本發(fā)明涉及廢水處理技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種耐高鹽耐高COD鹽水球菌處理廢水技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

鹽水球菌屬Salinicoccus的分類地位隸屬于細菌域真細菌界硬壁菌門芽孢桿菌綱芽孢桿菌目葡萄球菌科，是一類能夠耐受或嗜好輕度或中度鹽環(huán)境的微生物。根據(jù)LPSN(List of prokaryotic names with standing in nomenclature)數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計結(jié)果，目前Salinicoccus屬有15個種，分別是S.albus，S.alkaliphilus，S.amylolyticus，S.carnicancri，S.halitifaciens，S.halodurans，S.hispanicus，S.iranensis，S.jeotgali，S.kekensis，S.kunmingensis，S.luteus，S.qingdaonensis，S.roseus，S.salitudinis，S.salsiraiae，S.sesuvii，S.siamensis。鹽水球菌分布廣泛，目前已報道的樣品來源包括鹽場，鹽堿湖，鹽礦，沿海海水，海洋沉積物，荒漠土，鹽漬土，鹽巖層，柴達木盆地，海馬齒根際，發(fā)酵的海鮮，鹽冰場等。

鹽水球菌能產(chǎn)生多種耐高鹽的胞外水解酶，如蛋白酶，脂肪酶等，這些耐鹽的蛋白資源具有重要的應(yīng)用前景。Salinicoccus sp.strain QW6(后命名為S.iranensis)，具有亞碲酸鹽耐受和降解能力，經(jīng)過優(yōu)化亞碲酸鹽(0.005-0.5mM)降解率達99％；從這株菌中分離到由三個亞基組成的亞碲酸鹽還原相關(guān)的酶系。亞碲酸降解菌及其還原酶系的分離鑒定，不僅為微生物消除毒性無機物提供了新的見解，而且在廢水治理方面具有潛在的應(yīng)用價值。除此之外，Salinicoccus halodurans H3B36能夠在胞內(nèi)富集N(α)-acetyl-α-lysine，用以抵抗高鹽和高溫，這也是一種具有潛在應(yīng)用價值的相容性溶質(zhì)。

除提供重要的代謝產(chǎn)物、基因和蛋白資源外，鹽水球菌本身作為生產(chǎn)菌株，也具有廣闊的應(yīng)用前景。鹽水球菌能夠耐受高鹽環(huán)境，其作為生產(chǎn)菌株，不需經(jīng)過嚴格的滅菌消毒過程。Salinicoccus roseus W12能夠耐受高達20％的乳酸鹽，研究表明，交叉保護和能量代謝相關(guān)蛋白發(fā)揮重要功能；耐鹽耐有機酸的特性，使得鹽水球菌不僅在乳酸生產(chǎn)等微生物制造領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，而且在高鹽高COD廢水處理領(lǐng)域也具有潛在的應(yīng)用價值。目前尚無鹽水球菌具有致病性的報道，而且其革蘭氏染色呈陽性，細胞破裂后不會釋放出脂多糖等免疫抗原，不會引起人類免疫反應(yīng)。鹽水球菌的細胞是球形，具有更大的表面積體積比，也更利于物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運。

目前應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的微生物，如不同大腸桿菌菌株的基因組大小為4.64M到5.5M之間，枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168的基因組大小為4.22M，Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的基因組大小為3.31M；具有良好產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)PHB前景的耐鹽細菌Halomonas sp.TD01的基因組的大小是4.09M?；蚪M中存在著大量的假基因和在工業(yè)生產(chǎn)中非必需的基因，這些基因的擴增需要大量的物質(zhì)和能量，而且有些基因的產(chǎn)物可能對菌體生長帶來負面影響，所以有很多科學(xué)家嘗試通過基因工程將基因組上非必需的基因缺失，或通過理性設(shè)計構(gòu)建最小基因組的菌株。目前有7株鹽水球菌菌株完成了基因組測序(來源NCBI數(shù)據(jù)庫)，基因組大小2.55M-2.78M不等，而本發(fā)明提供的鹽水球菌菌株，基因組只有2.24M(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)。相比于其他常用的生產(chǎn)菌株，鹽水球菌的基因組普遍偏小，如果將天然具有較小基因組的鹽水球菌發(fā)展成為工業(yè)生產(chǎn)的底盤細胞，可能具有不可替代的優(yōu)勢。

但是，目前尚無鹽水球菌的遺傳工具和操作方法，極大地限制了其應(yīng)用潛力的開發(fā)。挖掘利用鹽水球菌的遺傳資源，并進一步開發(fā)鹽水球菌的應(yīng)用潛力，具有重要的實際意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

鹽水球菌具有良好的耐高鹽高COD的特性，尤其是耐高鹽高濃度有機酸，使其在高鹽高COD廢水處理等領(lǐng)域具有潛在的產(chǎn)業(yè)價值。化工、制藥等生產(chǎn)過程會產(chǎn)生大量的高鹽高COD廢水，這類廢水的處理一直是水處理的重點和難點。纖維素醚的生產(chǎn)過程會排放大量的高鹽高有機酸廢水，而且纖維素醚應(yīng)用范圍很廣，在我國產(chǎn)能很大。物理化學(xué)等處理方法可以實現(xiàn)部分高鹽廢水的脫鹽和降COD，但是處理成本高，而且會產(chǎn)生較嚴重的二次污染。

為了解決上述問題，本發(fā)明人經(jīng)過大量實驗和文獻研究：生物處理認為是生態(tài)環(huán)保的處理方法。用耐高鹽高COD的微生物將COD降低、去除或轉(zhuǎn)化為有價值的產(chǎn)品，處理后的普通鹽水經(jīng)脫鹽可獲得無機鹽或無機鹽水直接循環(huán)利用。鹽水球菌系統(tǒng)的構(gòu)建就是為實現(xiàn)高鹽高COD廢水的廉價、環(huán)保處理。

本發(fā)明的目的之一是提供一株耐高鹽高COD的鹽水球菌菌株。一株耐高鹽高COD的鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408,保藏編號為CGMCC No.13032。

本發(fā)明提供的細菌分離自天津大港油田采油井附近儲油罐下方的土壤樣品，分離方法是經(jīng)額外添加5％乙酸鈉鹽度10％的液體完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)兩次后，在相同培養(yǎng)基固體平板上劃線獲得單克隆，其實驗室內(nèi)部編號為408。

經(jīng)測定，該細菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達99％以上，由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408已于2016年9月22日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13032。

本發(fā)明提供鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度鹽度和高濃度乙酸鹽，在完全培養(yǎng)基中耐受NaCl濃度的范圍2-15％(培養(yǎng)基成分為：酸水解酪素7.5克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉1克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉20-150克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，pH調(diào)節(jié)到7.0-7.2)，能夠耐受高達5％的乙酸。

本發(fā)明的另一目的是提供一株鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E及其來源的兩個內(nèi)源性質(zhì)粒。

鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E已于2016年10月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13135。

本發(fā)明提供的兩個內(nèi)源性質(zhì)粒分離提取自鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中。兩個質(zhì)粒均為環(huán)形質(zhì)粒。

其中較小質(zhì)粒的大小為2191bp，命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2)；較大質(zhì)粒大小為3007bp，命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3)。

序列表中序列2由2191個核苷酸組成。其中，序列2中的自5′端第715-1641位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列4(由308個氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep1。

序列表中序列3由3007個核苷酸組成。其中，序列3中的自5′端第1067-2080位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列5(由337個氨基酸殘基組成)的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep2。

質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜如圖1所示，其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點有BamHI，ClaI，PvuII酶切位點各一個。其中，序列2中的自5′端第1500-1505位堿基為BamHI酶切位點；序列2中的自5′端第323-328位堿基為ClaI酶切位點；序列2的自5′端第1019-1024位堿基為PvuII酶切位點。質(zhì)粒pS408-1不含ApaI，BglII，EcoRI，EcoRV，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內(nèi)切酶位點，因此這些內(nèi)切酶位點可作為pS408-1的衍生載體的多克隆位點。

質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜如圖2所示，其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點有BamHI，ClaI，EcoRI，EcoRV酶切位點各一個。其中，序列3中的自5′端第1936-1941位堿基為BamHI酶切位點；序列3中的自5′端第2689-2694位堿基為ClaI酶切位點；序列3的自5′端第698-703位堿基為EcoRI酶切位點；序列3的自5′端第2821-2826位堿基為EcoRV酶切位點。質(zhì)粒pS408-2不含ApaI，BglII，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，PvuII，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內(nèi)切酶位點，因此這些內(nèi)切酶位點可作為pS408-2的衍生載體的多克隆位點。

為了進一步探討質(zhì)粒的應(yīng)用范圍，對其拷貝數(shù)進行了測定。質(zhì)粒pS408-1在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.90±0.13個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.12±0.07個；質(zhì)粒pS408-2在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.97±0.07個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.21±0.12個。質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的拷貝數(shù)都在1-2個范圍內(nèi)，均屬于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。

本發(fā)明的又一目的是提供pS408-1和pS408-2的衍生質(zhì)粒載體pTCS101和pTCS201。

由于質(zhì)粒pS408-1和pS408-2能夠在鹽水球菌中自主復(fù)制，在保證其提供的復(fù)制所需的元件完整的前提下，向其中引入性質(zhì)明確的其它功能DNA片段，或反過來將復(fù)制所需的元件完整的引入性質(zhì)明確的其他功能DNA序列，即可構(gòu)成可轉(zhuǎn)化鹽水球菌的衍生質(zhì)粒。

本發(fā)明提供的衍生質(zhì)粒是在pUCm-T的基礎(chǔ)上，首先連接入氯霉素抗性基因(方向為EcoRI到HindIII，質(zhì)粒命名為pTC)，然后分別連接入質(zhì)粒pS408-1的自5′端第1至2191位堿基或pS408-2的自5′端第1至3007位堿基至XbaI和HindIII位置，分別命名為pTCS101和pTCS201，物理圖譜如圖3和4所示。

這兩個衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點，都含有在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點，和在大腸桿菌及在鹽水球菌中篩選轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標記基因AmpR和CmR，是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質(zhì)粒。

也對穿梭質(zhì)粒在鹽水球菌中的拷貝數(shù)分別進行了測定。質(zhì)粒pTCS101在對數(shù)期的拷貝數(shù)是3.52±0.61個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是8.57±0.88個；質(zhì)粒pTCS201在對數(shù)期的拷貝數(shù)是2.23±0.20個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是5.34±0.35個。

以穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201為基礎(chǔ)，引入適當?shù)牡鞍妆磉_元件和目的基因，轉(zhuǎn)化鹽水球菌，以合適的條件培養(yǎng)即可得到足夠量的目的蛋白。如在pTCS101中克隆金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶編碼基因(Gene ID：3921373)和上下游功能序列，獲得的質(zhì)粒命名為pTCS101-LDH；經(jīng)電穿孔轉(zhuǎn)化至質(zhì)粒消除株Salinicoccus sp.PE獲得乳酸脫氫酶成功表達的菌株Salinicoccus sp.PE(pTCS101-LDH)。因此，基于質(zhì)粒pS408-1和pS408-2構(gòu)建而成各種表達載體均在本專利保護之列。

由本發(fā)明的鹽水球菌質(zhì)粒及其衍生質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化所得到的微生物也屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明的鹽水球菌質(zhì)粒載體為鹽水球菌的研究和開發(fā)提供了遺傳工具系統(tǒng)，將在鹽水球菌的研究和開發(fā)中發(fā)揮重要作用。

下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。

附圖說明

圖1質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜。

圖2質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜。

圖3質(zhì)粒pTCS101的物理圖譜。

圖4質(zhì)粒pTCS201的物理圖譜。

具體實施方式

下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中的百分含量，如無特別說明，均為質(zhì)量百分含量。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實施例1

鹽水球菌菌株的分離、制備、培養(yǎng)

本發(fā)明提供的細菌分離自天津大港油田采油井附近儲油罐下方的土壤樣品，分離方法是經(jīng)額外添加5％乙酸鈉鹽度10％的液體完全培養(yǎng)基富集培養(yǎng)兩次后，在相同培養(yǎng)基固體平板上劃線獲得單克隆，其編號為408。

經(jīng)測定，該細菌16S rDNA(序列1)與Salinicoccus salsiraiae RH-1，Salinicoccus jeotgali S2R53-5和Salinicoccus siamensis PN1-2的同源性都高達99％以上，由此確定其隸屬于鹽水球菌屬(Salinicoccus)。菌株已于2016年9月22日保藏中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)(地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號)，保藏編號為CGMCC No.13032。

本發(fā)明提供鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408可以耐受中度鹽度和高濃度乙酸鹽，在完全培養(yǎng)基中耐受NaCl濃度的范圍2-15％(培養(yǎng)基成分為：酸水解酪素7.5克/升，酵母提取物10克/升，谷氨酸鈉1克/升，檸檬酸三鈉3克/升，氯化鈉20-150克/升，七水合硫酸鎂20克/升，氯化鉀2克/升，檸檬酸鐵銨0.008克/升，pH調(diào)節(jié)到7.0-7.2)，能夠耐受高達5％的乙酸。

實施例2

鹽水球菌質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的提取、測序和特點

將鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408培養(yǎng)至穩(wěn)定期，離心收集菌體，采用提取低拷貝數(shù)質(zhì)粒的方法提取鹽水球菌質(zhì)粒。質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶Sau3AI不完全酶切的DNA片段，連接入經(jīng)BamHI(Sau3AI和BamHI是同尾酶)完全酶切的自連的pUCm-T載體，挑選有質(zhì)粒片段連接入的質(zhì)粒，測序；將獲得的序列拼接。以部分拼接的片段為模板，設(shè)計向外方向的測序引物，以提取的鹽水球菌質(zhì)粒為模板測序，并進一步拼接質(zhì)粒；最終獲得兩個環(huán)形質(zhì)粒的DNA序列。

其中較小質(zhì)粒的大小為2191bp，命名為pS408-1(核苷酸序列見序列2)；自5′端第715-1641位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列4的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep1，由308個氨基酸殘基組成。

質(zhì)粒pS408-1的物理圖譜如圖1所示，其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點有BamHI，ClaI，PvuII酶切位點各一個。其中，序列2中的自5′端第1500-1505位堿基為BamHI酶切位點；序列2中的自5′端第323-328位堿基為ClaI酶切位點；序列2的自5′端第1019-1024位堿基為PvuII酶切位點。質(zhì)粒pS408-1不含ApaI，BglII，EcoRI，EcoRV，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內(nèi)切酶位點，因此這些內(nèi)切酶位點可作為pS408-1的衍生載體的多克隆位點。

較大質(zhì)粒大小為3007bp，命名為pS408-2(核苷酸序列見序列3)；自5′端第1067-2080位堿基為一個開放閱讀框架，其編碼具有序列表中序列5的氨基酸殘基序列的質(zhì)粒復(fù)制所需的反式作用因子Rep2，由337個氨基酸殘基組成。

質(zhì)粒pS408-2的物理圖譜如圖2所示，其包括的常見限制性內(nèi)切酶位點有BamHI，ClaI，EcoRI，EcoRV酶切位點各一個。其中，序列3中的自5′端第1936-1941位堿基為BamHI酶切位點；序列3中的自5′端第2689-2694位堿基為ClaI酶切位點；序列3的自5′端第698-703位堿基為EcoRI酶切位點；序列3的自5′端第2821-2826位堿基為EcoRV酶切位點。質(zhì)粒pS408-2不含ApaI，BglII，HindIII，KpnI，NcoI，NdeI，PvuII，SacII，SalI，SmaI，SphI，XbaI等常見內(nèi)切酶位點，因此這些內(nèi)切酶位點可作為pS408-2的衍生載體的多克隆位點。

為了進一步探討質(zhì)粒的應(yīng)用范圍，對其拷貝數(shù)進行了測定。測定方法是采用Real-time PCR測定質(zhì)粒相對于染色體的拷貝數(shù)。在質(zhì)粒pS408-1上設(shè)計的一對引物為CPN-P1-F：AAAAGAGGAGCAGAAGG和CPN-P1-R：TTGCGTGATAAGTGGAT，在質(zhì)粒pS408-2上設(shè)計的一對引物為CPN-P2-F：TTCGTCAGTCTCGGTGGT和CPN-P2-R：TTCGGTTACTCTTCCTCAAT，在染色體上單拷貝基因RNA聚合酶beta亞基編碼基因設(shè)計的一對引物為CPN-C-F：GAGACGGGCGAGGTTA和CPN-C-R：TTTCGACAGTTGGTGGTT。質(zhì)粒pS408-1在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.90±0.13個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.12±0.07個；質(zhì)粒pS408-2在對數(shù)期的拷貝數(shù)是0.97±0.07個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是1.21±0.12個。質(zhì)粒pS408-1和pS408-2的拷貝數(shù)在1-2個范圍內(nèi)，均屬于低拷貝數(shù)的質(zhì)粒。

實施例3

大腸桿菌-鹽水球菌衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201的構(gòu)建

用引物CmR-F：CAACTAAAGCACCCAT和CmR-R：TCGGCATTATCTCATA擴增氯霉素抗性基因(J Bacteriol.1984,158(2):543-50)，直接連接入pUCm-T載體，經(jīng)藍白斑篩選和測序，獲得的質(zhì)粒插入T載體的方向為EcoRI到HindIII，將其命名為pTC。

以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13032的基因組為模板，用引物P1-F：GATCCATTTATGCCGAG和P1-R：TCCGATGATTATATGGC擴增即可獲得pS408-1復(fù)制所需的完整的DNA序列；以鹽水球菌Salinicoccus sp.CGMCC No.13135的基因組為模板，用引物P2-F：GATCTGTTTATGCCGAG和P2-R：ACTACCGTTTTATTTTC擴增即可獲得pS408-2復(fù)制所需的完整的DNA序列。

上述兩個鹽水球菌質(zhì)粒復(fù)制所需的完整的DNA序列通過分別在上下游引物的5’端添加酶切位點，經(jīng)酶切連接入pTC質(zhì)粒；所選限制性內(nèi)切酶分別為XbaI和HindIII。由pS408-1復(fù)制所需的完整的DNA序列連接入pTC質(zhì)粒獲得衍生質(zhì)粒pTCS101(物理圖譜如圖3所示)，由pS408-2復(fù)制所需的完整的DNA序列連接入pTC質(zhì)粒獲得衍生質(zhì)粒pTCS201(物理圖譜如圖4所示)。

這兩個衍生質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別含有來自pS408-1和pS408-2完整的在鹽水球菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點，都含有在大腸桿菌中復(fù)制所需的復(fù)制原點，和在大腸桿菌及鹽水球菌中篩選轉(zhuǎn)化子的抗性選擇標記基因AmpR和CmR，是大腸桿菌-鹽水球菌穿梭質(zhì)粒。

實施例4

質(zhì)粒消除菌株的獲得和穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201的拷貝數(shù)

野生型鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408含有內(nèi)源性質(zhì)粒pS408-1和pS408-2，需將其消除掉。

首先將質(zhì)粒pTCS101電穿孔法(參考FEMS Microbiol Lett.1992,73(1-2):133-138中金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)化方法)轉(zhuǎn)化到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株408中，在含有10μg/ml氯霉素的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次，基于質(zhì)粒不相容性原理將pS408-1消除掉；然后再在無氯霉素的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)兩次，通過影印平板法篩選獲得無氯霉素抗性的菌株，即獲得質(zhì)粒pS408-1被消除的菌株。同理，在此基礎(chǔ)上再次消除掉質(zhì)粒pS408-2，獲得質(zhì)粒都被消除掉的菌株，即鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E。

將穿梭質(zhì)粒pTCS101和pTCS201分別轉(zhuǎn)化到質(zhì)粒消除的菌株Salinicoccus sp.PE中，測定穿梭質(zhì)粒在鹽水球菌中的拷貝數(shù)。質(zhì)粒pTCS101在對數(shù)期的拷貝數(shù)是3.52±0.61個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是8.57±0.88個；質(zhì)粒pTCS201在對數(shù)期的拷貝數(shù)是2.23±0.20個，在穩(wěn)定期的拷貝數(shù)是5.34±0.35個。

實施例5

金黃色葡萄球菌來源的乳酸脫氫酶基因在鹽水球菌中的表達

以金黃色葡萄球菌的基因組為模板，用引物LDH-SA-F：TGATTGGCTAGTTTGTA和LDH-SA-R：AGTTATTCCTCGTTGTC擴增即可獲得乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列。

上述乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列通過在上下游引物的5’端添加酶切位點，經(jīng)酶切連接入pTCS101質(zhì)粒；所選限制性內(nèi)切酶分別為PstI和EcoRI。由乳酸脫氫酶編碼基因和上下游功能序列連接入pTCS101質(zhì)粒獲得表達質(zhì)粒pTCS101-LDH。

分別將空質(zhì)粒pTCS101和乳酸脫氫酶表達質(zhì)粒pTCS101-LDH分別轉(zhuǎn)入質(zhì)粒消除鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E，得到鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)。

在相同條件下培養(yǎng)菌體并制作蛋白粗提液。在有10μg/ml氯霉素鹽度5％的完全培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)至穩(wěn)定期，收集10ml培養(yǎng)液的菌體，用緩沖液(50mM Tris Cl,150mM NaCl,pH7.5)洗滌兩次，最終重懸于1ml的緩沖液中。添加終濃度約為12U/ml溶葡球菌酶(購自生工生物工程上海(股份)有限公司)在37℃孵育1h，然后在低溫以200W功率按工作3s間隔6s的方式超聲破碎細胞，總超聲時間為10min，最后在低溫條件下12000rpm離心2min，上清轉(zhuǎn)移至新EP管，作為蛋白粗提液。

測定并比較鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)和鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的細胞粗提液中乳酸脫氫酶的比活力。

總蛋白質(zhì)濃度采用北京普利萊基因技術(shù)有限公司生產(chǎn)的BCA蛋白定量試劑盒測定，測定結(jié)果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)的蛋白粗提液的總蛋白質(zhì)濃度為3.65±0.01mg/ml，鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液的總蛋白質(zhì)濃度為3.71±0.01mg/ml，二者蛋白濃度相當。

測定乳酸脫氫酶的方法為：首先配制底物混合液(1mM丙酮酸，0.75mM NADH，pH7.0～7.5)；上述重懸菌體的緩沖液350μl，底物混合液130μl，蛋白粗提液或其稀釋液20μl。

通過測定340nm吸光值的降低速率，代表底物NADH的消耗速率，計算比活力。測定結(jié)果為鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為0.42±0.10U/mg，鹽水球菌(Salinicoccus sp.)菌株P(guān)E(pTCS101-LDH)的蛋白粗提液中乳酸脫氫酶的比活力為34.34±3.71U/mg，后者樣品中乳酸脫氫酶的比活力提高了近80倍，表明乳酸脫氫酶得到成功表達。

序列表

<110> 中國科學(xué)院微生物研究所

<120> 一株耐高鹽耐高COD鹽水球菌菌株和來源該菌株的內(nèi)源質(zhì)粒

<160> 7

<210> 1

<211> 1436

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 1

cagtcgaacg cgcagccccg gagcttgctc cgggttctgc gagtggcgga cgggtgagta 60

acacgtaggc aacctaccca tcagactggg ataaccgcgg gaaaccgtgg ctaataccgg 120

atgatcctga tccccgcagg gggatgagtt gaaaggcggt ctttgactgc cactgatgga 180

tgggcctgcg gcgcattagc tagttggtgg ggtaagggcc caccaaggcg acgatgcgta 240

gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300

aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgcaagtctg acggagcaac gccgcgtgag 360

tgaagaaggg tttcggctcg taaaactctg ttgtcaggga agaacgccgg tgggagtaac 420

tgtccatcgg gtgacggtac ctgaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480

ggtaatacgt aggtggcaag cgttatccgg aattattggg cgtaaagcgc gcgtaggcgg 540

ttcgttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactggcg 600

aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccatgtgtag cggtgaaatg cgcagagata 660

tggaggaaca ccagtggcga aggcggctct ctggtctgca actgacgctg atgtgcgaaa 720

gcgtggggat caaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780

agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagcaaacg cattaagcac tccgcctggg 840

gagtacggcc gcaaggctga aactcaaagg aattgacggg gacccgcaca agcggtggag 900

catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccaa atcttgacat cctctgaccg 960

ccatggagac atggcttccc ttcggggcag agtgacaggt ggtgcatggt tgtcgtcagc 1020

tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttatc attagttgcc 1080

agcattcagt tgggcactct agtgagactg ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg 1140

acgtcaaatc atcatgcccc ttatgatttg ggctacacac gtgctacaat ggacaggtta 1200

caaagggcag ctacgccgcg aggccaagcg aatcccataa aactgttctc agttcggatt 1260

ggagtctgca actcgactcc atgaagctgg aatcgctagt aatcgtggat cagaatgcca 1320

cggtgaatac gttcccgggt cttgtacaca ccgcccgtca caccacggaa gtcggtaaca 1380

cctgaagccg gtgggccaac ctttatggag gcagccgtcg aaggtgggac cgatga 1436

<210> 2

<211> 2191

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 2

gatccattta tgccgagaaa acttttggtg ggaaaagcaa ccctgaataa actaaaaagc 60

cggtaggcag ataccgtgag gtatcaaaaa tgcctaccga cagcttttgg gtttttaggg 120

ttgccgttgg ttcacaccaa aaggaaattg gaataaatat taatttactg tatcttctta 180

attaaaagga ggagattaca ttaataatag tttaaattta tttcttattg tttctttttt 240

ctttttgctt tacttaatat tttctgaagg aaattttgcc ttttttatat tattagcgtt 300

tgttcttttt gtatttttct taatcgataa tggtgaaaag gaaaatgttg atgataaaag 360

gtattatgta ttacgtttat atattactgg tattgtaata ttctttttca ttactgattt 420

tatatatggg tggagtaatt cttttgttta tataatggct atgataccaa ttatgtatgt 480

aacagtaaaa aacaataaaa cgggtttctt cttatcttga tactatacgt cataatttct 540

atcgggggca atatgccttg agccgttggt atgactgctt taaacacaaa aaaacttgca 600

tgtttccgtc tactagttta gtgttttagg tgacgaagcc aaaaacataa aacctagggg 660

aaagtgcaag tttttttgta tgcacctttc ttggtagaaa ggatttattc acttatggag 720

aagtataccc agaaaaagcg aaaaaatcaa ctgttacaga cactcatcag taagcatgtc 780

agcaaaaaga cactggaacg ggtaaaggac tgtaatacat tcttatttat ggtggctgat 840

attacgatgg aaaaaaccaa actacaccgt tccaataact gcgagcatcg gttctgtcca 900

gtctgtgcat ggaagaaagc ccgtaagaac gccatgaaga ttagtattct gatggaatac 960

ctcaaaaaag aggagcagaa ggagtttctc tttctgactt tgacggcacc aaatgtgcca 1020

gctggggaac taaacgatga aattaagcat tataataact cgttcaaacg tatgatgcag 1080

cgaaaggaag taaagacggc tgtaaaaggc tatgtgcgga aattggaagt cacctacaac 1140

aaagatcgag acgactatca tccgcatttt cacgtaatct tagccgctga taaacactat 1200

tttaataata aaagacaata tattaaacgc gatagatggc tcgaactctg gcaacaatca 1260

acaaaaaatc cacttatcac gcaagtggac atcagacgcg taaaacacac cgacaacaaa 1320

aaagaagtct ccgaaattgc caaatacagc gccaaagaca gcgactatct ccaagacgaa 1380

accgtatttg acacattcta taaaacactt tccggtaagc gccttattgt atattccgga 1440

ctctttaaag acgccagcac actctatgaa accaaagcac tcgaccacta taaagacatg 1500

gatccaacct actacatcta ccaaattttt tatcactggg gtaaaactga ctacatcgaa 1560

accgaacgca aactcatgaa tcaagacatg ctaaaagaaa tcaatcagac cctattagac 1620

gaaacagaca tcgaagaata accgttacac ctgcacccat tgttacactt tccattcccc 1680

ctttaacctt gacccctgta tcacgacacg cagtgatgca ggggtcaagg tttgagatta 1740

gtaacttgtt gcttatcgaa tgggggaaga tgccaggtat atcaatgggt gcgggtgtat 1800

acgaccattc caaataaaaa aatgggtcat accccccatt taccccccca tttaccctac 1860

catttggaat agtcatggaa tctttatgga aagtgtattt agtatgttat ttagaatcat 1920

attgggattt atttaattgt ttttttgttc tcactcttga agcgaatcat cccagtctaa 1980

cgctcgggaa ttttggtaaa aatggacgtg cgtgtaactg ggcagtacct gcgtactgat 2040

tttaaactta actttgattt agacaccatt tcagagtcca aataagagta tatgagcgtc 2100

caaattgttt ttagggtact tttctatgac ttaagtcctt agaaacgctt tgagggctct 2160

ttctgacgtt ttgagccata taatcatcgg a 2191

<210> 3

<211> 3007

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 3

gatctgttta tgccgagaaa acttttggtg ggaataggga aacggaaaga tactaaaaag 60

ccgaatggct ggataccgtt aggtatcaat tttgccattc gacagctttt ttattttttg 120

tttccctgtt ggttcacacc aaaaggaaat tggaataaaa atataaagag agttggtaca 180

tttttgatta atatttttag gataattatg tttataggtg cagggatttt attatttaat 240

gtgattgcaa gaccagataa tgcattttta tttatgacat taggtgttct gctagttatg 300

ggcggaggag ttatgatact aagacagaat aaaggaaaag aataaaagga gaaaaactat 360

atagaactca ttattaaaaa tgctattaaa ggtattagta atttagtttt catcggtaga 420

ctccttcgta agatgtttta taaataagta tggagcgatt ataaacattc ccatttgtat 480

gaaagtgtta ggtaaaaatt taagtttttc catcatttca ttttcagtga atgctataaa 540

aggaaataga attatgcaga aagcaaaata aattgttaat aatagatatg gaaattcaaa 600

tatgtttcca gtagtaaaat tgtttatgac atagatatag aatgcaaaaa tagctacacc 660

aattatgaat gctaagaatc tgaaaaaaat gttgctagaa ttcattaaac taatactcct 720

ttgttattat gatataaacg aatggaacac agactatatg agtaggataa aaaagcaagt 780

ttctaaaaag acaataagca gatacttatt gtctttttag aacttgcttt tgaacttaga 840

aatgagcgtt tttgagcgag tttcttttat cttgatacta agggtcatat tttcgatttg 900

ggtaaatatg accctatccc ttgatacagt tgacttaaac acaaaaaaac ttgcattttc 960

cagggtagta gtttaatgtt ctaggtgact aagccaacaa cataaattac taggggaaag 1020

tgcaagtttt tttgtacctt tcgcagatga aaggattatt caattcatgg agaagtatac 1080

agagaaaaag ttgaaaaatc aactgttaca gacactcata ggcaaacatg ttactgattc 1140

cacactatta agaataaagg agtgcaacac atttatgtta tttcttgctg ataagacgct 1200

tgaaaagacg aagttgcatg gtgcgaatag ttgcaagcat agattttgtc cagtgtgttc 1260

atggcggaaa tctcggaaga atgcattgaa gatcagcatt ctcatgcagt atttgagaga 1320

agaagaaaat aaagaatttg ttttcttaac gcttactgca ccaaacgtga ctgctgatga 1380

attgaatgat gagattcaac attataacaa atcttttaaa cggttgatgg aacgtaaaga 1440

agtgaaagca gcagtcaaag gttatgttag aaaattagaa gtgacctatg acggtaaaga 1500

atctattacg aaaagtatgt ataaacatcg aacgaattat tataaaaaac gtggcttaaa 1560

tatcggcgat aaaaatccaa actatgatac ttatcatcca cattttcatg tggtgctggc 1620

agttaataaa acctatttta ataaaccgaa tgtttatatt cgtcagtctc ggtggttgga 1680

attgtggcaa caatctacaa aaaatccaat gattacgcag gtcgatgtca gacgagtgaa 1740

acatacagat aacaaaaaag aagtttcaga gattgcgaaa tacagtgcga aggattctga 1800

ttatctacaa aatgaaaaag tttttgatac attttttaat tcattgtcag gcaaacgatt 1860

gattgtgtat tcaggattgt ttaaagaagc cagcaagatg tatgacaata aagaattaga 1920

aaagtataaa gaaatggatc cgactcaata tatattttta ttgttttatc attggggaca 1980

aacagaatat attcaaacgg aacaaaaatt aatgtcggaa gatatgcaaa aagaagttaa 2040

taatcaaatg ctagatgatg aaaatattga ggaagagtaa ccgaaaggtt gctctttttt 2100

tgatttcacc cttgaggcgg atttccccag gggaatgctc gttttttcgt tagaaaaata 2160

cgtgcgtgta actgggcagt atttaaaata ctgaaatctg attctgttat tttgctattt 2220

aacataaatg ttaatatgtt atttaaataa aatgttatca agataatgaa tcatttaatt 2280

aatattttat ttaattaaat tgttaacatc gttcaaatgc caaataagcg attctgagcg 2340

tttctattta attttaggta gttcagttca tttttgatta ttgaatgtcc tcagaactga 2400

tttatggctt atatatgcgg attcaaaata atttatggga ctgttttata tattttcata 2460

ttcccgtaag ggtgcactta tacgttattc tgacggggtg cacaaaatct ttctcgcctg 2520

cgctcgaaaa aacggtaaag aataggagtt gatagttatc aaaaatattt tttattttct 2580

tttattaatt atcatatttg aagttatttt ttatatattt tttgatacta gacctagtga 2640

attaatttta ttgattggag gattatgtat tatttattta gcagttcaat cgattaaaaa 2700

aattgttaat aattcaagtg aaagaaaata aagaaagggg aatcaaaagt agaatttttt 2760

taaaaaaagt gagaatgagt gaaaatcaaa aataaattat aaagagcata aggggtttat 2820

gatatcaaac gcttatcgct tacgctctaa acgttgatat ggtcggcagt gccgacctta 2880

accttatgcc atcacaataa ttatataaaa cacactaaaa acacaaagat gagtcgtgtg 2940

tttttagtgt gttatttttc ggtattgaga aaacagttgc aaaggtatta gaaaataaaa 3000

cggtagt 3007

<210> 4

<211> 308

<212> PRT

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 4

Met Glu Lys Tyr Thr Gln Lys Lys Arg Lys Asn Gln Leu Leu Gln

1 5 10 15

Thr Leu Ile Ser Lys His Val Ser Lys Lys Thr Leu Glu Arg Val

20 25 30

Lys Asp Cys Asn Thr Phe Leu Phe Met Val Ala Asp Ile Thr Met

35 40 45

Glu Lys Thr Lys Leu His Arg Ser Asn Asn Cys Glu His Arg Phe

50 55 60

Cys Pro Val Cys Ala Trp Lys Lys Ala Arg Lys Asn Ala Met Lys

65 70 75

Ile Ser Ile Leu Met Glu Tyr Leu Lys Lys Glu Glu Gln Lys Glu

80 85 90

Phe Leu Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Pro Ala Gly Glu

95 100 105

Leu Asn Asp Glu Ile Lys His Tyr Asn Asn Ser Phe Lys Arg Met

110 115 120

Met Gln Arg Lys Glu Val Lys Thr Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

125 130 135

Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asn Lys Asp Arg Asp Asp Tyr His Pro

140 145 150

His Phe His Val Ile Leu Ala Ala Asp Lys His Tyr Phe Asn Asn

155 160 165

Lys Arg Gln Tyr Ile Lys Arg Asp Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln

170 175 180

Gln Ser Thr Lys Asn Pro Leu Ile Thr Gln Val Asp Ile Arg Arg

185 190 195

Val Lys His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys

200 205 210

Tyr Ser Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Leu Gln Asp Glu Thr Val Phe

215 220 225

Asp Thr Phe Tyr Lys Thr Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr

230 235 240

Ser Gly Leu Phe Lys Asp Ala Ser Thr Leu Tyr Glu Thr Lys Ala

245 250 255

Leu Asp His Tyr Lys Asp Met Asp Pro Thr Tyr Tyr Ile Tyr Gln

260 265 270

Ile Phe Tyr His Trp Gly Lys Thr Asp Tyr Ile Glu Thr Glu Arg

275 280 285

Lys Leu Met Asn Gln Asp Met Leu Lys Glu Ile Asn Gln Thr Leu

290 295 300

Leu Asp Glu Thr Asp Ile Glu Glu

305

<210> 5

<211> 337

<212> PRT

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 5

Met Glu Lys Tyr Thr Glu Lys Lys Leu Lys Asn Gln Leu Leu Gln

5 10 15

Thr Leu Ile Gly Lys His Val Thr Asp Ser Thr Leu Leu Arg Ile

20 25 30

Lys Glu Cys Asn Thr Phe Met Leu Phe Leu Ala Asp Lys Thr Leu

35 40 45

Glu Lys Thr Lys Leu His Gly Ala Asn Ser Cys Lys His Arg Phe

50 55 60

Cys Pro Val Cys Ser Trp Arg Lys Ser Arg Lys Asn Ala Leu Lys

65 70 75

Ile Ser Ile Leu Met Gln Tyr Leu Arg Glu Glu Glu Asn Lys Glu

80 85 90

Phe Val Phe Leu Thr Leu Thr Ala Pro Asn Val Thr Ala Asp Glu

95 100 105

Leu Asn Asp Glu Ile Gln His Tyr Asn Lys Ser Phe Lys Arg Leu

110 115 120

Met Glu Arg Lys Glu Val Lys Ala Ala Val Lys Gly Tyr Val Arg

125 130 135

Lys Leu Glu Val Thr Tyr Asp Gly Lys Glu Ser Ile Thr Lys Ser

140 145 150

Met Tyr Lys His Arg Thr Asn Tyr Tyr Lys Lys Arg Gly Leu Asn

155 160 165

Ile Gly Asp Lys Asn Pro Asn Tyr Asp Thr Tyr His Pro His Phe

170 175 180

His Val Val Leu Ala Val Asn Lys Thr Tyr Phe Asn Lys Pro Asn

185 190 195

Val Tyr Ile Arg Gln Ser Arg Trp Leu Glu Leu Trp Gln Gln Ser

200 205 210

Thr Lys Asn Pro Met Ile Thr Gln Val Asp Val Arg Arg Val Lys

215 220 225

His Thr Asp Asn Lys Lys Glu Val Ser Glu Ile Ala Lys Tyr Ser

230 235 240

Ala Lys Asp Ser Asp Tyr Leu Gln Asn Glu Lys Val Phe Asp Thr

245 250 255

Phe Phe Asn Ser Leu Ser Gly Lys Arg Leu Ile Val Tyr Ser Gly

260 265 270

Leu Phe Lys Glu Ala Ser Lys Met Tyr Asp Asn Lys Glu Leu Glu

275 280 285

Lys Tyr Lys Glu Met Asp Pro Thr Gln Tyr Ile Phe Leu Leu Phe

290 295 300

Tyr His Trp Gly Gln Thr Glu Tyr Ile Gln Thr Glu Gln Lys Leu

305 310 315

Met Ser Glu Asp Met Gln Lys Glu Val Asn Asn Gln Met Leu Asp

320 325 330

Asp Glu Asn Ile Glu Glu Glu

335

<210> 6

<211> 5779

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 6

ctgcaggcgg ccgcccatgg gatatcatcg atcatatgtc gccctatagt gagtcgtatt 60

acggtaccga gctcgaattc actggccgtc gttttacaac gtcgtgactg ggaaaaccct 120

ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt tcgccagctg gcgtaatagc 180

gaagaggccc gcaccgatcg cccttcccaa cagttgcgca gcctgaatgg cgaatggcgc 240

ctgatgcggt attttctcct tacgcatctg tgcggtattt cacaccgcat atggtgcact 300

ctcagtacaa tctgctctga tgccgcatag ttaagccagc cccgacaccc gccaacaccc 360

gctgacgcgc cctgacgggc ttgtctgctc ccggcatccg cttacagaca agctgtgacc 420

gtctccggga gctgcatgtg tcagaggttt tcaccgtcat caccgaaacg cgcgagacga 480

aagggcctcg tgatacgcct atttttatag gttaatgtca tgataataat ggtttcttag 540

acgtcaggtg gcacttttcg gggaaatgtg cgcggaaccc ctatttgttt atttttctaa 600

atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 660

tgaaaaagga agagtatgag tattcaacat ttccgtgtcg cccttattcc cttttttgcg 720

gcattttgcc ttcctgtttt tgctcaccca gaaacgctgg tgaaagtaaa agatgctgaa 780

gatcagttgg gtgcacgagt gggttacatc gaactggatc tcaacagcgg taagatcctt 840

gagagttttc gccccgaaga acgttttcca atgatgagca cttttaaagt tctgctatgt 900

ggcgcggtat tatcccgtat tgacgccggg caagagcaac tcggtcgccg catacactat 960

tctcagaatg acttggttga gtactcacca gtcacagaaa agcatcttac ggatggcatg 1020

acagtaagag aattatgcag tgctgccata accatgagtg ataacactgc ggccaactta 1080

cttctgacaa cgatcggagg accgaaggag ctaaccgctt ttttgcacaa catgggggat 1140

catgtaactc gccttgatcg ttgggaaccg gagctgaatg aagccatacc aaacgacgag 1200

cgtgacacca cgatgcctgt agcaatggca acaacgttgc gcaaactatt aactggcgaa 1260

ctacttactc tagcttcccg gcaacaatta atagactgga tggaggcgga taaagttgca 1320

ggaccacttc tgcgctcggc ccttccggct ggctggttta ttgctgataa atctggagcc 1380

ggtgagcgtg ggtctcgcgg tatcattgca gcactggggc cagatggtaa gccctcccgt 1440

atcgtagtta tctacacgac ggggagtcag gcaactatgg atgaacgaaa tagacagatc 1500

gctgagatag gtgcctcact gattaagcat tggtaactgt cagaccaagt ttactcatat 1560

atactttaga ttgatttaaa acttcatttt taatttaaaa ggatctaggt gaagatcctt 1620

tttgataatc tcatgaccaa aatcccttaa cgtgagtttt cgttccactg agcgtcagac 1680

cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 1740

ttgcaaacaa aaaaaccacc gctaccagcg gtggtttgtt tgccggatca agagctacca 1800

actctttttc cgaaggtaac tggcttcagc agagcgcaga taccaaatac tgttcttcta 1860

gtgtagccgt agttaggcca ccacttcaag aactctgtag caccgcctac atacctcgct 1920

ctgctaatcc tgttaccagt ggctgctgcc agtggcgata agtcgtgtct taccgggttg 1980

gactcaagac gatagttacc ggataaggcg cagcggtcgg gctgaacggg gggttcgtgc 2040

acacagccca gcttggagcg aacgacctac accgaactga gatacctaca gcgtgagcta 2100

tgagaaagcg ccacgcttcc cgaagggaga aaggcggaca ggtatccggt aagcggcagg 2160

gtcggaacag gagagcgcac gagggagctt ccagggggaa acgcctggta tctttatagt 2220

cctgtcgggt ttcgccacct ctgacttgag cgtcgatttt tgtgatgctc gtcagggggg 2280

cggagcctat ggaaaaacgc cagcaacgcg gcctttttac ggttcctggc cttttgctgg 2340

ccttttgctc acatgttctt tcctgcgtta tcccctgatt ctgtggataa ccgtattacc 2400

gcctttgagt gagctgatac cgctcgccgc agccgaacga ccgagcgcag cgagtcagtg 2460

agcgaggaag cggaagagcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt 2520

cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca 2580

attaatgtga gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct 2640

cgtatgttgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat 2700

gattacgcca agctttccga tgattatatg gctcaaaacg tcagaaagag ccctcaaagc 2760

gtttctaagg acttaagtca tagaaaagta ccctaaaaac aatttggacg ctcatatact 2820

cttatttgga ctctgaaatg gtgtctaaat caaagttaag tttaaaatca gtacgcaggt 2880

actgcccagt tacacgcacg tccattttta ccaaaattcc cgagcgttag actgggatga 2940

ttcgcttcaa gagtgagaac aaaaaaacaa ttaaataaat cccaatatga ttctaaataa 3000

catactaaat acactttcca taaagattcc atgactattc caaatggtag ggtaaatggg 3060

ggggtaaatg gggggtatga cccatttttt tatttggaat ggtcgtatac acccgcaccc 3120

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<211> 6595

<212> DNA

<213> 鹽水球菌菌株Salinicoccus sp.

<400> 7

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