本發(fā)明涉及屬生物工程領(lǐng)域，涉及一種用于強(qiáng)化豆瓣后發(fā)酵菌劑組合物的制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
郫縣豆瓣屬中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品，迄今為止已有300多年的歷史，被列為中國非物質(zhì)文化遺產(chǎn)。郫縣豆瓣不僅生產(chǎn)工藝獨特，也以其味辣香醇、粘稠絨實、紅棕油亮、醬香濃郁等特點在我國醬類產(chǎn)品中獨樹一幟，堪稱川菜之魂。截止2015年末，“郫縣豆瓣”品牌價值已達(dá)607.16億元，位列“加工食品類地理標(biāo)志產(chǎn)品”全國第一；當(dāng)年產(chǎn)品總產(chǎn)量達(dá)到110萬噸，實現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)值102億元，出口世界絕大部分國家和地區(qū)，創(chuàng)匯超過4000萬美元。
郫縣豆瓣的生產(chǎn)包括前期發(fā)酵和后熟發(fā)酵兩個階段，前期發(fā)酵主要是指蠶豆霉瓣子的制曲和辣椒坯的預(yù)處理。后熟發(fā)酵主要是將成熟霉瓣子和成熟辣椒坯按比例配料混合，加入適量食鹽和水，進(jìn)入發(fā)酵池發(fā)酵，經(jīng)過一定時期的翻曬和陳化，即是郫縣豆瓣特有的日曬夜露工藝。因此，郫縣豆瓣的生產(chǎn)過程可以表述為：郫縣豆瓣的生產(chǎn)是以蠶豆瓣制曲、辣椒坯和環(huán)境微生物等復(fù)雜的物質(zhì)能量代謝過程為前提，通過獨特的“日曬夜露”開發(fā)發(fā)酵工藝，使得棲息在曲藥、辣椒坯、環(huán)境中的龐大微生物區(qū)系在發(fā)酵醅固、液、氣三相界面發(fā)生復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)換、能量代謝和信息傳遞作用，并最終形成郫縣豆瓣獨特的成分構(gòu)成和風(fēng)味特征。
真菌在郫縣豆瓣發(fā)酵過程中發(fā)揮了非常重要的作用，在制曲階段，霉菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、糖化酶等多種酶類，這些酶作用于辣椒和蠶豆不僅生成了大量的風(fēng)味物質(zhì)，也為后發(fā)酵期其他微生物生長創(chuàng)造了條件。但是，由于郫縣豆瓣后發(fā)酵階段的生產(chǎn)處于開放環(huán)境，少則半年多則兩年以上的“日曬夜露”后發(fā)酵期還有大量的環(huán)境微生物參與其發(fā)酵過程，這不僅決定了郫縣豆瓣獨特的成分構(gòu)成和風(fēng)味特征，也存在巨大的食品安全風(fēng)險，如毛霉菌和青霉菌會產(chǎn)生霉臭味，產(chǎn)毒黃曲霉和部分寄生曲霉還可能產(chǎn)生黃曲霉毒素B1，帶來重大食品安全隱患。因此，研究郫縣豆瓣后發(fā)酵期的真菌演替變化，并利用該客觀規(guī)律獲得強(qiáng)化郫縣豆瓣后發(fā)酵過程就顯得非常必要。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對上述技術(shù)存在的問題，提供一種用于強(qiáng)化豆瓣后發(fā)酵菌劑組合物的制備方法和應(yīng)用。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于強(qiáng)化豆瓣后發(fā)酵菌劑組合物的制備方法，所述的菌劑組合物包括酵母菌劑、米曲霉菌劑和格孢腔菌菌劑，制備方法如下：
酵母菌劑的制備：將對數(shù)生長期的異常畢赤酵母和球擬酵母按3-5％(v/v)接種量在5°Be′麥芽汁30℃培養(yǎng)3天，隨后在發(fā)酵液中添加質(zhì)量為6％的多孔淀粉、3％的蔗糖和1％的甘油，經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得酵母菌劑；
米曲霉菌劑的制備：將對數(shù)生長期的米曲霉按3-5％(v/v)接種量在6～7°Bé米曲汁、28-30℃培養(yǎng)2-5天，使米曲汁呈現(xiàn)微黃時，培養(yǎng)完成后，添加發(fā)酵液中添加均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6％的多孔淀粉、8％的蔗糖和1％的甘油,經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得米曲霉菌劑；
格孢腔菌菌劑的制備：將對數(shù)生長期的格孢腔菌按4-5％(v/v)接種量在滅菌培養(yǎng)基中28-30℃培養(yǎng)2-5天，培養(yǎng)完成后，向發(fā)酵液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6％的多孔淀粉、8％的蔗糖和1％的甘油,經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得。
進(jìn)一步的，所述滅菌培養(yǎng)基組成為：麩皮0.2-0.4g/L、面粉1-2g/L、辣椒干桔梗1-2g/L和尿素3-6g/L，其pH為3.2-4.0。
本發(fā)明中，異常畢赤酵母Pichia anomala保存號為：CICC 1332，格孢腔菌Pleospora sp.保存號為：BNCC 179839，球擬酵母Torulopsis globosa保存號為：BNCC176445，米曲霉Aspergillus oryzae保存號為：ATCC 41416。
本發(fā)明的另一目的是提供一種菌劑組合物在豆瓣后發(fā)酵過程中的應(yīng)用。
進(jìn)一步的，豆瓣后發(fā)酵過程中，在發(fā)酵至15-30天時按照質(zhì)量比0.2:10000加入米曲霉菌劑并混合均勻發(fā)酵，待發(fā)酵達(dá)到30-60天時，按照質(zhì)量比0.1:10000加入酵母菌劑并混合均勻，待發(fā)酵達(dá)到90天以上時，按照質(zhì)量比0.05:10000加入待加入劑發(fā)酵格孢腔菌菌劑。
本發(fā)明的有益技術(shù)效果是：本發(fā)明提供菌劑組合物的制備方法，整體工藝適合工業(yè)化連續(xù)生產(chǎn)，綜合利用了郫縣豆瓣生產(chǎn)副產(chǎn)物(辣椒桔梗)，生產(chǎn)周期可節(jié)約6個月，氨基態(tài)氮提高20％，揮發(fā)性呈香組分提高3倍以上(總酯、總酸和總?cè)┖?，在黃曲霉毒素B1產(chǎn)生的高峰(發(fā)酵30-60天)接入了酵母菌劑，強(qiáng)化了產(chǎn)酯生香過程，競爭性抑制了產(chǎn)毒黃曲霉和部分寄生曲霉的代謝，降低了黃曲霉毒素B1的含量，黃曲霉毒素B1低于0.5ppm，提高了食品安全。
具體實施方式
下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有作出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
實施例1
一種用于強(qiáng)化豆瓣后發(fā)酵菌劑組合物的制備方法，其特征在于，所述的菌劑組合物包括酵母菌劑、米曲霉菌劑和格孢腔菌菌劑，制備方法如下：
酵母菌劑的制備：將對數(shù)生長期的異常畢赤酵母和球擬酵母按3-5％(v/v)接種量在5°Be′麥芽汁30℃培養(yǎng)3天，隨后在發(fā)酵液中添加質(zhì)量為6％的多孔淀粉、3％的蔗糖和1％的甘油，經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得酵母菌劑；
米曲霉菌劑的制備：將對數(shù)生長期的米曲霉按3-5％(v/v)接種量在6～7°Bé米曲汁、28-30℃培養(yǎng)2-5天，使米曲汁呈現(xiàn)微黃時，培養(yǎng)完成后，添加發(fā)酵液中添加均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)6％的多孔淀粉、8％的蔗糖和1％的甘油,經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得米曲霉菌劑；
格孢腔菌菌劑的制備：將對數(shù)生長期的格孢腔菌按4-5％(v/v)接種量在滅菌培養(yǎng)基中28-30℃培養(yǎng)2-5天，培養(yǎng)完成后，向發(fā)酵液中添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)6％的多孔淀粉、8％的蔗糖和1％的甘油,經(jīng)溫度為-40℃～-45℃，凍干時間為24-48h冷凍真空干燥制得。
其中，滅菌培養(yǎng)基組成為：麩皮0.2-0.4g/L、面粉1-2g/L、辣椒干桔梗1-2g/L和尿素3-6g/L，其pH為3.2-4.0。
實施例2
一種用于強(qiáng)化豆瓣后發(fā)酵菌劑組合物在豆瓣后發(fā)酵中的應(yīng)用方法，豆瓣后發(fā)酵過程中，在發(fā)酵至15-30天時按照質(zhì)量比0.2:10000加入米曲霉菌劑并混合均勻發(fā)酵，待發(fā)酵達(dá)到30-60天時，按照質(zhì)量比0.1:10000加入酵母菌劑并混合均勻，待發(fā)酵達(dá)到90天以上時，按照質(zhì)量比0.05:10000加入待加入劑發(fā)酵格孢腔菌菌劑。
實施例3
本發(fā)明菌劑組合物對豆瓣后發(fā)酵中黃曲霉素B1的影響。
(1)樣品采集
單獨或聯(lián)合添加異常畢赤酵母(Pichia anomala CICC 1332)、格孢腔菌(Pleospora sp.BNCC179839)、球擬酵母(Torulopsis globosa BNCC176445)和米曲霉(Aspergillus oryzae ATCC 41416)，合計共40個批次后發(fā)酵郫縣豆瓣樣品，每種添加做5次平行實驗。(結(jié)果見后表)
(2)儀器與試劑
儀器：90mm研缽(唐山市開平盛興化學(xué)瓷廠)；恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智誠分析儀器制造有限公司)；漩渦振蕩器(德國IRM公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；恒溫水浴鍋(金壇市富華儀器設(shè)備公司)。
試劑：甲醇、正己烷、三氯甲烷(均為分析純，成都市科龍化工試劑廠)、黃曲霉毒素B1(AFB1)ELISA kit(德國R-Biopharm公司)。
(3)方法
①樣品預(yù)處理：取后發(fā)酵郫縣豆瓣樣品20g，于研缽中研磨成均勻糊狀，封袋保存后備用。
②黃曲霉毒素B1提?。禾崛》椒ú捎酶倪M(jìn)后的國標(biāo)方法，具體為：稱取2.5±0.05g研磨后的豆瓣樣品，置于250mL具塞錐形瓶中，加入5mL正己烷與12.5mL60％甲醇水溶液，強(qiáng)力振蕩5min，靜置后于4000r/min離心5min。取5mL中間層于分液漏斗中，加入10mL三氯甲烷，震蕩后靜置分層，放出并收集下層三氯甲烷。取1mL收集的三氯甲烷于蒸發(fā)皿中，將蒸發(fā)皿放入通風(fēng)櫥于65℃水浴揮干后，加入100μL60％甲醇水溶液復(fù)溶，再加入400μL樣品稀釋液(試劑盒所附)進(jìn)行稀釋，4℃保存待測。
③檢測方法：按照試劑盒使用說明書上的方法進(jìn)行樣品測定，具體如下：取適量的孔條固定在微孔板架上，準(zhǔn)備好已室溫放置2h以上的所需試劑和樣品提取液；將標(biāo)準(zhǔn)品和待檢測樣品加入相應(yīng)孔中，再在每孔中加入50μL抗體酶結(jié)合物，輕微振蕩后放于37℃溫浴30min；水浴結(jié)束后倒掉孔中液體，用試劑盒中洗液洗滌微孔板5次，最后一次應(yīng)在吸水紙上拍干；洗滌后于每孔中加入50μL顯色液A，再加50μL顯色液B，輕微振蕩后于37℃溫浴10min；每孔中加入50μL終止液，混勻后于450nm檢測吸光度，結(jié)果在5min內(nèi)讀取。
④數(shù)據(jù)處理：以黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為X軸，其百分吸光度值(各孔測得吸光值除以0濃度標(biāo)準(zhǔn)品吸光值)為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。則樣品中AFB1含量為：
X＝10^c×k
X-樣品中AFB1含量，ug/kg；
c-標(biāo)準(zhǔn)曲線中各樣品的百分吸光度值所對應(yīng)的濃度對數(shù)值；
k-稀釋倍數(shù)。
(4)結(jié)果與分析
①不同菌劑強(qiáng)化郫縣豆瓣樣品中AFB1含量情況
表1不同菌劑強(qiáng)化的郫縣豆瓣樣品中AFB1的含量情況(μg/kg)
注：“ND”指低于檢測限(0.2μg/kg)。
本技術(shù)領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，除非另外定義，這里使用的所有術(shù)語(包括技術(shù)術(shù)語和科學(xué)術(shù)語)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員的一般理解相同的意義。還應(yīng)該理解的是，諸如通用字典中定義的那些術(shù)語應(yīng)該被理解為具有與現(xiàn)有技術(shù)的上下文中的意義一致的意義，并且除非像這里一樣定義，不會用理想化或過于正式的含義來解釋。
最后所應(yīng)說明的是：以上實施例僅用以說明而非限制本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管參照上述實施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解：依然可以對本發(fā)明進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明的精神和范圍的任何修改或局部替換，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。