本發(fā)明屬于生物技術(shù)中微生物領(lǐng)域和環(huán)境工程中的廢水資源化，特別涉及一種采用甘薯淀粉廢液制備硝酸鹽污染土壤修復(fù)菌劑n4的方法。

背景技術(shù)：

據(jù)報(bào)道，人體攝入的硝酸鹽81.2％來(lái)自蔬菜，因此，降低蔬菜硝酸鹽積累技術(shù)的研究已成為當(dāng)前人們?cè)絹?lái)越關(guān)注的熱點(diǎn)。蔬菜是一種容易富集硝酸鹽的作物，農(nóng)民為了獲得高產(chǎn)而過(guò)量施用氮肥，導(dǎo)致硝酸鹽積累、蔬菜品質(zhì)下降。一般土壤的硝酸鹽含量高，則蔬菜的硝酸鹽含量也高，反之亦然，但兩者之間不存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系，因此，控制土壤中硝酸鹽的積累是一個(gè)迫切問(wèn)題。生物修復(fù)技術(shù)是解決環(huán)境污染、恢復(fù)被人類(lèi)活動(dòng)破壞的生態(tài)系統(tǒng)、實(shí)現(xiàn)人類(lèi)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的重要手段之一。近年來(lái)，我國(guó)生物修復(fù)技術(shù)研究與應(yīng)用蓬勃發(fā)展，取得了顯著成績(jī)。其內(nèi)容主要包括微生物修復(fù)技術(shù)、重金屬污染的植物修復(fù)技術(shù)。與理化修復(fù)方法相比具有投資少、對(duì)環(huán)境影響小的優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)表明，在相同施肥水平下，與無(wú)機(jī)微肥或edta微肥相比，木質(zhì)素螯合微肥均能降低生菜硝酸鹽含量，其中沙培比土培下降的程度更大。土培沖施木質(zhì)素螯合微肥盆栽生菜后，土壤酸化程度低，土壤鹽分下降，銨態(tài)氮、有效磷、有效鉀及有機(jī)質(zhì)均有一定程度提高，土壤肥力增強(qiáng)，有利于無(wú)公害蔬菜生產(chǎn)。

由于土壤、氣候等條件適宜尤其是產(chǎn)業(yè)化經(jīng)營(yíng)的拉動(dòng)，甘薯已發(fā)展成為我國(guó)主要的栽培作物之一。甘薯淀粉廢液富含可溶性糖類(lèi)、淀粉、纖維素、蛋白質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是微生物可以直接利用的天然培養(yǎng)基，為其生物轉(zhuǎn)化提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。根據(jù)甘薯淀粉廢液中含有的污染物種類(lèi)，探討通過(guò)生物轉(zhuǎn)化的途徑，使含有大量的淀粉、多糖、果膠、蛋白等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的廢液作為一種天然的微生物培養(yǎng)基培養(yǎng)有益微生物——異養(yǎng)硝化菌n4，達(dá)到廢液資源化的目的，并將其用于污染土壤的生物修復(fù)，最終實(shí)現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種采用甘薯淀粉廢液制備硝酸鹽污染土壤修復(fù)菌劑n4的方法，通過(guò)本方法所培養(yǎng)出的轉(zhuǎn)化菌劑n4可有效用于硝酸鹽污染土壤的生物修復(fù)。

本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種采用甘薯淀粉廢液制備硝酸鹽污染土壤修復(fù)菌劑n4的方法，其步驟是：

(1)原料廢液準(zhǔn)備：原料廢液為某甘薯淀粉加工廠(chǎng)排放廢水；

(2)菌種選擇：菌種n4是從硝酸鹽污染的農(nóng)田土壤中經(jīng)過(guò)取樣馴化、劃線(xiàn)分離、菌種篩選、劃線(xiàn)純化后得到的一種異養(yǎng)硝化菌；具體方法在[楊宗政，王鑫等.異養(yǎng)硝化菌的分離及其強(qiáng)化活性污泥脫氮效果[j].中國(guó)給水排水，2006，22(21)：67-70]公開(kāi)發(fā)表過(guò)；

(3)原料廢液培養(yǎng)基：取上清液用雙層醫(yī)用紗布濾去雜質(zhì)，滅菌，4℃冰箱中保存。試驗(yàn)前將廢水于121℃，滅菌20min，滅菌后調(diào)節(jié)ph值在7.0左右；

(4)n4菌培養(yǎng)：

將原料廢液培養(yǎng)基滅菌后調(diào)節(jié)ph為6-8，接種od660值為2.0的n4菌母液，置于25-45℃、200r/min的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)24h，發(fā)酵終點(diǎn)測(cè)定od600值；

(5)在原料廢液培養(yǎng)基中接種5％的n4菌，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)24h，培養(yǎng)溫度在25-45℃，初始ph為6-8，發(fā)酵終點(diǎn)測(cè)定od600值，即可獲得甘薯淀粉廢液土壤修復(fù)菌劑n4。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：

1.甘薯淀粉廢液培養(yǎng)基中的n4菌穩(wěn)定期的最高濃度不及普通培養(yǎng)基的菌濃度，但是這兩種培養(yǎng)基中菌的個(gè)數(shù)只是同一數(shù)量級(jí)中的差別，將甘薯淀粉廢液作為n4菌的培養(yǎng)基是可行的。

2.n4菌對(duì)溫度變化的適應(yīng)力較強(qiáng)，在廢液培養(yǎng)基中25-45℃范圍內(nèi)，菌株生長(zhǎng)情況都較好，其40℃是n4菌的最適生長(zhǎng)溫度。ph為7-7.5時(shí)菌株的生長(zhǎng)繁殖情況均良好，ph7.5時(shí)最適宜菌株生長(zhǎng)，ph過(guò)高或過(guò)低均不利于菌株的生長(zhǎng)。

3.n4菌能在土壤環(huán)境中發(fā)生硝化反應(yīng)去除硝態(tài)氮，廢液和普通培養(yǎng)基這兩種培養(yǎng)方式對(duì)n4菌降解硝態(tài)氮沒(méi)有影響。投菌30d后土壤中的硝態(tài)氮含量就低于或接近正常值，這對(duì)于降低種植地土壤中硝態(tài)氮的本底值，進(jìn)而降低蔬菜中硝態(tài)鹽殘留有重要的意義。

4.n4菌能夠使土壤中硝態(tài)氮降解的同時(shí)銨態(tài)氮含量略有提高，對(duì)促進(jìn)植物的生長(zhǎng)起到一定的積極作用。

5.本發(fā)明通過(guò)生物轉(zhuǎn)化方法，使含有大量淀粉、多糖、果膠、蛋白等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的廢液作為一種天然的微生物培養(yǎng)有益微生物，最終實(shí)現(xiàn)循環(huán)經(jīng)濟(jì)。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明n4菌在兩種培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況；

圖2為本發(fā)明n4菌在不同溫度下的生長(zhǎng)情況；

圖3為本發(fā)明不同初始ph值下n4菌的生長(zhǎng)情況。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖并通過(guò)具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳述，以下實(shí)施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

一種采用甘薯淀粉廢液制備硝酸鹽污染土壤修復(fù)菌劑n4的方法，其轉(zhuǎn)化步驟是：

(1)原料廢液準(zhǔn)備：原料廢液為某甘薯淀粉加工廠(chǎng)排放廢水，其cod為20000mg/l，ss為1600mg/l左右，ph值為4-6，整體呈酸性；

(2)菌種選擇：菌種n4是從農(nóng)田土壤中經(jīng)過(guò)取樣馴化、劃線(xiàn)分離、菌種篩選、劃線(xiàn)純化后得到的一種異養(yǎng)硝化菌，具體方法在[楊宗政，王鑫等.異養(yǎng)硝化菌的分離及其強(qiáng)化活性污泥脫氮效果[j].中國(guó)給水排水，2006，22(21)：67-70]公開(kāi)發(fā)表過(guò)，該n4菌的形態(tài)特征如表1所述：

表1n4菌的形態(tài)特征

(3)原料廢液培養(yǎng)基：

取上清液用雙層醫(yī)用紗布濾去雜質(zhì)，滅菌，4℃冰箱中保存。試驗(yàn)前將廢水于121℃，滅菌20min，滅菌后調(diào)節(jié)ph值在7.0左右；。為驗(yàn)證本發(fā)明的先進(jìn)性，另準(zhǔn)備普通細(xì)菌培養(yǎng)基(g/l)進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)，該普通細(xì)菌培養(yǎng)基的構(gòu)成是：葡萄糖5.0，硫酸銨2.0，硫酸鎂0.02，檸檬酸鈉1.0，磷酸二氫鉀4.0，磷酸氫二鉀6.0，ph7.0-7.2，加瓊脂2％(w/v)做成固體培養(yǎng)基。

(4)n4菌培養(yǎng)

將原料廢液培養(yǎng)基和普通細(xì)菌培養(yǎng)基各100ml分別裝入500ml三角燒瓶中，滅菌后調(diào)節(jié)ph約為7.0，接種od660值為2.0的n4菌母液，置于28℃、200r/min的恒溫空氣搖床中振蕩培養(yǎng)，每隔4h后用血球板計(jì)算菌數(shù)；

(5)分別在上述兩種培養(yǎng)基中接種5％的n4菌，進(jìn)行搖床振蕩培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度在25-45℃范圍內(nèi)，初始ph為6-8，每隔4h用血球板做菌的計(jì)數(shù)。

兩種培養(yǎng)基中n4菌的生長(zhǎng)情況如圖1所示，廢液培養(yǎng)基中的n4菌較普通培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期略有提前且穩(wěn)定期長(zhǎng)。n4菌在穩(wěn)定期的最高濃度較普通培養(yǎng)基中的最高濃度低，可能是由于廢液中的氮源略有不足，但是這兩種培養(yǎng)基中菌的個(gè)數(shù)只是同一數(shù)量級(jí)中的差別，將廢液作為n4菌的培養(yǎng)基是可行的。

在廢液培養(yǎng)基中，不同溫度下培養(yǎng)24h，測(cè)定菌株生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖2所示，n4菌在廢液培養(yǎng)基中，不同培養(yǎng)溫度條件下，菌株生長(zhǎng)量有較大差異，40℃時(shí)菌體生長(zhǎng)明顯好于其他溫度，這是因?yàn)榧?xì)菌生長(zhǎng)是由一系列酶促反應(yīng)組成，在最適溫度范圍內(nèi)，隨著溫度升高，酶活性增強(qiáng)，細(xì)菌生長(zhǎng)代謝速率加快。在超過(guò)最適溫度以后，酶很快失活，代謝速率降低。

將廢液培養(yǎng)基調(diào)節(jié)不同的ph值，再分別接種n4菌，培養(yǎng)24h，在不同的ph下菌株的生長(zhǎng)情況如圖3所示，初始ph為7.0～7.5時(shí)n4菌的生長(zhǎng)繁殖情況良好，其中ph為7.5時(shí)菌的濃度最高，隨著ph的降低，菌株的數(shù)量急劇減少，說(shuō)明培養(yǎng)基過(guò)酸時(shí)，可較大程度地抑制菌體生長(zhǎng)，培養(yǎng)基過(guò)堿時(shí)也不利于菌體的形成，這是由于氫離子影響細(xì)胞膜的通透性和細(xì)胞液中酶活力，n4菌適宜在中性偏堿性環(huán)境中生長(zhǎng)繁殖，并且ph值為7.5是它們的最適生長(zhǎng)ph。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施案例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。