本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因的新用途，即其植物表達載體的構(gòu)建及其在獲得抗硝酸鹽、抗NaCl、抗干旱脅迫能力提高的轉(zhuǎn)基因植物的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

自然界中的植物經(jīng)常遇到各種不良環(huán)境條件，如NO₃^-過量導致的土壤次生鹽漬化、干旱、鹽漬、洪澇、低溫、高溫等非生物脅迫,影響植物的生長發(fā)育,甚至導致植物死亡。非生物脅迫是制約植物生長發(fā)育、影響作物產(chǎn)量和質(zhì)量的關(guān)鍵因素,探討非生物脅迫對植物生長發(fā)育的影響是研究植物抗逆機制的重要內(nèi)容之一,對于開展逆境脅迫耐受性植物育種有著重要意義。

S-亞硝基谷胱甘肽還原酶（S-nitrosoglutathione reductase，GSNOR），以前被稱為谷胱甘肽依賴型甲醛脫氫酶，屬于醇脫氫酶III（alcohol dehydrogenase, ADHIII）家族成員。GSNOR存在于細菌、酵母、哺乳動物、植物等所有物種中，保守性高。在擬南芥、玉米、水稻、向日葵、甜椒、番茄、豌豆、黃瓜、甜瓜中都發(fā)現(xiàn)GSNOR存在。

NO作為一種重要的信號分子，介導了包括種子萌發(fā)、側(cè)根生長、開花、氣孔關(guān)閉等植物發(fā)育過程以及生物和非生物脅迫的應(yīng)答。目前認為NO對植物體的作用具有雙重性，低濃度的NO可以在脅迫下保護植物免受傷害，但是NO本身是一個活性很強的自由基，在高濃度下又可以引起一些毒性效應(yīng)。NO可以與體內(nèi)主要的抗氧化物質(zhì)谷胱甘肽（GSH）反應(yīng)生成S-亞硝基谷胱甘肽（S-nitrosoglutathione，GSNO）。GSNO參與的主要反應(yīng)包括將NO基團轉(zhuǎn)移到靶蛋白的巰基上，形成S-亞硝基硫醇（nitrosothiols，SNOs），這個過程也被稱為S-亞硝基化（S-nitrosylation）。SNOs在NO的生物功能中起非常重要的作用，尤其是GSNO，參與了NO的儲存和轉(zhuǎn)運、調(diào)節(jié)蛋白的活性和信號傳導。

GSNOR是特異的GSNO降解酶，以NADH為還原力催化GSNO最終形成氧化型谷胱甘肽（GSSG）和NH₃。GSNOR通過還原GSNO調(diào)節(jié)胞內(nèi)的NO、小分子SNOs和蛋白質(zhì)亞硝基硫醇的水平，阻止GSNO引起的NO信號傳遞，保護機體免受亞硝化脅迫的影響。GSNOR通過促進GSNO代謝降低NO的生物活性以間接調(diào)控蛋白亞硝基化的水平。此外，由于GSNOR參與的反應(yīng)影響GSH和NADH之間的平衡，所以GSNOR可以間接參與調(diào)控細胞內(nèi)的氧化還原狀態(tài)。

GSNOR參與植物生長、氣孔信號轉(zhuǎn)導、抵御病原菌、熱耐受性、細胞死亡和鎘脅迫等多種生理過程。低溫、高溫、連續(xù)光照、連續(xù)黑暗以及機械傷害處理下豌豆和向日葵中的GSNOR的活性降低，砷脅迫下擬南芥中GSNOR活性增加，而鎘脅迫下豌豆葉片GSNOR活性降低，并伴隨NO和GSH含量降低。GSNOR通過調(diào)控細胞內(nèi)的SNOs水平參與擬南芥的抗病性并正向調(diào)控水楊酸信號途徑。反義表達GSNOR的植株對霜霉病表現(xiàn)出更高的抗性，此外，系統(tǒng)獲得性抗性和病程相關(guān)蛋白（PR1）基因的表達增加，而過表達植株抗性受到抑制。GSNOR參與植物耐熱性調(diào)控，GSNOR缺失導致植物對高溫敏感，而對百草枯的抗性增加。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因的新用途，即用于制備抗硝酸鹽、抗NaCl、抗干旱脅迫能力增強的轉(zhuǎn)基因植物；所述的S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因SlADH3的cDNA來源于番茄（Lycopersicon esculentum Mill．），GenBank登錄號為NM_001251867。

本發(fā)明通過構(gòu)建番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因的植物表達載體pRI101-GFP-SlADH3，利用該載體制備抗性提高的轉(zhuǎn)基因植物；該載體含有番茄SlADH3基因的編碼區(qū)序列（GenBank登錄號為NM_001251867）及35S組成型啟動子、綠色熒光蛋白（GFP）、卡那霉素篩選標記基因（Kan），S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因SlADH3 cDNA的上游為CaMV 35S的組成型表達啟動子。

上述載體中，用于構(gòu)建所屬植物表達載體的起始載體為pRI101（購自Takara公司）。

本發(fā)明的上述目的是通過下述的技術(shù)方案得以實現(xiàn)的：

1、植物表達載體的構(gòu)建

（1）從GenBank中查找番茄SlADH3基因的cDNA序列，并設(shè)計序列如下的一對引物：

上游引物為SlADH3-F-SalI: 5’-GTCGACATGGCTACACAAGGTCAAGT-3’ （下劃線表示添加Sal I酶切位點）；下游引物為SlADH3-R-KpnI: 5’-GGTACCTCATACAAACATATCCAGGAC （下劃線表示添加KpnI酶切位點） 。以番茄第一鏈cDNA為模板擴增，通過PCR擴增得到SlADH3基因的全長cDNA（1140bp）；

（2）回收并純化SlADH3全長基因cDNA片段，并將其連接到pMD18-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中，提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測和酶切檢測獲得正確的重組質(zhì)粒pMD18-SlADH3；

（3）用限制性內(nèi)切酶Sal I和KpnI酶切pMD18-SlADH3和pRI101空載體，回收酶切的片段，通過T4 DNA連接酶連接獲得重組的pRI101-GFP-SlADH3 植物表達載體。

本發(fā)明的植物表達載體對那些能實施轉(zhuǎn)基因操作的植物都適用，如煙草、擬南芥、矮牽牛、非洲菊等。在本發(fā)明的實施中以煙草為例說明該表達載體的應(yīng)用過程。

2、煙草的轉(zhuǎn)化

采用電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pRI101- GFP-SlADH3進入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞LBA4404，涂布在利福平（Spe）和卡那霉素的平板上生長兩天后，用菌落PCR檢測質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中。PCR擴增用SlADH3的上下游引物， 擴增片段理論長度為1140 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中。準備煙草(Nicotiana tabacum cv. NC89)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，篩選具有卡那霉素（Kan）抗性植株，將其轉(zhuǎn)移到含有卡那霉素的MS培養(yǎng)基（含有3 %蔗糖）上繼續(xù)培養(yǎng)，從而獲得無菌的轉(zhuǎn)基因煙草植株。

3、轉(zhuǎn)基因煙草的檢測

（1）為了檢測目的基因SlADH3是否插入轉(zhuǎn)進煙草的基因組，以抗性苗的基因組為模板，利用SlADH3上下游引物做PCR檢測，PCR擴增產(chǎn)物片段理論長度為1140 bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測顯示與理論值相符，說明目的基因SlADH3已插入到煙草基因組中；

（2）為了檢測目的基因SlADH3在轉(zhuǎn)基因煙草中是否翻譯，提取不同株系的蛋白，利用Western blot檢測蛋白表達水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系中SlADH3水平高，但是野生型煙草中沒有表達，說明SlADH3蛋白在轉(zhuǎn)基因煙草中正常表達；

（3）SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草中S-亞硝基谷胱甘肽還原酶活性的檢測

為了檢測SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草中其酶活性是否提高，選取轉(zhuǎn)基因煙草的嫩葉，提取總蛋白，測定S-亞硝基谷胱甘肽還原酶的比活力，測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植物GSNOR比活力明顯高于野生型，說明SlADH3編碼酶在煙草中已成功表達。

4、SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)期抗硝酸鹽能力檢測

將野生型煙草（WT）植株和轉(zhuǎn)基因煙草SlADH3株系 #4、#5、#6的種子，消毒后播種到添加100 mM NO₃^- 的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并統(tǒng)計每天種子萌發(fā)率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率高于野生型植株。

5、SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草幼苗期抗NaCl能力檢測

將野生型煙草（WT）植株和轉(zhuǎn)基因煙草SlADH3株系 #4、#5、#6的種子，消毒后播種到添加100 mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并統(tǒng)計每天種子萌發(fā)率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率高于野生型植株。

6、SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草幼苗期抗干旱能力檢測

將野生型煙草（WT）植株和轉(zhuǎn)基因煙草SlADH3株系 #4、#5、#6的種子，消毒后播種到添加150 mM 甘露醇的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，并統(tǒng)計每天種子萌發(fā)率，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草的發(fā)芽率高于野生型植株。

以上實施例說明本發(fā)明的重組載體pRI101-GFP-SlADH3在轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用可提高其對硝酸鹽、NaCl、干旱脅迫的抵抗能力。

附圖說明

圖1為 pMD18-T-SlADH3的克隆策略；

圖2為植物表達載體pRI101-GFP-SlADH3的克隆策略；

圖3為轉(zhuǎn)基因煙草的檢測；其中 圖A為SlADH3基因在轉(zhuǎn)基因煙草基因組中整合情況檢測示意圖，圖B為SlADH3在轉(zhuǎn)基因煙草中的western blot水平檢測；圖中以野生型煙草基因組為對照模板（WT），#1～6為經(jīng)抗生素篩選出的轉(zhuǎn)基因煙草株系；

圖4為SlADH3基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的S-亞硝基谷胱甘肽還原酶活性；

圖5為SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)期抗硝酸鹽能力檢測結(jié)果；A圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；B圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加100 mM 硝酸鹽培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；C圖 為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽率；D圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加100 mM 硝酸鹽培養(yǎng)基中發(fā)芽率；

圖6為SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)期抗NaCl能力檢測結(jié)果；A圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；B圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加100 mM NaCl培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；C 圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽率；D圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加100 mM NaCl培養(yǎng)基中發(fā)芽率；

圖7為SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)期抗干旱能力檢測結(jié)果；A圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；B圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加150 mM 甘露醇培養(yǎng)基中發(fā)芽的圖片；C圖 為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS培養(yǎng)基中發(fā)芽率；D圖為野生型和SlADH3轉(zhuǎn)基因煙草種子在MS中添加150 mM 甘露醇培養(yǎng)基中發(fā)芽率。

具體實施方式

本實施中采用的試劑主要包括分子生物學實驗試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植物鑒定和檢測所需的各種試劑；各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、質(zhì)粒提取試劑盒、RNA提取試劑盒等為寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品；其余試劑均為國產(chǎn)分析純；儀器均為分子生物學以及基因工程實驗室常用儀器；所有引物序列均在上海捷瑞生物有限公司合成。本發(fā)明實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法。

實施例1：SlADH3基因cDNA的PCR擴增及TA克隆

從GenBank中查找番茄SlADH3基因的cDNA序列，并設(shè)計一對序列如下的引物：

上游引物為SlADH3-F-SalI: 5’-GTCGACATGGCTACACAAGGTCAAGT-3’（下劃線表示添加Sal I酶切位點）；下游引物為SlADH3-R-KpnI: 5’-GGTACCTCATACAAACATATCCAGGAC （下劃線表示添加KpnI酶切位點） 。以番茄第一鏈cDNA為模板擴增，通過PCR擴增得到SlADH3基因的全長cDNA（1140bp）；

用TRIzoL Reagent（Takara）從番茄幼苗中提取總RNA，取番茄嫩根約0.1g，加入1mL的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0.2 mL氯仿，振蕩混勻，離心15 min（12000 rpm），轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5 mL異丙醇，混勻室溫放置10 min，4℃離心10 min（12000 rpm），棄上清，沉淀用75％乙醇1 mL清洗，4℃離心5 min（7500 rpm），棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20 μl焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit（TaKaRa）進行cDNA的合成，取植物總RNA約0.1 -5μg，oligo(dT) 50 ng，10 mM dNTP mix 1 μl，用DEPC處理水補足至10 μl，混勻后，短暫離心將之收集于管底，置于65℃加熱5 min，冰浴10 min，加入反應(yīng)混合物9 μl（5×reaction buffer 4 μl，25 mM MgCl₂ 4 μl，0.1M DTT 2 μl，RNA酶抑制劑1μl），將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫2min，加入1 μl M-MuLV Reverse Transcriptase，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25℃保溫20 min，然后42℃保溫70 min，合成cDNA。

以cDNA為模板，用SlADH3基因cDNA上下游特異性引物進行PCR，PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)體系(20 μL)為1 μL cDNA、2 μL 10×Long taq Buffer、0.4 μL dNTP (10 mM each) 0.1 μL 正向(20μM)、 0.1 μL 反向引物(20μM)、0.2 μL ex Taq DNA polymerase (2U/μL) 16.2 μL ddH₂O。PCR結(jié)束后，取5 μL用于瓊脂糖凝膠電泳，擴增得到SlADH3的全長cDNA 1140 bp?；厥詹⒓兓?i>SlADH3全長基因片段，并將其連接到pMD-18T (大連寶生物公司)載體上(圖1)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α（天根生化科技），采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進一步的PCR檢測和雙酶切檢測。以重組質(zhì)粒為模板，用引物SlADH3-F-SalI和SlADH3-R-KpnI引物擴增得到1140bp的PCR產(chǎn)物。用SalI和KpnI雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒pMD18T-SlADH3單酶切產(chǎn)物理論上為2.7kb和1.14kb左右的條帶。測序結(jié)果表明SlADH3基因正確。

實施例2：構(gòu)建植物表達載體pRI101-GFP-SlADH3

用SalI和KpnI雙酶切pMD18-SlADH3和pRI101，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，分別回收pMD18- SlADH3被切割后產(chǎn)生的SlADH3基因的cDNA片段和pRI101被切割后產(chǎn)生的載體片段，然后用寶生物(TaKaRa)的T4 DNA連接酶連接pRI101和SlADH3基因的cDNA片斷產(chǎn)生植物表達載體pRI101-GFP-SlADH3（圖2）。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率（10⁸）的大腸桿菌感受態(tài)細胞(DH5α，購自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Kan，50 μg/mL)的平板上，于37℃過夜培養(yǎng)，篩選Kan抗性重組子菌落，從Kan抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，篩選連接成功的質(zhì)粒載體pRI101-SlADH3。以質(zhì)粒為模板，利用SlADH3基因上下游引物進行PCR擴增，擴增結(jié)果得到約1140bp左右的條帶。用SalI和KpnI雙酶切檢測，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶，分別為約10kb和1140bp。確認是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單個菌落進行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pRI101-GFP-SlADH3。

實施例3：用pRI101-GFP-SlADH3植物表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌

制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達載體pRI101-GFP-SlADH3轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中，在加有卡那霉素的平板上篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀(BIO-RAD)滑槽中，用1 mm的電擊杯和200歐姆，2.5kV/0.2cm的參數(shù)進行電擊，電擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯, 迅速加入0.5mL LB培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1.5 mL的離心管中；28℃, 200 rpm搖床培養(yǎng)3-5h；室溫下，7500 rpm離心1 min，棄大部分上清，保留100 μl將細胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布于有卡納霉素(Kan，100 μg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入20 μl ddH₂O中，98℃處理5分鐘后取出10 μl農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。PCR檢測pRI101-GFP-SlADH3轉(zhuǎn)化結(jié)果，正對照擴增體系模板使用pRI101-GFP-SlADH3質(zhì)粒，擴增片斷理論長度約為1140bp，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳分析顯示其片段大小與理論預(yù)測值相符，表明質(zhì)粒已轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌。

實施例4：用含有SlADH3的植物表達載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草

挑取攜帶有質(zhì)粒pRI101-GFP-SlADH3的農(nóng)桿菌單菌落接種于50 mL的LB培養(yǎng)基中（含Kan，100 μg/mL），180 rpm，28℃培養(yǎng)24 h，待菌液OD₆₀₀至1.0左右，離心10 min（3000 rpm），沉淀菌體。再用10 mL左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10 min（3000 rpm），沉淀菌體。重復(fù)以上操作2～3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng)基重懸浮，使菌體的OD₆₀₀值為0.5。準備煙草(Nicotiana tabacum cv.NC89)的無菌苗，通過農(nóng)桿菌介導，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進一步篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15～20 min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于愈傷組織誘導培養(yǎng)基MS1（MS+NAA02.1μg/mL+BA 0.02μg/mL）上黑暗共培養(yǎng)2天，將外植體轉(zhuǎn)移至含卡那霉素(50 μg/mL)的芽誘導培養(yǎng)基MS4（MS+NAA0.53 μg/mL+BA 0.5 μg/mL）上進行芽的誘導，約15天繼代一次。待有芽生成后，轉(zhuǎn)入卡那霉素(50μg/mL)的MS培養(yǎng)基上進行根的誘導。

實施例5：SlADH3基因在轉(zhuǎn)基因煙草中插入情況及表達水平的檢測

為了確認通過卡那霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實含有導入的目的基因DNA片段，用PCR方法對篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進一步的鑒定。

首先采用CTAB法提取植物基因組：稱取植物葉片100mg左右置于1.5mL離心管中，加液氮用特制研棒研磨至粉末狀；加入900μl預(yù)熱到65℃的2×CTAB緩沖液（Tris-HCl pH 7.5 100mM，EDTA 20mM，NaCl 1.4M，CTAB 2%），65℃度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500μl氯仿-異戊醇混合液（24：1）搖勻，4℃離心10min（7500rpm）后轉(zhuǎn)移上清至1.5mL EP管；再次加入500μl氯仿-異戊醇混合液（24：1）搖勻，4℃離心10min（7500rpm）；取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3M pH5.2 醋酸鈉和等體積異丙醇，搖勻后4℃離心20min（12000rpm）；棄上清，用75％乙醇清洗兩次后，干燥，用含RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。以轉(zhuǎn)ADH3煙草抗性苗基因組作為模板，用ADH3基因上下游引物進行PCR擴增檢測SlADH3是否插入煙草基因組。擴增產(chǎn)物大小約為1140bp左右，和預(yù)期推測一致，說明目的基因均已插入這些轉(zhuǎn)基因株系的基因組（圖3A）。

為了檢測目的基因是否在轉(zhuǎn)基因煙草中翻譯成蛋白，提取野草的蛋白，利用western blot分析蛋白的表達水平，野生型煙草中沒有目的蛋白的表達，而轉(zhuǎn)基因煙草中有目的蛋白，結(jié)果表明基因SlADH3編碼蛋白已經(jīng)翻譯（圖3B）。

為了檢測目的基因ADH3編碼的蛋白在煙草中是否提高了轉(zhuǎn)基因植株的S-亞硝基谷胱甘肽還原酶的活性，選取經(jīng)western blot檢測正確的轉(zhuǎn)基因株系的嫩葉，測定轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株的S-亞硝基谷胱甘肽還原酶活性，測定結(jié)果顯示轉(zhuǎn)基因植株的SlADH3比活力明顯高于野生型植株，說明SlADH3編碼的蛋白在煙草中已成功表達并發(fā)揮作用（圖4）。

實施例6：轉(zhuǎn)基因煙草種子萌發(fā)期的非生物脅迫抗性檢測

選取經(jīng)過western blot篩選的#4，#5，#6轉(zhuǎn)基因株系的T2代種子，用70%酒精消毒5分鐘，再用0.7%NaClO消毒20分鐘，用滅菌水沖洗5-6遍。然后將種子播種到添加100 mM的硝酸鹽（硝酸鉀和硝酸鈣提供等摩爾的硝酸根）、100 mM NaCl和150 mM甘露醇的MS培養(yǎng)基中，以MS培養(yǎng)基為對照。每個株系播種50粒/皿，每個處理三次重復(fù)。每天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)，第12天發(fā)芽結(jié)束時照相，計算發(fā)芽率。在MS培養(yǎng)基中，SlADH3轉(zhuǎn)基因株系的種子和野生型煙草（WT）的種子的發(fā)芽率沒有差異，都達到了100%（圖5、6、7中的圖A和圖C）。在硝酸鹽、NaCl和甘露醇處理下，轉(zhuǎn)基因煙草種子的發(fā)芽時間早于野生型煙草，并且發(fā)芽率都高于野生型煙草。硝酸鹽處理第5天時，轉(zhuǎn)基因株系#4、#5、#6的發(fā)芽率分別為88%，92%，92%，而WT為40%。NaCl處理第5天時，轉(zhuǎn)基因株系#4、#5、#6的發(fā)芽率為82%，88%，82%，而WT為36%。干旱脅迫在第5天時，轉(zhuǎn)基因株系#4、#5、#6的發(fā)芽率為92%，92%，94%，而WT為70%（圖5、6、7中的圖B和圖D）。實驗結(jié)果表明SlADH3基因的轉(zhuǎn)基因煙草對硝酸鹽、NaCl和干旱脅迫的抗性增強。

本發(fā)明為增強植物對非生物脅迫的抗性提供了一種新的方法，通過基因工程手段培育抗性植物能克服傳統(tǒng)育種的不足，不僅育種周期短，而且操作簡單，容易獲得高抗材料。本發(fā)明來自番茄的SlADH3基因能增強植物對非生物的抗性，將該基因?qū)霟煵?、水稻、康乃馨、洋桔梗等植物中，可以產(chǎn)生具有非生物脅迫抗性的種質(zhì)和品種。利用基因工程技術(shù)防治非生物脅迫具有明顯的優(yōu)勢和不可取代的重要性。它可以為作物、花卉等大規(guī)模生產(chǎn)提供方便，為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)節(jié)約成本且提高管理水平，因此本發(fā)明具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

本發(fā)明通過功能基因組學相關(guān)技術(shù)證實SlADH3基因具有提高植物抗非生物脅迫的功能。將SlADH3基因構(gòu)建到植物表達載體上并轉(zhuǎn)入煙草中過量表達，轉(zhuǎn)基因煙草具有很強的對硝酸鹽、NaCl、干旱脅迫等非生物脅迫的抗性。

序列表

<110> 昆明理工大學

<120> 番茄S-亞硝基谷胱甘肽還原酶基因的新用途

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtcgacatgg ctacacaagg tcaagt 26

<210> 2

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtacctcat acaaacatat ccaggac 27