本發(fā)明涉及藥物制劑領(lǐng)域，尤其涉及一種ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

石墨烯是單層的石墨，是世界上最薄的納米材料。石墨烯由一層以六角形碳原子組成的蜂窩狀二維材料，厚度只有0.33nm。石墨烯是構(gòu)成其他維度碳材料的基本結(jié)構(gòu)單元。石墨烯具有獨(dú)特的電學(xué)、力學(xué)及熱學(xué)性能，已廣泛地應(yīng)用于能源、電子、材料、生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。但石墨烯具有易團(tuán)聚的特點(diǎn)而限制了其應(yīng)用。氧化石墨烯(graphene oxide，GO)又稱為功能化的石墨烯，其含有大量的含氧官能團(tuán)，如羧基、羥基與環(huán)氧基等，因此具有較好的生物相容性和水溶性。但由于其母體結(jié)構(gòu)中有較大的芳香共軛結(jié)構(gòu)，當(dāng)氧化石墨烯大量存在或分散于無機(jī)鹽溶液中時，氧化石墨烯的片層間可以發(fā)生聚集而產(chǎn)生沉淀。因此，解決氧化石墨烯的分散性問題是實現(xiàn)氧化石墨烯廣泛應(yīng)用的前提。而氧化石墨烯所含的氧化基團(tuán)為進(jìn)一步功能化修飾提供了活性位點(diǎn)，可將其設(shè)計成多功能納米材料。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是機(jī)體氧化應(yīng)激時產(chǎn)生的主要分子，在細(xì)胞信號通路及氧化還原平衡中發(fā)揮重要作用。眾多疾病與活性氧水平過高有關(guān)，包括帕金森疾病、阿爾茨海默癥、心血管疾病及腫瘤等。有機(jī)硒類化合物具有特殊的氧化還原特性，是優(yōu)良的刺激響應(yīng)性材料。雙硫鍵的鍵能為240kJmol^-1，而雙硒鍵的鍵能為172kJmol^-1。雙硒鍵較雙硫鍵更為活潑，在較為溫和的條件下即可發(fā)生斷裂，具有良好的氧化還原敏感性。雙硒鍵更易被氧化的特性使其可以被ROS氧化而斷裂。腫瘤及炎癥等病灶部位具有較高的ROS水平，可以利用病灶部位的ROS促使雙硒鍵斷裂，從而引起藥物的快速釋放，迅速達(dá)到治療濃度而控制病情。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供一種ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料及其制備方法和應(yīng)用，該氧化石墨烯基納米材料具有良好的生物相容性，并且具有ROS響應(yīng)。

本發(fā)明提供的ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料是在氧化石墨烯上通過ROS敏感的雙硒鍵連接臂引入普朗尼克修飾的PAMAM聚合物。

PAMAM為聚酰胺-胺型樹枝狀高分子聚合物，表面具有大量氨基官能團(tuán)，具有溶酶體逃逸功能，可以保護(hù)藥物分子順利達(dá)到作用靶點(diǎn)。

本發(fā)明的氧化石墨烯基納米材料中的雙硒鍵容易被病灶部位的ROS氧化而斷裂，其上的聚合物可在病灶處快速脫落，除去藥物釋放的空間屏障，使氧化石墨烯表面的藥物迅速釋放，提高療效。

本發(fā)明還提供了該ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料的制備方法，是通過L-硒代胱氨酸將普朗尼克修飾的PAMAM聚合物接枝到氧化石墨烯上。

所述的制備方法包括：

(1)將活化的氧化石墨烯加入到L-硒代胱氨酸溶液中，在惰性氣體保護(hù)下，室溫攪拌反應(yīng)12～36h，收集產(chǎn)物并洗滌，得到L-硒代胱氨酸修飾的氧化石墨烯；

(2)將L-硒代胱氨酸修飾的氧化石墨烯分散于緩沖液中，加入普朗尼克修飾的PAMAM聚合物，攪拌均勻后加入N-羥基琥珀酰亞胺/1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，惰性氣體保護(hù)下，室溫反應(yīng)12～36h，收集產(chǎn)物并洗滌，得到以雙硒鍵為連接臂的ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料。

作為優(yōu)選，氧化石墨烯、L-硒代胱氨酸和普朗尼克修飾的PAMAM聚合物的質(zhì)量比為1∶2～10∶5～20。

本發(fā)明采用改進(jìn)的Hummers法制備氧化石墨烯：

(a)將濃硫酸、K₂S₂O₈及P₂O₅攪拌混合均勻并加熱至80℃后，加入石墨粉密封反應(yīng)2～6h，冷卻后加去離子水稀釋，抽濾并洗滌后，80℃干燥，得到預(yù)氧化的石墨粉；

石墨粉、K₂S₂O₈和P₂O₅的質(zhì)量比為1∶1～2∶1～2；石墨粉與濃硫酸的質(zhì)量體積比為1g∶2～4mL；

(b)在冰浴條件下，將預(yù)氧化的石墨粉加入到濃硫酸中，在硝酸鈉和高錳酸鉀的作用下攪拌反應(yīng)1～2h后，室溫下攪拌反應(yīng)5～10天；

預(yù)氧化的石墨粉、硝酸鈉和高錳酸鉀的質(zhì)量比為1∶1～5∶20～25；

(c)將(b)中的反應(yīng)混合物加水稀釋后加熱至70～100℃，攪拌反應(yīng)10～20min，加入雙氧水，攪拌反應(yīng)24h，抽濾收集產(chǎn)物，洗滌至近中性；

(d)將(c)中的產(chǎn)物分散于去離子水中，探頭超聲1～4h，探頭超聲的功率為400～600w。

采用上述改進(jìn)的Hummers法制備的氧化石墨烯大多為單層。

作為優(yōu)選，所述的石墨粉的粒徑為4000～8000目。

氧化石墨烯的活化方法為：將氧化石墨烯分散于pH為5～6的緩沖液中，加入N-羥基琥珀酰亞胺/1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽溶液，在室溫下反應(yīng)0.5～2h，得到活化后的氧化石墨烯。

所述的緩沖液為0.1M，pH值為5.5的2-(N-嗎啡琳)乙磺酸(MES)緩沖溶液。

普朗尼克修飾PAMAM的方法為：

(a)活化普朗尼克：在惰性氣體保護(hù)下，將對硝基氯甲酸苯酯的苯溶液加入到普朗尼克的苯溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)12～36h，經(jīng)后處理獲得活化后的普朗尼克；

(b)普朗尼克修飾的PAMAM的制備：向PAMAM的二甲亞砜溶液中加入活化后的普朗尼克的二甲亞砜溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)1～3天，經(jīng)后處理后得到普朗尼克修飾的PAMAM聚合物。

本發(fā)明合成了普朗尼克修飾的聚酰胺胺聚合物(PPF68)，通過ROS敏感的雙硒鍵將聚合物修飾至氧化石墨烯表面，得到ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料(GO-PPF68)。這種具有ROS響應(yīng)性的氧化石墨烯基納米材料不僅可以提高氧化石墨烯的分散性，還可以實現(xiàn)智能化藥物遞送。

本發(fā)明還提供了上述氧化石墨烯基納米材料作為藥物載體的應(yīng)用，將氧化石墨烯基納米材料的溶液與藥物的溶液混合，室溫下避光攪拌12～48h，經(jīng)過超濾離心提純即得到載藥復(fù)合物。

作為優(yōu)選，所述的藥物與氧化石墨烯基納米材料的質(zhì)量比為1∶2～10。

作為優(yōu)選，所述的藥物為疏水性藥物或具有芳香結(jié)構(gòu)的藥物。例如阿霉素、吲哚菁綠等。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明的氧化石墨烯基納米材料合成簡單，具有良好的分散性和較低的細(xì)胞毒性；

(2)本發(fā)明的氧化石墨烯基納米材料含有雙硒鍵，在ROS含量較高的病灶部位可以斷裂，可以迅速釋放藥物，達(dá)到治療濃度。

附圖說明

圖1為GO、PPF68及GO-PPF68的紅外圖譜；

圖2為GO的AFM圖及橫線處GO的高度圖；

圖3為GO-PPF68的AFM圖及橫線處GO-PPF68的高度圖；

圖4為雙氧水處理后GO-PPF68的AFM圖及橫線處GO-PPF68的高度圖；

圖5為GO-PPF68共孵育MCF-7細(xì)胞24h的細(xì)胞存活率。

具體實施方式

實施例1：采用改進(jìn)的Hummers法合成氧化石墨烯

(1)將15mL濃硫酸、5g K₂S₂O₈及5g P₂O₅加入圓底燒瓶中，磁力攪拌混合均勻并加熱至80℃，然后加入4g石墨粉密封反應(yīng)4h。磁力攪拌過夜使混合物冷卻。緩慢加入去離子水稀釋混合物，抽濾得到產(chǎn)物。去離子水清洗混合物至pH值近中性。80℃干燥過夜，得到預(yù)氧化的石墨粉；

(2)冰浴條件(0℃)下進(jìn)行以下反應(yīng)：取上述0.5g預(yù)氧化的石墨粉加入至92.5mL濃硫酸中，然后依次緩慢加入2g硝酸鈉和12g高錳酸鉀，攪拌反應(yīng)1h，然后室溫下(25℃)攪拌反應(yīng)7天；

(3)將反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)移至大燒杯中，加入180mL去離子水，加熱混合物至90℃，攪拌反應(yīng)15min。加入560mL0.4％～0.6％(0.54％)的雙氧水，攪拌24h使反應(yīng)終止。抽濾收集產(chǎn)物，去離子水洗滌至近中性；

(4)將洗滌后的氧化石墨粉分散與水中，探頭超聲(600W)1h，得到的氧化石墨烯粒徑大小為88.7±3.9nm。

實施例2：采用改進(jìn)的Hummers法合成氧化石墨烯

同時實施例1相比，區(qū)別在于探頭超聲的時間為2h，得到的氧化石墨烯粒徑大小為66.2±15.2nm。

實施例3：采用改進(jìn)的Hummers法合成氧化石墨烯

同時實施例1相比，區(qū)別在于探頭超聲的時間為4h，得到的氧化石墨烯粒徑大小為64.0±1.9nm。

實施例4：L-硒代胱氨酸修飾氧化石墨烯

(1)將實施例3制備的2mg氧化石墨烯分散于20mL 2-(N-嗎啡琳)乙磺酸(MES)緩沖溶液(0.1M，pH5.5)中，加入1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(30.7mg/18.4mg，摩爾比1∶1)反應(yīng)1h。12000g離心30min收集活化的氧化石墨烯，去離子水洗滌三次；

將上述活化后的氧化石墨烯的氫氧化鈉溶液(1M，5mL)緩慢滴加至L-硒代胱氨酸的氫氧化鈉溶液(1M，15mL)中，氬氣保護(hù)下，室溫攪拌反應(yīng)24h。超濾離心(MWCO 10000，3500g，15min)收集產(chǎn)物，去離子水洗滌三次，得到L-硒代胱氨酸修飾氧化石墨烯。

實施例5：普朗尼克修飾PAMAM

(1)取對硝基氯甲酸苯酯0.45mmol(0.0907g)溶于3ml苯中，普朗尼克F68(即PF68，分子量為8800，分子式為EO₈₀PO₃₀EO₈₀，購自BASF(上海)有限公司)0.45mmol(3.96g)溶于7mL苯中。氮?dú)獗Ｗo(hù)，攪拌條件下，將對硝基氯甲酸苯酯的苯溶液逐滴加入到PF68的苯溶液中，滴加完畢后，室溫(25℃)下攪拌反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)混合液(10mL)用8倍體積的石油醚(80mL)沉淀三次，4000rpm離心10min。取白色沉淀在-0.1MPa條件下真空干燥過夜，除去殘留的有機(jī)溶劑，獲得活化后的普朗尼克0.426mmoL(3.82g，分子量8965)；

(2)將6μmol(19.5mg)PAMAM G2(分子量3256，購自sigma)溶于8mL二甲基亞砜中，攪拌條件下加入12μmol實施例4制備的活化后的普朗尼克的二甲基亞砜溶液(2mL)，室溫條件下攪拌反應(yīng)2天，將反應(yīng)溶液裝于透析袋(MWCO 8000～14000)中，于純水中進(jìn)行透析，每4個小時換一次水，透析2天。最后將截留液凍干(-50℃冷凍干燥48h)得到PF68修飾的PAMAM接枝物(即普朗尼克修飾的PAMAM接枝物，PPF68)。

實施例6

將實施例4制備的L-硒代胱氨酸修飾的氧化石墨烯與20mg實施例5制備的PF68修飾的PAMAM接枝物分散于15mL的MES緩沖液中，磁力攪拌混勻。緩慢滴加1-乙基-3-3(-二甲基氨丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基琥珀酰亞胺(5.8mg/3.5mg，摩爾比1∶1)溶液，氬氣保護(hù)下反應(yīng)24h。超濾離心(MWCO 10000，3500g，15min)收集產(chǎn)物，去離子水洗滌三次，得到終產(chǎn)物ROS敏感的氧化石墨烯基納米材料。

對氧化敏感的修飾型氧化石墨烯進(jìn)行傅里葉紅外圖譜(FTIR)掃描及原子力顯微鏡(AFM)檢測，結(jié)果如圖1、2、3、4所示。

如圖1所示，GO的FTIR圖譜顯現(xiàn)出-COOH、-OH及C-O-C的特征吸收峰。3425cm^-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動峰，-OH的彎曲振動峰在1400cm^-1。1735cm^-1及1628cm^-1處的吸收峰為C＝O的伸縮振動峰。同時，在1086cm^-1處的吸收峰為C-O-C的伸縮振動峰。對于PPF68，有酰胺鍵中的C＝O(1646cm^-1)的伸縮振動峰，C-N的伸縮振動峰和仲胺的NH的彎曲振動峰。修飾之后GO中-COOH的C＝O的伸縮振動峰(1735cm^-1及1628cm^-1)消失，GO-PPF68的FTIR圖譜含有PPF68的特征峰，峰的位置略有偏移。

采用AFM對產(chǎn)物進(jìn)行表征，得到的AFM圖可以得出樣品的橫向尺寸及縱向厚度信息。由圖2和圖3所示，經(jīng)PPF68修飾之后，GO-PPF68的橫向尺寸及縱向厚度較GO都有了增加。圖3中可以看出GO-PPF68的厚度由＜1nm(GO)增長至3～9nm(GO-PPF68)。將GO-PPF68溶液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10％的H₂O₂處理24h，采用AFM對處理后的GO-PPF68進(jìn)行表征，見圖4。由圖4所示，經(jīng)H₂O₂處理后，PPF68從GO上脫離，載體的厚度又降至2nm以下。AFM結(jié)果表明GO-PPF68的成功合成，并具有氧化敏感性。

測試?yán)?

取對數(shù)生長期的MCF-7腫瘤細(xì)胞，棄掉原培養(yǎng)液，用pH值為7.4的PBS洗滌，用胰酶消化至細(xì)胞趨于圓形，棄去胰酶，加入含10％胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液，吹打分散均勻并制備成細(xì)胞懸液(約50000個/mL)，取100μL的細(xì)胞懸液接種于96孔板中。培養(yǎng)板于37℃、5％CO₂的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育貼壁。將不同濃度(1、10、20、50、70、100μg/mL)的GO-PPF68的PBS溶液(pH值為7.4)分別向上述96孔板中加入25μL/孔，每組設(shè)三個復(fù)孔。37℃、5％CO₂條件下孵育24h后，棄掉原培養(yǎng)液，重新加入100μL/孔不含血清的1640培養(yǎng)液，每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃、5％CO₂繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸去孔內(nèi)溶液，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)。溶解后，用酶標(biāo)儀(BioTek，美國)于570nm處測定各孔的OD值。

GO-PPF68的細(xì)胞毒性圖見圖5所示，細(xì)胞存活率在80％以上，結(jié)果表明GO-PPF68基本沒有細(xì)胞毒性。

應(yīng)用例1

精密稱取20.0mg鹽酸阿霉素(購于北京華奉聯(lián)博科技有限公司)至10mL容量瓶中，加入去離子水溶解并定容，配成2mg/mL的阿霉素溶液。

取9mL氧化石墨烯基納米材料的PBS(pH＝7.4)緩沖溶液，攪拌條件下緩慢滴加1mL阿霉素溶液。氧化石墨烯基納米材料終濃度為1mg/mL，阿霉素終濃度為0.2mg/mL。室溫避光攪拌24h。超濾離心(MWCO 10000，3000g，20min)收集產(chǎn)物，用PBS(pH＝7.4)緩沖溶液洗滌至下層溶液無色，得到載藥復(fù)合物。