本發(fā)明屬于微生物制劑領(lǐng)域，具體涉及一種能降低青貯中玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的植物乳桿菌制劑及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
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伴隨著我國(guó)畜牧行業(yè)的不斷發(fā)展以及高品質(zhì)飼料價(jià)格的不斷攀升，青貯飼料以其易操作，耐貯藏和應(yīng)用范圍廣的特性已被廣泛的應(yīng)用。
但由于玉米和苜蓿等青貯原料在生長(zhǎng)過(guò)程中，表面附著的有害霉菌可產(chǎn)生嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素，加之青貯的前期霉菌迅速繁殖也會(huì)產(chǎn)生大量的真菌毒素，導(dǎo)致青貯后可能會(huì)對(duì)家畜的健康產(chǎn)生一定的影響，情況嚴(yán)重可能會(huì)導(dǎo)致牲畜的死亡。其中，廣泛存在青貯的真菌毒素玉米赤霉烯酮可作用于牲畜的生殖系統(tǒng)，使家畜產(chǎn)生雌性激素亢進(jìn)癥，妊娠期的動(dòng)物流產(chǎn)、死胎和畸胎等，也可能引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中毒癥狀，如神智抑郁和共濟(jì)失調(diào)等。嘔吐毒素對(duì)動(dòng)物有很強(qiáng)的毒性，能引起動(dòng)物嘔吐、腹瀉、皮膚刺激、拒食、神經(jīng)紊亂、流產(chǎn)、死胎等。
目前關(guān)于上述毒素降解研究較為廣泛，如公布號(hào)為CN 105771147A的中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利《玉米赤霉烯酮降解劑及其應(yīng)用》明公開(kāi)了一種玉米赤霉烯酮(ZON)降解劑，其包括成分a、或成分a和成分b，其中成分a和成分b的體積比為1：3－3：1；所述成分a經(jīng)下述步驟獲得：產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌K3和枯草芽孢桿菌K4單獨(dú)培養(yǎng)16－24h后獲得各菌液，然后以1：1：1、1：2：2或1：3：3的體積比混勻即得；所述成分b為米曲霉經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)后所獲得的米曲霉粗酶液。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：當(dāng)產(chǎn)朊假絲酵母、枯草芽孢桿菌K3、枯草芽孢桿菌K4的比例為1:2:2時(shí)，ZON降解率達(dá)到92.21％；當(dāng)三種復(fù)合益生菌與米曲霉的配比為2:1時(shí)，ZON降解率達(dá)到95.15％。中國(guó)發(fā)明專(zhuān)利ZL201110459937.1公布了一種《玉米赤霉烯酮的微生物降解方法》，是用蠟樣芽孢桿菌和/或植物乳桿菌菌粉來(lái)降解玉米赤霉烯酮。本發(fā)明利用蠟樣芽孢桿菌和/或植物乳桿菌菌粉對(duì)玉米赤霉烯酮進(jìn)行降解，通過(guò)在體外模擬胃腸道環(huán)境下分別測(cè)定上述菌粉對(duì)ZEN的降解效果，摸索出其對(duì)ZEN的最佳降解條件，為進(jìn)一步將其開(kāi)發(fā)為生物解毒劑，用于谷物和飼料中ZEN的降解提供了有力的指導(dǎo)。
但是目前尚未出現(xiàn)能夠同時(shí)降解玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的益生菌，因此，篩選具有既能降解玉米赤霉烯酮又能降解嘔吐毒素功能的微生物制劑，對(duì)于畜牧養(yǎng)殖來(lái)講具有重要意義。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種可以降解玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的微生物制劑，所述微生物制劑包含植物乳桿菌，其制備方法具體如下：
(1)植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)
將植物乳桿菌種子液按5-10％接種量接入高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH6.5-7.0，通氮?dú)獗３謮毫?.03-0.05MPa，轉(zhuǎn)速60-80r/min，恒pH 5.5-5.9，37℃發(fā)酵5-8h，植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到1010CFU/mL以上，制得發(fā)酵液；
高密度發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白粉60-80g，葡萄糖40-80g，無(wú)水乙酸鈉10-20g，K2HPO47-10g，檸檬酸鈉9-12g，酵母粉7-15g，吐溫-80 0.1-0.2g，pH6.5-7.0；
(2)添加保護(hù)劑
向發(fā)酵液直接添加保護(hù)劑干粉，混合均勻，保護(hù)劑各組分與發(fā)酵液的質(zhì)量比組成為：脫脂乳3.0-8.0％(m/m)，海藻糖1.5-5.0％(m/m)，大豆蛋白粉10-15％(m/m)，維生素C 0.4-0.6％(m/m)；
(3)干燥
將上述與保護(hù)劑混合均勻的發(fā)酵液，經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉微生物制劑，獲得菌粉植物乳桿菌活菌數(shù)可以達(dá)到2×1011CFU/g以上；
進(jìn)一步地，所述植物乳桿菌具體為植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03，該菌株已于2015年12月24日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏編號(hào)CGMCC No.11932；
所述菌種植物乳桿菌SCI-03(初始接種量1×106CFU/mL)在含有100μg/L玉米赤霉烯酮的MRS液體培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，玉米赤霉烯酮濃度降為58μg/L，植物乳桿菌SCI-03活菌數(shù)為8×106CFU/mL，顯著降低玉米赤霉烯酮含量；植物乳桿菌SCI-03(初始接種量1×106CFU/mL)在含有100μg/L嘔吐毒素的MRS液體培養(yǎng)基中，25℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，玉米赤霉烯酮濃度降為68μg/L，植物乳桿菌SCI-03活菌數(shù)為7×106CFU/mL，降解效果顯著。
所述可以降解玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的微生物制劑的使用方法如下：
每千克青貯飼料添加0.05-0.10克微生物制劑，密封發(fā)酵30-35天,可使青貯飼料中的嘔吐毒素降低40％左右，玉米赤霉烯酮降低50％左右。
有益效果：
1、本發(fā)明提供的微生物制劑能夠有效降低青貯飼料中的嘔吐毒素降低和玉米赤霉烯酮，每千克玉米青貯飼料添加0.05克微生物制劑，密封發(fā)酵30天,嘔吐毒素濃度降低36.5％，玉米赤霉烯酮濃度降低49.38％；每千克苜蓿青貯飼料添加0.10克微生物制劑，密封發(fā)酵35天,嘔吐毒素濃度由起始的24.14μg/Kg，降低為18.88μg/Kg，玉米赤霉烯酮濃度降低26.83％；
2、植物乳桿菌SCI-03能夠?qū)⑶噘A原料中的碳水化合物轉(zhuǎn)化成有機(jī)酸，苯乳酸、抗菌多肽、細(xì)菌素、二氧化碳使pH降低，抑制有害菌的生長(zhǎng)，提高貯藏穩(wěn)定性，而且青貯料中氨態(tài)氮濃度減少，丁酸濃度降低，乳酸濃度增加，從而提高青貯飼料質(zhì)量和適口性，使干物質(zhì)損失降低。青貯飼料經(jīng)植物乳桿菌SCI-03發(fā)酵后，質(zhì)地柔軟，具有酸甜清香味，牲畜喜食，消化率可提高20％。
具體實(shí)施方式：
實(shí)施例1植物乳桿菌SCI-03降解毒素能力測(cè)定
(1)菌種的活化:將-80℃冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接種于5ml MRS液體培養(yǎng)基中(MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三鈉2g，吐溫-801g，硫酸鎂200mg，硫酸錳54mg，蒸餾水1000mL，pH6.5 121℃15min滅菌備用)，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種；
(2)種子培養(yǎng)：將上述活化好的菌種按2％接種于種子培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10小時(shí)；
種子培養(yǎng)基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，無(wú)水乙酸鈉10g，K2HPO4 7g，檸檬酸鈉9g，酵母粉7g，吐溫-80 0.1g，蒸餾水1L，pH7.0；
(3)植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)
將植物乳桿菌種子液按5％接種量接入高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH7.0，通氮?dú)獗３謮毫?.03MPa，轉(zhuǎn)速60r/min，恒pH 5.9，37℃發(fā)酵5h，植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到1010CFU/mL以上；
高密度發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，無(wú)水乙酸鈉10g，K2HPO47g，檸檬酸鈉9g，酵母粉7g，吐溫-80 0.1g，蒸餾水1L，pH7.0；
(4)玉米赤霉烯酮降解能力測(cè)定：MRS液體培養(yǎng)基中添加100μg/L玉米赤霉烯酮后，按1×106CFU/mL濃度接入步驟(3)制得的植物乳桿菌SCI-03培養(yǎng)液，25℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定玉米赤霉烯酮的濃度為58μg/L，顯著降低玉米赤霉烯酮含量；
(5)嘔吐毒素降解能力測(cè)定：MRS液體培養(yǎng)基中添加100μg/L嘔吐毒素后，按1×106CFU/mL濃度接入步驟(3)制得的植物乳桿菌SCI-03培養(yǎng)液，25℃恒溫培養(yǎng)24小時(shí)后，測(cè)定嘔吐毒素濃度降為68μg/L，降解效果顯著；
MRS液體培養(yǎng)基組成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三鈉、1mL吐溫80、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳加入1000mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至6.5，121℃滅菌15min。
玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素均經(jīng)過(guò)0.22μm的膜進(jìn)行過(guò)濾除菌。
實(shí)施例2：一種微生物制劑的制備及其在玉米青貯中的應(yīng)用
(1)菌種的活化:將-80℃冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接種于5ml MRS液體培養(yǎng)基中(MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三鈉2g，吐溫-801g，硫酸鎂200mg，硫酸錳54mg，蒸餾水1000mL，pH6.5 121℃15min滅菌備用)，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種；
(2)種子培養(yǎng)：將上述活化好的菌種2％接種于種子培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10小時(shí)；
種子培養(yǎng)基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，無(wú)水乙酸鈉10g，K2HPO47g，檸檬酸鈉9g，酵母粉7g，吐溫-80 0.1g，蒸餾水1L，pH7.0；
(3)植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)
將植物乳桿菌SCI-03種子液按8％接種量接入高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH6.5，通氮?dú)獗３謮毫?.04MPa，轉(zhuǎn)速70r/min，恒pH 5.5，37℃發(fā)酵6h，植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到1010CFU/mL以上；
高密度發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白粉70g，葡萄糖60g，無(wú)水乙酸鈉15g，K2HPO48g，檸檬酸鈉10g，酵母粉10g，吐溫-80 0.15g，蒸餾水1L，pH6.5；
(4)添加保護(hù)劑
發(fā)酵液直接添加保護(hù)劑干粉混合均勻，保護(hù)劑各組分與發(fā)酵液的質(zhì)量比組成為：脫脂乳3.0％(m/m)，海藻糖1.5％(m/m)，大豆蛋白粉10％(m/m)，維生素C 0.4％(m/m)；
(5)干燥
將上述與保護(hù)劑混合均勻的發(fā)酵液經(jīng)冷凍干燥得到凍干菌粉，獲得菌粉植物乳桿菌活菌數(shù)可以達(dá)到5×1011CFU/g；
(6)玉米青貯中玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的降解
每千克青貯飼料添加0.05克微生物制劑，密封發(fā)酵30天,嘔吐毒素濃度由起始的44.98μg/Kg，降低為28.54μg/Kg，玉米赤霉烯酮濃度由起始的102.61μg/Kg，降低為51.94μg/Kg。
實(shí)施例3：一種微生物制劑的制備及其在苜蓿青貯中的應(yīng)用
(1)菌種的活化:將-80℃冷凍保存的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)SCI-03接種于5ml MRS液體培養(yǎng)基中(MRS培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，磷酸氫二鉀2g，乙酸鈉5g，檸檬酸三鈉2g，吐溫-801g，硫酸鎂200mg，硫酸錳54mg，蒸餾水1000mL，pH6.5 121℃15min滅菌備用)，37℃培養(yǎng)18小時(shí)，如此傳代培養(yǎng)2次得到活化的菌種；
(2)種子培養(yǎng)：將上述活化好的菌種按2％接種于種子培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)10小時(shí)；
種子培養(yǎng)基：大豆蛋白粉60g，葡萄糖40g，無(wú)水乙酸鈉10g，K2HPO4 7g，檸檬酸鈉9g，酵母粉7g，吐溫-80 0.1g，蒸餾水1L，pH7.0；
(3)植物乳桿菌高密度發(fā)酵培養(yǎng)
將植物乳桿菌SCI-03種子液按10％接種量接入高密度發(fā)酵培養(yǎng)基，初始pH7.0，通氮?dú)獗３謮毫?.05MPa，轉(zhuǎn)速80r/min，恒pH 5.7，37℃發(fā)酵8h，植物乳桿菌活菌數(shù)達(dá)到1010CFU/mL以上；
高密度發(fā)酵培養(yǎng)基：大豆蛋白粉80g，葡萄糖80g，無(wú)水乙酸鈉20g，K2HPO410g，檸檬酸鈉12g，酵母粉15g，吐溫-80 0.2g，蒸餾水1L，pH7.0；
(4)添加保護(hù)劑
發(fā)酵液直接添加保護(hù)劑干粉混合均勻，保護(hù)劑各組分與發(fā)酵液的質(zhì)量比組成為：脫脂乳8.0％(m/m)，海藻糖5.0％(m/m)，大豆蛋白粉15％(m/m)，維生素C 0.6％(m/m)；
(5)干燥
將上述與保護(hù)劑混合均勻的發(fā)酵液冷凍干燥得到凍干菌粉，獲得菌粉植物乳桿菌活菌數(shù)可以達(dá)到4×1011CFU/g；
(6)苜蓿青貯中玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素的降解
每千克青貯飼料添加0.10克微生物制劑，密封發(fā)酵35天,嘔吐毒素濃度由起始的24.14μg/Kg，降低為18.88μg/Kg，玉米赤霉烯酮濃度由起始的62.76μg/Kg，降低為45.92μg/Kg。
玉米赤霉烯酮的檢測(cè)方法：
流動(dòng)相：A水，B(V(乙腈)：V(水)＝36:64)，流速為0.5mL/min，分析柱：ZORBAX Elipse AAA C18(3.5um，4.6×150mm)；檢測(cè)器：FLD(熒光檢測(cè)器)；激發(fā)波長(zhǎng)：235nm；發(fā)射波長(zhǎng)，460nm。
質(zhì)譜條件：質(zhì)譜模式：ESI正離子；毛細(xì)管電壓：2.5KV；錐孔電壓：40V；錐孔氣流量:0L/Hr；脫溶劑氣流量：600L/Hr；源溫：100℃，脫溶劑溫度：600℃。
嘔吐毒素的檢測(cè)方法：
流動(dòng)相：A(V水：V甲醇：V乙腈＝96:2:2)，每1000mL A中加5mg疊氮化鈉，B乙腈，流速：0.5ml/min，分析柱：C18(5um，4.6×100mm)，檢測(cè)器：VWD，檢測(cè)波長(zhǎng)：220nm.
質(zhì)譜條件：質(zhì)譜模式：ESI正離子；毛細(xì)管電壓:2.5KV；錐孔電壓：40V；錐孔氣流量:0L/Hr；脫溶劑氣流量：600L/Hr；源溫：100℃，脫溶劑溫度：600℃。