畢赤酵母的穩(wěn)定性。

附圖說明

圖1為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot圖；其中：

圖1A為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的Western Blot圖；

圖1B為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的Western Blot圖。

圖2為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的相對酶活。

圖3為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1/P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫熒光檢測結(jié)果圖；其中：

圖3-1為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的免疫熒光檢測結(jié)果圖；

圖3-2為重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的免疫熒光檢測結(jié)果圖；

具體實施方案

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。

錨定蛋白GCW21(NCBI Reference Sequence:XM_002491407)；

錨定蛋白GCW51(NCBI Reference Sequence:XP_002493782)；

錨定蛋白GCW61(NCBI Reference Sequence:XP_002494322)序列。

畢赤酵母GS115(pichia pastoris GS115)市售。也可以用其它的畢赤酵母應(yīng)用于本發(fā)明。

ppic9、ppic9k、ppiczaA、ppiczaB、ppiczaC，均為市售。

大腸桿菌(E.coli)DH5α，市售。

實施例1 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的制備及應(yīng)用：

一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因；具體步驟如下：

畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

根據(jù)如SEQ ID No.3所示的GCW51序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物51-F/61-F和下游引物51-R/61-R，其中劃線部分為酶切位點，以P.pastoris GS115基因組DNA為模板，擴(kuò)增GCW51、GCW61基因。

51-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGATGACGATGACTCATTAC

51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得GCW51基因、GCW61基因。

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

根據(jù)化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的

PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，其中下劃線部分為酶切位點，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

將所得PETase與GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr。

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟如下：

將PETase-linker-GCW51基因和ppic9載體同時用Xho I和EcoR I雙酶切后，將得到的酶切PETase-linker-GCW51基因片段連接到雙酶切后的ppic9載體上；將HGF1-linker-GCW61基因和ppiczaA載體同時用EcoR I和Not I雙酶切后，將得到的酶切HGF1-linker-GCW61基因片段連接到雙酶切后的ppiczaA載體上；將上述兩種連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α中，并挑取陽性克隆，在LB液體培養(yǎng)基上擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，得連接有PETase-linker-GCW51的融合表達(dá)載體p9P51(融合表達(dá)載體1)和連接有HGF1-linker-GCW61基因的融合表達(dá)載體pAHG61(融合表達(dá)載體2)。

用Xho I和EcoR I雙酶切質(zhì)粒p9P51，并用1％瓊脂糖凝膠電泳驗證；用EcoR I和Not I雙酶切質(zhì)粒pAHG61并用1％瓊脂糖凝膠電泳驗證；

在上述步驟中，所述的目的基因片段與載體的連接采用thermo公司的T4DNA連接酶進(jìn)行連接。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物的大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，按如下方法進(jìn)行：

(1)取一管感受態(tài)細(xì)胞E.coli DH5α于冰上緩慢溶解，加入要轉(zhuǎn)化的質(zhì)?；蜻B接產(chǎn)物(10μL)，輕混后冰浴30min；

(2)42℃熱激90s后，迅速冰浴5min；

(3)加入900μL，37℃溫浴的LB培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；

(4)取200微升涂布于含氨芐青霉素(100μg/mL)的LB選擇平板(對于p9P51載體而言)和含zeocin(25μg/mL)的LB選擇平板(對于pAHG61載體而言)上，37℃倒置培養(yǎng)12-16h；

(5)挑取單克隆，進(jìn)行后續(xù)質(zhì)粒提取以及驗證實驗。

在上述步驟中，所述的連接產(chǎn)物陽性克隆驗證，按如下方法進(jìn)行：

(1)從篩選平板上挑取p9P51轉(zhuǎn)化子，接入5mL LB液體培養(yǎng)基中(含100μg/mL氨芐青霉素)，37℃搖床培養(yǎng)12-16h；從篩選平板上挑取pAHG61轉(zhuǎn)化子，接入5mL低鹽LB液體培養(yǎng)基(氯化鈉濃度為普通LB培養(yǎng)基一半)中(含25μg/mLzeocin)，37℃、避光搖床培養(yǎng)12-16h

(2)取5mL菌液，用質(zhì)粒小量提取試劑盒提取質(zhì)粒；

(3)取1μL質(zhì)粒提取液進(jìn)行Nanodrop檢測，檢測提取的質(zhì)粒濃度；

(4)將提取的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，驗證基因片段與載體的連接效果；

(5)將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測序或者進(jìn)行其他實驗，測序委托金唯智生物公司完成。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1，具體步驟如下：

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P51載體和pAHG61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株為細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW51-HGF1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW51-HGF1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-51-F/R以及hg-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-51-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六、細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris

PETase-GCW51-HGF1的應(yīng)用，具體步驟如下：

Western Blot實驗

一、P.pastoris PETase-GCW51-HGF1的SDS－PAGE電泳

二、轉(zhuǎn)膜

(1)轉(zhuǎn)一張膜需準(zhǔn)備6張7.0～8.3cm的濾紙和1張7.3～8.6cm的硝酸纖維素膜。切濾紙和膜時一定要戴手套。

(2)在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、濾紙和膜。

(3)將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊，在墊子上墊三層濾紙。

(4)要先將玻璃板撬掉才可剝膠，撬的時候動作要輕，要在兩個邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動，直到撬去玻板。除去小玻璃板后，將濃縮膠輕輕刮去(濃縮膠影響操作)，要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕搟去氣泡。將膜蓋于膠上，要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動)并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡。最后蓋上另一個海綿墊，合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行。

(5)將夾子放入轉(zhuǎn)移槽槽中，要使夾的黑面對槽的黑面，夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫。一般用100V轉(zhuǎn)移1h。

三、免疫反應(yīng)

(1)將膜轉(zhuǎn)移至含有封閉液的盒中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1h后,用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。

(2)將一抗用PBST稀釋至適當(dāng)濃度，4℃過夜孵育后,用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。

(3)將二抗用PBST稀釋至適當(dāng)濃度，室溫下孵育1h后，用PBST在室溫下脫色搖床上洗三次，每次10min。

四、化學(xué)發(fā)光，顯影，定影

圖1A的結(jié)果說明PETase和HGF1在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1成功表達(dá)。

HPLC測酶活實驗

配置酶活反應(yīng)所用到的一系列Buffer PBS緩沖液：用800ml雙蒸水溶解8g NaCl,0.2g KCl,1.44g Na2HPO4,0.24g KH2PO4，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，加水至1L，抽濾除菌。

Glycine/NaOH Buffer：0.2M Glycine溶液50ml；0.2M NaOH溶液8.8ml

混勻定容200ml，互相調(diào)pH到9.0

磷酸磷酸二氫鈉緩沖液pH＝2.50：0.02M H3PO4 1L；0.02M NaH2PO4 1L，

在1L燒杯中先加200～300ml磷酸，再往里兌磷酸二氫鈉，直到pH＝2.50

甲醇：甲醇一瓶為500ml,直接將兩瓶抽濾到一個1L的大瓶子里，有機(jī)濾紙。

終止液：90mL PBS+10mL DMSO

1.制樣(設(shè)置1個實驗組和1個對照組)。

a.取適量P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌液于EP管，3000g，4℃離心5min，去上清。

b.加入適量甘氨酸氫氧化鈉緩沖液(pH＝9.0)重懸菌液，離心去上清。

c.重復(fù)一次。

d.設(shè)置不同P.pastoris PETase-GCW51-HGF1菌量梯度(2ml、1ml、0.5ml、0.1ml、0.01ml)。

e.加入100微升甘氨酸氫氧化鈉緩沖液重懸菌液。

2.實驗組加入提前處理好的PET膜，對照組不加PET膜

3.在恒溫?fù)u床里40℃，18h，220rpm孵育反應(yīng)。

4.凍菌：剩余菌體用PBS洗兩次，用20％甘油重懸，凍存。

5.反應(yīng)結(jié)束后，4℃5000g離心10min

6.取上清，加入終止液

7.85℃滅活10min

8.12000rpm，離心10min，取100微升于新的EP管內(nèi)。

9.將配好的磷酸/磷酸二氫鈉緩沖液(pH＝2.5)和甲醇超聲30min。

10.過HPLC，上樣100微升，記錄好順序。

圖2的結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1能降解PET，且較野生型PETase酶活有顯著提升。

免疫熒光檢測

(1)取200uLP.pastoris PETase-GCW51-HGF1誘導(dǎo)培養(yǎng)液于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

(2)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細(xì)胞進(jìn)行重懸，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

(3)利用200uL的3mg/mLBSA的PBS緩沖液重懸菌體，于室溫下反應(yīng)1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

(4)利用含1uL一抗的200uL的3mg/mLBSA的PBS緩沖液重懸菌體，于4℃過夜處理，期間應(yīng)使菌體上下混勻。次日于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

(5)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細(xì)胞進(jìn)行重懸，室溫處理10min，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

(6)步驟(5)重復(fù)兩次。

(7)利用含1uL二抗的200uL的PBS緩沖液重懸菌體，避光室溫處理1h，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，保留菌體。

(8)PBS緩沖液對重組酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1細(xì)胞進(jìn)行重懸，避光室溫處理5min，期間應(yīng)使菌體上下混勻，于4℃，12000rpm，離心1min，棄上清留菌體。

(9)步驟(8)重復(fù)一次。

(10)用200uL的PBS緩沖液重懸，每次取10uL于潔靜載玻片制片。

圖3-1的結(jié)果說明PETase基因成功展示在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HGF1表面。

實施例2 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris

PETase-GCW51-HFB1的制備及應(yīng)用，包括如下步驟：

一、同實施例1步驟一。

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.3所示的GCW51錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

根據(jù)化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，其中下劃線部分為酶切位點，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HFB1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

將所得PETase與GCW51以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.6所示的PETase-linker-GCW51基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟見實施例1步驟四。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1，具體步驟如下：

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P51載體和pAHF61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW51-HFB1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW51-HFB1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-51-F/R以及hf-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-51-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-51-R：CCGGAATTCCTAGATCAATAGGGCAATGG

hf-61-F：CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

hf-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六、細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1的應(yīng)用，具體步驟同實施例1步驟六。

圖1B的結(jié)果說明PETase和HFB1在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1中成功表達(dá)。

圖2的結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1能降解PET，且較野生型PETase酶活有顯著提升。

圖3-2的結(jié)果說明PETase基因成功展示在重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW51-HFB1表面。

用SC3疏水蛋白(SEQ ID NO.10)或HFB2疏水蛋白(SEQ ID NO.11)，替代本實施例的疏水蛋白基因HFB1，其它參照本實施例，制備出細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW51-SC3；或細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW51-HFB2。

實施例3 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1的制備及應(yīng)用，包括如下步驟：

一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因、如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因；具體步驟如下：

畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

根據(jù)如SEQ ID No.8所示的GCW21序列、如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物21-F/61-F和下游引物21-R/61-R，其中劃線部分為酶切位點，以P.pastoris GS115基因組DNA為模板，擴(kuò)增GCW21、GCW61基因。

21-F:GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTGACCAGCGAATCTCTGTCAC

21-R:CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCGGCGGCAATT

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得GCW21基因、GCW61基因。

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

根據(jù)化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

將所得PETase與GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟同實施例1步驟四。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1，具體步驟如下。

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P21載體和pAHG61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW21-HGF1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW21-HGF1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-21-F/R以及hg-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-21-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-21-R：CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC測酶活實驗

操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗，實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HGF1能降解PET，且較野生型PETase酶活有顯著提升。

實施例4 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1的制備及應(yīng)用，包括如下步驟：

一、同實施例3步驟一；

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.8所示的GCW21錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

根據(jù)化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

將所得PETase與GCW21以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.28所示的PETase-linker-GCW21基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟同實施例1步驟四。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1，具體步驟如下。

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P21載體和pAHF61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW21-HFB1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW21-HFB1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-21-F/R以及hf-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-21-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-21-R：CCGGAATTCTTATAACAAAGCAGCG

hf-61-F：CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

hf-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC測酶活實驗

操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗，實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW21-HFB1能降解PET，且較野生型PETase酶活有顯著提升。

實施例5 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1的制備及應(yīng)用，包括如下步驟：

一、從畢赤酵母GS115基因組中克隆出如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因；具體步驟如下：

畢赤酵母GS115接種于YPD培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，離心收集細(xì)胞，利用提基因組試劑盒提取得到GS115酵母菌基因組DNA。

根據(jù)如SEQ ID No.4所示的GCW61序列，利用上游引物61-F’/61-F和下游引物61-R’/61-R，其中劃線部分為酶切位點，以P.pastoris GS115基因組DNA為模板，擴(kuò)增GCW61基因。

61-F’：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAG

61-R’：CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

61-F：GGTGGTGGAGGTAGTGGAGGAGGTGGTAGTAACAACCTATCAAACGAGAGT

61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATCAATAGAGCAACACCGGC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得GCW61基因。

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白HGF1基因和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

根據(jù)化學(xué)合成如SEQ ID NO.2所示的疏水蛋白基因HGF1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hg-F和下游引物P-R/hg-R，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HGF1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hg-F:CCGGAATTCCAACAGTGCACCACTGG

hg-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGACGTTAACCGGAACACATC

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HGF1基因。

將所得PETase與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HGF1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.7所示的HGF1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟同實施例1步驟四。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1，具體步驟如下。

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P61載體和pAHG61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW61-HGF1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW61-HGF1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-61-F/R以及hg-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-61-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-61-R：CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

hg-61-F：CCGGAATTCCAACAGTGCA

hg-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC

六.HPLC測酶活實驗

操作步驟參照實施例1的HPLC測酶活實驗，實驗結(jié)果說明重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HGF1能降解PET，且較野生型PETase酶活有顯著提升。

實施例6 細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1的制備及應(yīng)用，包括如下步驟：

一、同實施例5步驟一。

二、化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因。

三、利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和SEQ ID NO.1的核苷酸序列連接得到融合序列1；利用PCR將如SEQ ID No.4所示的GCW61錨定蛋白基因的核苷酸序列和如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1的核苷酸序列連接得到融合序列2，具體步驟如下：

化學(xué)合成如SEQ ID NO.9所示的疏水蛋白基因HFB1和如SEQ ID NO.1所示的PETase基因，設(shè)計上游引物P-F/hf-F和下游引物P-R/hf-R，以合成序列為模板擴(kuò)增PETase基因和HFB1基因。

P-F:CCGCTCGAGAAAAGAGATTACAAGGATGACGACGATAAGCAAACCAATCCTTATGCCCGTG

P-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCGCTACAGTTGGCGGTACGAA

hf-F:CCGGAATTCAGCAACGGCAACGGCAATGT

hf-R:ACTACCACCTCCTCCACTACCTCCACCACCAGCACCGACGGCGGTCT

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得PETase基因、HFB1基因。

將所得PETase與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr；將所得HFB1與GCW61以如SEQ ID No.5所示的linker為重疊區(qū)進(jìn)行overlap pcr

PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，回收目的基因片段，得如SEQ ID No.29所示的PETase-linker-GCW61基因(融合序列1)和如SEQ ID No.12所示的HFB1-linker-GCW61基因(融合序列2)。

四、將融合序列1連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppic9上，得到融合表達(dá)載體1；將融合序列2連接到畢赤酵母表達(dá)載體ppiczaA上，得到融合表達(dá)載體2，具體步驟同實施例1步驟四。

五、將融合表達(dá)載體1和融合表達(dá)載體2轉(zhuǎn)入表達(dá)宿主畢赤酵母中，得到細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母P.pastoris PETase-GCW61-HFB1，具體步驟如下。

電擊法轉(zhuǎn)化P.pastoris GS115細(xì)胞感受態(tài)制備

(1)從新鮮的畢赤酵母GS115(His-)平板上挑取單菌落，轉(zhuǎn)接至5mL YPD試管培養(yǎng)基中，30℃，250rpm培養(yǎng)過夜；

(2)第二天從試管培養(yǎng)物中取0.1-0.5ml過夜培養(yǎng)物，接種至含500ml新鮮YPD培養(yǎng)基的2L搖瓶，過夜生長至OD600約為1.3-1.5；

(3)從搖床上取酵母培養(yǎng)物，4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，之后在100mLYPD-HEPES-DTT(100ml YPD中加入20ml pH 8.0的HEPES緩沖液，再加入2.5ml新鮮配制的1M的DTT)培養(yǎng)基中重新懸浮細(xì)胞，30℃在搖床上培養(yǎng)15分鐘；從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；

(4)從搖床上取下細(xì)胞，冰浴半小時；4℃，1500g離心5分鐘以收集細(xì)胞，再用250ml預(yù)冷的滅菌水懸浮細(xì)胞；；

(5)如上離心，再用20ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞；

(6)如上離心，用1ml預(yù)冷的1M山梨醇懸浮細(xì)胞，至終體積約1.5ml；如上離心，用500μL冷超純水重新懸浮細(xì)胞，冰浴中備用。

電擊法轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)化子驗證

(1)取80μL上述細(xì)胞與5-20ug線性化的p9P61載體和pAHF61載體DNA混合，轉(zhuǎn)入預(yù)冷的0.2cm電轉(zhuǎn)杯中，在冰上放置5min；

(2)擦干電轉(zhuǎn)杯外壁水滴，放在電轉(zhuǎn)儀上；

(3)設(shè)置酵母參數(shù)“fungi”，“pic”，點擊Pulse；

(4)取出電轉(zhuǎn)杯，立即加入600微升L冰預(yù)冷1mol/L山梨醇，用槍輕輕吹打，在溫和轉(zhuǎn)移至1.5mL離心管中，30℃靜置培養(yǎng)1h后加入600微升YPD培養(yǎng)基，30℃，200rpm搖床分別培養(yǎng)1h、3h后分成200-600μL等份，涂于含75微克/毫升zeocin的YPDS平板上(設(shè)置感受態(tài)中不加入載體的對照組)；30℃避光培養(yǎng)48h后挑取單菌落于MD平板上進(jìn)行篩選，陽性菌落菌株細(xì)胞表面共展示PET分解酶和疏水蛋白的重組畢赤酵母，命名為P.pastoris PETase-GCW61-HFB1；

(5)提取轉(zhuǎn)化子(P.pastoris PETase-GCW61-HFB1)的基因組DNA，進(jìn)行PCR驗證，比較電泳條帶位置是否與陽性對照相同，PCR采用的引物為AOX上下游引物、P-61-F/R以及hf-61-F/R，對陽性菌進(jìn)行甘油保菌。

P-61-F：CCGCTCGAGAAAAGAGATT

P-61-R：CCGGAATTCTTAAATCAATAGAGCAACACCG

hf-61-F：CCGGAATTCAGCAACGGCAAC

hf-61-R：ATAGTTTAGCGGCCGCTTAAATC