本發(fā)明屬于分子生物免疫學(xué)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種攜帶兩個(gè)G基因和VP2基因的重組狂犬病病毒及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

由狂犬病病毒(Rabies virus，RV)引起的狂犬病(Rabies)是以侵染中樞神經(jīng)系統(tǒng)為特點(diǎn)的烈性人獸共患傳染病，一旦發(fā)病致死率幾乎高達(dá)100％。亞非地區(qū)屬于狂犬病的高發(fā)地，貓、狗等家養(yǎng)動物是攜帶RV的主要宿主，約99％的患者是被這些動物咬傷或抓傷后而患病，狂犬病仍是嚴(yán)重威脅這些地區(qū)人們生命安全的重要傳染病。我國是狂犬病的高發(fā)區(qū)，發(fā)病人數(shù)僅次于印度，高居世界第二位。隨著家養(yǎng)寵物的增加，我國狂犬病的控制和防治依然任重道遠(yuǎn)。目前對于狂犬病，主要以有效的疫苗防治為主，人或者動物一旦發(fā)病，無特效藥可治，所以，安全有效的疫苗是消除我國人間狂犬病的重要手段。

在我國，犬只成為狂犬病的主要帶毒宿主和傳播源，要想在我國消滅人狂犬病，就必須減少流浪狗的數(shù)量，普及家養(yǎng)犬只的免疫，使其免疫率達(dá)到70％以上，先在動物中消滅狂犬病。我國目前雖然剛批準(zhǔn)幾款具自主知識產(chǎn)權(quán)的獸用滅活狂犬疫苗，但因生產(chǎn)規(guī)模的限制、生產(chǎn)成本的偏高和長期使用進(jìn)口滅活疫苗的慣性，國產(chǎn)獸用滅活疫苗尚未在國內(nèi)大量施用。絕大部分經(jīng)濟(jì)發(fā)達(dá)的城市仍然首選進(jìn)口滅活疫苗，這些滅活疫苗對于農(nóng)村和經(jīng)濟(jì)落后地區(qū)來說價(jià)格太高，難以大規(guī)模推廣使用，國產(chǎn)的滅活疫苗雖然價(jià)格便宜，但其免疫效果不佳。因此，有必要進(jìn)一步降低研發(fā)成本，開發(fā)出價(jià)格低廉、安全、有效的人用及獸用狂犬病疫苗。

另外，犬的另一種高傳染性和高致病性的疾病是犬細(xì)小病毒性腸炎，可引起成年犬嚴(yán)重胃腸炎和幼犬心肌炎。犬細(xì)小病毒(CPV)屬于細(xì)小病毒科，細(xì)小病毒屬。該病毒的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征為無囊膜，直徑約18～26nm，二十面體對稱。多數(shù)病毒粒子含有3種多肽：VP1(70～90KD)、VP2(62～76KD)和VP3(39～69KD)，VP2系構(gòu)成衣殼蛋白的主要成分，具有血凝活性?？找職ぶ兄缓?種蛋白——VP1和VP2，研究表明，VP3是VP2的裂解物，只在衣殼裝配和病毒基因組包裝后才出現(xiàn)。VP2蛋白是CPV主要的抗原蛋白，能誘導(dǎo)犬產(chǎn)生抵抗致死性CPV攻擊的中和抗體，研究表明，犬只血清中CPV的HI抗體≥1:80即可保護(hù)犬只不受CPV野毒感染。CPV目前只有一個(gè)抗原性，CPV-2,主要分為其三個(gè)亞型：CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c，我國流行的主要毒株為CPV-2a亞型。CPV的滅活疫苗能夠有效的防御強(qiáng)毒的攻擊，但是不能有效的阻止已感染犬通過糞便把毒排出體外，且分泌的胃腸道局部抗體有限，所以這種再次感染和傳播是無法預(yù)防的。在免疫持續(xù)期上，CPV滅活疫苗所誘導(dǎo)的血清抗體持續(xù)時(shí)間不超半年，需要加強(qiáng)免疫才能再次產(chǎn)生保護(hù)力，因此，在保持抗體效價(jià)和免疫效果上都具有一定的缺陷。弱毒疫苗大多數(shù)是在CPV-2基礎(chǔ)上改進(jìn)的，在保持抗體效價(jià)和效果方面都比較理想，目前市場上的商品化弱毒疫苗有二聯(lián)苗、四聯(lián)苗、五聯(lián)苗、六聯(lián)苗、八聯(lián)苗。雖然弱毒苗的效果比較理想，在一定程度上能抵抗CPV強(qiáng)毒的感染，但是弱毒株可能發(fā)生突變、毒力返強(qiáng)現(xiàn)象，對犬群和野生動物造成極大危害。傳統(tǒng)疫苗容易受到母源抗體的影響而導(dǎo)致免疫失敗，國內(nèi)外均有犬群接種疫苗后仍暴發(fā)CPV的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，利用分子生物學(xué)手段，以狂犬病疫苗候選株HEP-Flury為骨架，將國內(nèi)目前流行的CPV-2a毒株的VP2基因以及額外一個(gè)狂犬病毒的G基因插入HEP-Flury；通過拯救獲得攜帶兩個(gè)G且表達(dá)VP2蛋白的重組狂犬病毒株，能夠免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗狂犬病病毒抗體與抗犬細(xì)小病毒VP2抗體水平，還可以降低犬用疫苗的成本。

本發(fā)明的目的是提供一株CPV-2a亞型毒株的VP2基因。

本發(fā)明另一目的是提供一種攜帶兩個(gè)G基因和VP2基因的重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，將額外一個(gè)狂犬病毒的G基因及VP2基因同時(shí)克隆至HEP-Flury假基因區(qū)，并拯救出重組病毒。并進(jìn)一步對重組病毒的鑒定以及作為二聯(lián)疫苗的效果評估。

本發(fā)明的再一目的是提供所述重組狂犬病病毒在作為或制備疫苗方面的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一株CPV-2a亞型毒株的VP2基因，該基因的序列如SEQ ID NO.1所示。

該基因是利用通過生物信息學(xué)，從當(dāng)前我國流行的CPV毒株(CPV-2a亞型毒株)中分析篩選并擴(kuò)增得到，其表達(dá)的VP2蛋白免疫動物后產(chǎn)生的中和抗體能夠更加有效的中和當(dāng)前流行的CPV，更好的保護(hù)動物抵抗變異CPV毒株感染。

一種攜帶兩個(gè)G基因和VP2基因的重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，是以狂犬病病毒HEP-Flury株為骨架，將SEQ ID NO.1所示的VP2基因插入HEP-Flury，再插入額外一個(gè)狂犬病毒的G基因，得到攜帶兩個(gè)G基因和VP2基因的重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)，最后拯救篩選獲得重組狂犬病病毒株rHEP-Flury(dG-VP2)。

具體地：是首先將VP2基因克隆到狂犬病病毒HEP-Flury株全長cDNA克隆中，構(gòu)建了表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組cDNA克隆pHEP-Flury(VP2)；在獲得pHEP-Flury(VP2)重組質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，在其基因組G-VP2基因之間再插入一個(gè)拷貝的G基因，成功構(gòu)建攜帶雙G基因和VP2基因的全長感染性克隆pHEP-Flury(dG-VP2)；最后將cDNA克隆pHEP-Flury(dG-VP2)和表達(dá)狂犬病病毒N、P、G和L蛋白的輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，拯救獲得了攜帶雙G基因和VP2基因的一株嵌合狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。

該重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)攜帶兩個(gè)G基因且表達(dá)VP2蛋白，能夠免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗狂犬病病毒抗體與抗犬細(xì)小病毒VP2抗體水平，還可以降低犬用疫苗的成本。

具體地，所述重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)中，構(gòu)建后的兩個(gè)G基因相鄰。而且所述VP2基因被克隆至攜帶兩個(gè)G的狂犬病病毒株rHEP-dG假基因區(qū)的第二個(gè)G后面，即G基因和L基因中間，構(gòu)建策略如附圖1所示。

本發(fā)明拯救的HEP-Flury假基因區(qū)有多個(gè)酶切位點(diǎn)，易于克隆和表達(dá)多個(gè)外源基因，易于將VP2基因克隆至狂犬病病毒株HEP-Flury。本發(fā)明將VP2基因克隆至攜帶兩個(gè)G的狂犬病病毒假基因區(qū)進(jìn)行獨(dú)立表達(dá)的策略，VP2蛋白被單獨(dú)表達(dá)，而非融合表達(dá)。

另外，具體地，作為一種優(yōu)選的可實(shí)施方案，本發(fā)明所述重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的構(gòu)建方法包括如下步驟：

S1.構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)：將SEQ ID NO.1所示VP2基因克隆至狂犬病病毒HEP-Flury株全長cDNA中；

S2.構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)：在重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)基因組的G基因和VP2基因之間再插入一個(gè)拷貝的G基因；

S3.利用重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)進(jìn)行拯救獲得重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。

具體地，步驟S1構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)的具體方法如下：

S11.利用引物VP2.F/VP2.R擴(kuò)增VP2基因，并引入Bsi WI和Nhe I酶切位點(diǎn)

S12.利用核酸限制性內(nèi)切酶Bsi WI和Nhe I，分別VP2基因和pHEP-3.0質(zhì)粒對進(jìn)行酶切處理，兩者的酶切產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)

其中，優(yōu)選地，步驟S11所述引物VP2.F/VP2.R的序列分別如SEQ ID NO.2和3所示。

優(yōu)選地，步驟S12所述pHEP-3.0質(zhì)粒是攜帶HEP-Flury毒株全長cDNA的重組質(zhì)粒。

優(yōu)選地，步驟S11所述擴(kuò)增的PCR體系為：10×KOD Buffer 5.0μL、dNTPs(2.0μM)5.0μL、20pmol的引物VP2.F 1.0μL、20pmol的引物VP2.R 1.0μL、CPV模板DNA、4.0μL、1U/μL的KOD-Plus DNA Polymerase 1.0μL、ddH₂O 33μL。

優(yōu)選地，步驟S11所述擴(kuò)增的PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，52℃30s，68℃2min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；最后68℃延伸10min。

優(yōu)選地，步驟S12所述酶切處理的酶切體系為：VP2/pHEP-3.0 4μL、10×Tango buffer 2μL、Nhe I 1μL、Bsi WI 1μL、ddH₂O 13μL。

優(yōu)選地，步驟S12所述連接的反應(yīng)體系為：VP2基因酶切產(chǎn)物7μL、pHEP-3.0酶切產(chǎn)物1μL、T4DNA連接酶10×Buffer 1μL、T4DNA連接酶1μL。

優(yōu)選地，步驟S2構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)的具體方法如下：

S21.利用引物pDV2.F和pDV2.R對重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到產(chǎn)物命名G-VP2S；

S22.將G-VP2S和重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)分別利用Acc65I/Pst I和Bsi WI/Pst I進(jìn)行雙酶切；兩者的酶切產(chǎn)物連接獲得重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)。

其中，優(yōu)選地，步驟S21所述引物pDV2.F和pDV2.R的序列分別如SEQ ID NO.4和5所示。

優(yōu)選地，步驟S21所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30s，53.6℃30s，68℃2min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。

另外，所述重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在作為或制備狂犬病疫苗方面的應(yīng)用，也在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

本發(fā)明首先以狂犬病病毒疫苗株HEP-Flury為骨架，以我國流行的犬細(xì)小病毒CPV-2a型的VP2蛋白作為二聯(lián)疫苗的抗原蛋白，通過酶切連接，構(gòu)建含有兩個(gè)G基因和VP2基因(見SEQ ID NO.1)的重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)，構(gòu)建策略如附圖1所示。然后對成功拯救的重組狂犬病病毒進(jìn)行PCR、測序、免疫熒光鑒定正確。本發(fā)明還對重組病毒進(jìn)行生長曲線、致病性、免疫原性和攻毒保護(hù)力等生物學(xué)特性研究，以評估其作為二聯(lián)疫苗的效果。結(jié)果顯示，重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)作為重組二聯(lián)疫苗致病性較低，不會對成鼠致死，在BSR細(xì)胞上的滴度比親本株HEP-Flury高，重組二聯(lián)疫苗具有良好的免疫原性，能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生具有保護(hù)效力的狂犬病中和抗體和CPV中和抗體。

具體研究方法方面，本發(fā)明利用分子生物學(xué)手段構(gòu)建攜帶雙G和VP2基因的具有感染性的全長狂犬病毒cDNA，通過細(xì)胞生物技術(shù)拯救出攜帶雙G且表達(dá)犬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組狂犬病毒，利用免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)，研究重組二聯(lián)疫苗的免疫原性。利用分子生物學(xué)手段，以狂犬病疫苗候選株HEP-Flury為骨架，將國內(nèi)目前流行的CPV-2a毒株的VP2基因以及額外一個(gè)狂犬病毒的G基因插入HEP-Flury；通過拯救獲得攜帶兩個(gè)G且表達(dá)VP2蛋白的重組狂犬病毒株，并在體外培養(yǎng)細(xì)胞以及小鼠體內(nèi)進(jìn)行了重組狂犬病毒株作為二聯(lián)基因工程疫苗的效果評估。

本發(fā)明對攜帶雙G和VP2的重組狂犬病病毒進(jìn)行鑒定和在BHK-21細(xì)胞上面?zhèn)鞔癛T-PCR鑒定。經(jīng)免疫熒光試驗(yàn)證實(shí)，重組病毒N蛋白和CPV VP2蛋白在嵌合病毒感染細(xì)胞中均成功表達(dá)。通過Western-blot鑒定重組病毒的G蛋白和VP2蛋白均得到表達(dá)。將rHEP-Flury(dG-VP2)在BHK-21細(xì)胞中連續(xù)傳代20次，通過RT-PCR方法可檢測到rHEP-Flury(dG-VP2)存在雙G基因和VP2基因，進(jìn)行序列測定，沒有發(fā)現(xiàn)任何突變。

本發(fā)明對rHEP-Flury(dG-VP2)重組病毒在BSR上的體外生長曲線進(jìn)行了研究。病毒的一步生長曲線表明rHEP-Flury(dG-VP2)與親本株HEP-Flury相比較生長特性基本一致，并且rHEP-Flury(dG-VP2)在第4天的滴度均高于親本株。

本發(fā)明對rHEP-Flury(dG-VP2)重組病毒免疫原性和攻毒保護(hù)進(jìn)行了研究。將rHEP-Flury(dG-VP2)與親本株HEP-Flury分別制備成弱毒疫苗和滅活+佐劑疫苗，肌肉注射免疫小鼠，21天后采血分離血清，檢測抗狂犬病病毒抗體與抗犬細(xì)小病毒抗體。結(jié)果表明，重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)免疫小鼠后均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的抗狂犬病病毒抗體與抗犬細(xì)小病毒VP2抗體水平，用狂犬病標(biāo)準(zhǔn)攻毒毒株CVS-11進(jìn)行攻毒保護(hù)試驗(yàn)小鼠可獲得80％以上的存活率。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明科學(xué)構(gòu)建了表達(dá)雙G和犬細(xì)小病毒VP2蛋白的重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)。重組狂犬病病毒相比親本株HEP-Flury具有較高的病毒滴度，可以降低犬用疫苗的成本。

本發(fā)明同時(shí)驗(yàn)證出重組病毒均能在小鼠體內(nèi)產(chǎn)生狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒達(dá)到保護(hù)水平的抗體，可以作為狂犬病和犬細(xì)小病的二聯(lián)疫苗候選株。

本發(fā)明的疫苗效果研究顯示，重組狂犬病毒作為弱毒疫苗和滅活疫苗均能產(chǎn)生具有保護(hù)水平的狂犬病病毒和犬細(xì)小病毒抗體。

附圖說明

圖1為構(gòu)建重組狂犬病病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的基因重組策略。

圖2為pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖3為VP2基因擴(kuò)增電泳圖；M：DNA MarkerⅢ，1～2：VP2基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，3：陰性對照。

圖4為pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖；M:DL15000，1:pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒，2:pHEP-3.0質(zhì)粒。

圖5為pHEP-Flury(dG-VP2)質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。

圖6為G-VP2S片段PCR擴(kuò)增電泳圖；M：500bp leader，1-2：G-VP2S PCR產(chǎn)物，3：陰性對照。

圖7為攜帶雙G和VP2基因的重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)雙酶切鑒定圖；M：DL15000，1：pHEP-Flury(dG-VP2)酶切，2：pHEP-Flury(VP2)酶切對照。

圖8為攜帶雙G和VP2基因的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)拯救后免疫熒光鑒定結(jié)果；A：抗N蛋白的熒光抗體染色，B：細(xì)胞對照，C：抗CPV多抗的熒光抗體染色，D：細(xì)胞對照。

圖9為RT-PCR檢測重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的N、雙G和VP2基因電泳圖；A：424bp的N基因片段，B：744bp的雙G基因片段，C：822bp的G/VP2基因片段，D：794bp的G/VP2基因片段，M：Marker DL2000，1：HEP-Flury對照，2：pHEP-Flury(VP2)對照，3：rHEP-Flury(dG-VP2)對照，4：rHEP-dG。

圖10為攜帶雙G和VP2基因的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)及親本株HEP-Flury在BSR上的生長曲線。

圖11為攜帶雙G和VP2基因的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠體內(nèi)的狂犬病抗體水平，同時(shí)設(shè)立親本株HEP-Flury及Mock對照組。

圖12為攜帶雙G和VP2基因的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠體內(nèi)的犬細(xì)小病毒抗體水平，同時(shí)設(shè)立親本株HEP-Flury及Mock對照組。

圖13為攜帶雙G和VP2基因的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)作為弱毒疫苗及滅活疫苗免疫小鼠21天后狂犬病毒攻毒保護(hù)率。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1 CPV流行毒株篩選

1、對臨床采集的疑似CPV的樣品進(jìn)行處理和核酸提取，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

(1)引物序列見表1

CPV的檢測引物CPV1/CPV2參考劉忠華等(2003)的文獻(xiàn)。通過比較GenBank中發(fā)表的登錄號為M74849VP2基因序列，用Primer Premier 5.0(PREMIER Biosoft International)軟件設(shè)計(jì)兩對引物VP2.F/VP2-1.R，VP2-2.F/VP2.R。

表1

(2)利用引物CPV1/CPV2，按表2所示體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增：

表2

(3)取利用引物CPV1/CPV2進(jìn)行PCR檢測陽性的樣品，分別利用引物VP2.F/VP2-1.R，VP2-2.F/VP2.R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，體系如表3所示。

表3

(4)參照Omega公司的凝膠回收試劑盒(E.Z.N.A.Gel Extraction KitI)使用說明書對PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收、純化，與克隆載體pTA2進(jìn)行連接。

連接反應(yīng)體系如表4所示：

表4

(5)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，抽提重組質(zhì)粒，酶切鑒定正確。將質(zhì)粒送測序，結(jié)果得到VP2序列如SEQ ID NO.1。

從GenBank下載其他犬細(xì)小病毒VP2基因的序列，使用ClustalX軟件和MEGA4.0軟件對序列進(jìn)行比對分析，選擇當(dāng)前流行的CPV毒株。

實(shí)施例2 CPV毒株VP2基因克隆至HEP-Flury

1、構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)，策略見圖2所示。

(1)利用引物VP2.F/VP2.R(見表1)擴(kuò)增實(shí)施例1中選擇的CPV毒株的VP2基因(序列如SEQ ID NO.1所示)，VP2.F和VP2.R引物預(yù)計(jì)擴(kuò)增長度為1755bp(擴(kuò)增反應(yīng)體系如表5所示)，分別引入Bsi WI和Nhe I酶切位點(diǎn)。

表5

在PCR管中依次加入上述試劑。

PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；94℃30s，52℃30s，68℃2min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；最后于68℃延伸10min。

(2)反應(yīng)結(jié)束后，取5μL PCR產(chǎn)物于1.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。獲得一條特異的DNA電泳帶，大小約為1755bp，與試驗(yàn)預(yù)期相符，見圖3所示。

(3)將PCR擴(kuò)增的VP2基因進(jìn)行切膠回收、純化，將純化的VP2基因和pHEP-3.0質(zhì)粒(攜帶HEP-Flury毒株全長cDNA的重組質(zhì)粒)用Nhe I和Bsi WI核酸限制性內(nèi)切酶進(jìn)行處理，酶切體系如表6所示：

表6

上述體系混勻后，先37℃孵育3h，用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收。將回收產(chǎn)物連接，連接體系如表7所示：

表7

上述體系混勻后，至于連接儀中，22℃連接24h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化XL10-Gold感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，抽提重組質(zhì)粒，用BsiWI/NheI進(jìn)行酶切鑒定，酶切體系如表8所示：

表8

混勻，37℃水浴2h。

電泳檢測酶切結(jié)果正確，見圖4。

以pHEP-3.0質(zhì)粒做為對照。經(jīng)質(zhì)粒抽提和酶切鑒定正確的質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進(jìn)行序列測定。以G-L1和G-L2為測序引物從正反兩個(gè)方向測序，測序正確的質(zhì)粒命名為pHEP-Flury(VP2)。將酶切鑒定和測序均正確的克隆參照Qiagen公司質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素中提pHEP-Flury(VP2)重組質(zhì)粒，4℃保存待用。

實(shí)施例3利用重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)構(gòu)建重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)

1、利用實(shí)施例2中構(gòu)建的重組質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)構(gòu)建pHEP-Flury(dG-VP2)，構(gòu)建方案見圖5。

(1)以pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒為模板，利用上游引物pDV2.F(序列為5’-CGGGGTACCATGGTTCCTCAGGTTCT-3’)和下游引物pDV2.R(序列為：5’-GCCTGCAGTTTTATCCATATTATTC-3’)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

在上游引物pDV2.F中，劃線部分的序列是Acc65I的酶切位點(diǎn)，與BsiWI互為同尾酶。Acc65I下面的序列為G基因的ORF框的起始密碼子ATG。

下游引物在VP2基因ORF框的位置是281～305位，而PstI在VP2基因ORF框的位置是269～274位。

這對引物以pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增長度為2025bp。

PCR反應(yīng)條件：94℃2min；94℃30s，53.6℃30s，68℃2min，運(yùn)行25個(gè)循環(huán)；68℃延伸10min。

反應(yīng)結(jié)束后，-20℃保存或直接取5μL PCR產(chǎn)物用1.0％的瓊脂糖凝膠(含0.5μg/mL EB)進(jìn)行電泳檢測，大小正確，見圖6，產(chǎn)物命名為G-VP2S。

(2)產(chǎn)物G-VP2S和pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒分別用Acc65I/Pst I和Bsi WI/Pst I進(jìn)行雙酶切，將酶切產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化XL10-gold感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆。

以小量堿裂解法抽提質(zhì)粒，然后以pHEP-Flury(VP2)作為對照，用AflⅡ/PstI進(jìn)行雙酶切，按理論值計(jì)算，pHEP-Flury(VP2)質(zhì)粒酶切為16506bp和1935bp，pHEP-Flury(dG-VP2)質(zhì)粒酶切為16506bp和3581bp，結(jié)果正確，見圖7。

(3)將酶切正確的質(zhì)粒送上海英駿生物工程有限公司進(jìn)行序列測定，正確，質(zhì)粒命名為pHEP-Flury(dG-VP2)。

將酶切鑒定和測序均正確的克隆參照Qiagen公司質(zhì)粒中量提取試劑盒說明書進(jìn)行去內(nèi)毒素中提重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)。待拯救用。

實(shí)施例4利用重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)進(jìn)行重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的拯救及篩選

1、轉(zhuǎn)染和病毒篩選方法參照Inoue(2003)和郭霄峰等(2006)的方法進(jìn)行。

轉(zhuǎn)染：

(1)準(zhǔn)備BHK-21細(xì)胞：12孔細(xì)胞培養(yǎng)板細(xì)胞密度為1×105個(gè)/孔，培養(yǎng)液中含10％胎牛血清；37℃培養(yǎng)12～16h，至細(xì)胞50％-60％匯合。轉(zhuǎn)染時(shí)用800μL 1×PBS洗滌細(xì)胞一次。

(2)取1.25μg重組質(zhì)粒pHEP-Flury(dG-VP2)，0.625μg pH-N，0.3125μg pH-P，0.125μg pH-L和0.1875μg pH-G混勻在1.5mL離心管中，添加滅菌去離子水至75μL，瞬時(shí)離心，使得管頂部的液滴進(jìn)入溶液中。

其中，pH-N、pH-P、pH-L和pH-G為輔助質(zhì)粒，用以輔助拯救重組病毒。

(3)添加7.5μL轉(zhuǎn)染試劑，漩渦震蕩器上震蕩10s。

(4)室溫靜置15min，添加400μL含10％胎牛血清和雙抗(100IU/mL)的DMEM于離心管中，上下顛倒管幾次，混勻。

(5)混勻的溶解液加入細(xì)胞(12孔培養(yǎng)板中的一孔)，37℃培養(yǎng)2.5～3h，靠板壁輕輕吸去DMEM，用1×PBS洗滌細(xì)胞一次，重新添加DMEM(含10％胎牛血清和雙抗)。在37℃5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，細(xì)胞95％長滿后轉(zhuǎn)入34℃培養(yǎng)96h。

病毒篩選：

(1)用錫箔紙包住上述細(xì)胞板，-70℃反復(fù)凍融細(xì)胞3次，冷凍時(shí)間1h，室溫溶解。取60μL上清液和60μL新鮮的BHK-21細(xì)胞(細(xì)胞密度為4×10⁵個(gè)/mL)混合于96孔板，其后在37℃培養(yǎng)48h，34℃培養(yǎng)96h。

(2)傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，每孔加滿80％預(yù)冷的丙酮，快速傾去丙酮，再次加滿丙酮，錫箔紙包住培養(yǎng)板，置-20℃1h。棄去丙酮，輕微空干，每孔添加25μL抗狂犬病病毒N蛋白熒光抗體以及抗CPV熒光抗體，37℃孵育1h，棄去溶解液，用1×PBS洗滌細(xì)胞兩次，每次5min，再用去離子水快速洗滌細(xì)胞一次。

自然干燥，熒光顯微鏡下觀察，均可見大量綠色熒光斑點(diǎn)，見圖8。

拯救獲得的病毒命名為rHEP-Flury(dG-VP2)。

實(shí)施例5重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)的傳代和鑒定

1、將-80℃保存的狂犬病病毒與rHEP-Flury(dG-VP2)取出，檢測病毒滴度，低于10⁵FFU/mL的病毒使用同單層細(xì)胞接種培養(yǎng)法進(jìn)行傳代。在六孔細(xì)胞培養(yǎng)皿中新鮮消化的BSR細(xì)胞約2×10⁵個(gè)/mL，按病毒液:培養(yǎng)液總體積＝1:10進(jìn)行接毒。細(xì)胞在37℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約48h，待細(xì)胞長滿后再放入34℃CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約96h。在-80℃/室溫凍融細(xì)胞1次，收獲病毒，分裝-80℃保存?zhèn)溆谩Ｒ来蝹鞔恋?0次，檢測病毒滴度并進(jìn)行RT-PCR鑒定和VP2蛋白、G蛋白表達(dá)檢測。

RT-PCR檢測包括N基因檢測、雙G檢測、VP2基因檢測，檢測引物見表9。檢測設(shè)HEP-Flury、rHEP-dG(攜帶雙G的重組狂犬病毒)和質(zhì)粒pHEP-Flury(VP2)對照。

表9

2、檢測結(jié)果均正確，如圖9所示。表明本發(fā)明的重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)可以穩(wěn)定傳代。

實(shí)施例6重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在BSR細(xì)胞上的體外生長曲線研究

1、用細(xì)胞營養(yǎng)液調(diào)整BSR細(xì)胞密度為2×10⁵/mL，將狂犬病毒HEP-Flury株和rHEP-Flury(dG-VP2)株病毒濃度調(diào)整為MOI(multiplicity of infection)0.1，于5％CO₂ 37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞完全匯合時(shí)轉(zhuǎn)移至34℃，共培養(yǎng)96h；每隔24h收集100μL上清培養(yǎng)液并進(jìn)行直接免疫熒光抗體檢測，測定不同時(shí)間的病毒滴度，繪制成生長曲線。

2、結(jié)果顯示，重組病毒滴度比親本株滴度高，見圖10。

實(shí)施例7重組病毒rHEP-Flury(dG-VP2)在KM小鼠體內(nèi)的免疫原性及攻毒保護(hù)研究

1、狂犬病病毒的滅活和滅活疫苗的制備：

(1)將HEP-Flury和rHEP-Flury(dG-VP2)病毒滴度稀釋為1×10⁷FFU/mL，按1:4000的比例加入β-丙內(nèi)脂，4℃放置24h，再置于37℃水解2h。將滅活后的病毒液、未滅活的狂犬病毒液分別與BSR細(xì)胞共同培養(yǎng)在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4d后，進(jìn)行固定和熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察各組有無熒光點(diǎn)及細(xì)胞狀態(tài)。結(jié)果滅活病毒無熒光斑點(diǎn)，未滅活病毒均有綠色熒光斑點(diǎn)。

(2)參照法國賽比克公司ESSAL GEL佐劑說明書推薦的方法進(jìn)行滅活疫苗的制備：在超凈工作臺內(nèi)將ESSAL GEL佐劑和已檢測合格的滅活狂犬病毒液按照佐劑在總重量的比例(w/w)為10％混合。在磁力攪拌器上以300r/min的速度攪拌10min，然后將配好的疫苗分裝于滅菌的玻璃瓶內(nèi)，加蓋密封，置于4℃保存?zhèn)溆谩?～8周齡的清潔級昆明系雌性小鼠分為7組，即HEP-Flury弱毒組、rHEP-Flury(dG-VP2)弱毒組、HEP-Flury滅活+佐劑組、rHEP-Flury(dG-VP2)滅活+佐劑組和空白對照組，免疫組每組25只，空白對照組10只。免疫組每只小鼠肌注100μL疫苗(注射劑量約為10⁶FFU/只)，空白對照組肌注100μL DMEM。

于免疫后21d尾靜脈采血制備血清，采用ELISA(法國SYNOBIOTICS公司)進(jìn)行狂犬病病毒抗體檢測和犬細(xì)小病毒HI抗體檢測。

2、結(jié)果顯示，重組病毒均能產(chǎn)生相當(dāng)于親本株的狂犬病抗體，且均大于0.6EU/mL，被認(rèn)為是具有抗狂犬病病毒保護(hù)力的，見圖11。

重組病毒能產(chǎn)生大于1:80的犬細(xì)小病毒HI抗體水平，見圖12，根據(jù)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 14926.57-2001，HI檢測抗體效價(jià)≥1:80判為合格。

3、為了驗(yàn)證小鼠獲得高水平免疫力后是否具有對強(qiáng)毒攻擊的保護(hù)，在免疫后第22d對小鼠顱內(nèi)接種50LD₅₀的CVS-11 30μL，連續(xù)21d觀察小鼠的發(fā)病及死亡情況。

結(jié)果顯示，免疫HEP-Flury弱毒苗的小鼠全部存活，免疫rHEP-Flury(dG-VP2)滅活苗+佐劑的小鼠保護(hù)率為91.7％，rHEP-Flury(dG-VP2)弱毒苗的小鼠保護(hù)率為90.5％，免疫HEP-Flury滅活苗+佐劑的小鼠保護(hù)率88％，在攻毒后第17d至第21d，小鼠不再出現(xiàn)發(fā)病及死亡，即保護(hù)率呈現(xiàn)穩(wěn)定。

上述結(jié)果表明，rHEP-Flury(dG-VP2)制成的弱毒疫苗和滅活+佐劑疫苗在攻毒試驗(yàn)中均符合國際要求的免疫犬攻毒保護(hù)率80％以上的標(biāo)準(zhǔn)，見圖13。

SEQUENCE LISTING

<110> 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120> 一種攜帶兩個(gè)G基因和VP2基因的重組狂犬病病毒及其應(yīng)用

<130>

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1755

<212> DNA

<213> CPV-2a亞型毒株的VP2基因序列

<400> 1

atgagtgatg gagcagttca accagacggt ggtcaacctg ctgtcagaaa tgaaagagct 60

acaggatctg ggaacgggtc tggaggcggg ggtggtggtg gttctggggg tgtggggatt 120

tctacgggta ctttcaataa tcagacggaa tttaaatttt tggaaaacgg atgggtggaa 180

atcacagcaa actcaagcag acttgtacat ttaaatatgc cagaaagtga aaattatagt 240

agagtggttg taaataattt ggataaaact gcagttaacg gaaacatggc tttagatgat 300

acccatgcac aaattgtaac accttggtca ttggttgatg caaatgcttg gggagtttgg 360

tttaatccag gagattggca actaattgtt aatactatga gtgagttgca tttagttagt 420

tttgaacaag aaatttttaa tgttgtttta aagactgttt cagaatctgc tactcagcca 480

ccaactaaag tttataataa tgatttaact gcatcattga tggttgcatt agatagtaat 540

aatactatgc catttactcc agcagctatg agatctgaga cattgggttt ttatccatgg 600

aaaccaacca taccaactcc atggagatat tattttcaat gggatagaac attaatacca 660

tctcatactg gaactagtgg cacaccaaca aatatatacc atggtacaga tccagatgat 720

gttcaatttt acactattga aaattctgtg ccagtacact tactaagaac aggtgatgaa 780

tttgctacag gaacatttta ttttgattgt aaaccatgta gactaacaca tacatggcaa 840

acaaatagag cattgggctt accaccattt ctaaattctt tgcctcaagc tgaaggaggt 900

actaactttg gttatatagg agttcaacaa gataaaagac gtggtgtaac tcaaatggga 960

aatacaaact atattactga agctactatt atgagaccag ctgaggttgg ttatagtgca 1020

ccatattatt cttttgaggc gtctacacaa gggccattta aaacacctat tgcagcagga 1080

cgggggggag cgcaaacaga tgaaaatcaa gcagcagatg gtgatccaag atatgcattt 1140

ggtagacaac atggtcaaaa aactaccaca acaggagaaa cacctgagag atttacatat 1200

atagcacatc aagatacagg aagatatcca gaaggagatt ggattcaaaa tattaacttt 1260

aaccttcctg taacagatga taatgtattg ctaccaacag atccaattgg aggtaaaaca 1320

ggaattaact atactaatat atttaatact tatggtcctt taactgcatt aaataatgta 1380

ccaccagttt atccaaatgg tcaaatttgg gataaagaat ttgatactga cttaaaacca 1440

agacttcatg taaatgcacc atttgtttgt caaaataatt gtcctggtca attatttgta 1500

aaagttgcac ctaatttaac aaatgaatat gatcctgatg catctgctaa tatgtcaaga 1560

attgtaactt actcagattt ttggtggaaa ggtaaattag tatttaaagc taaactaaga 1620

gcctctcata cttggaatcc aattcaacaa atgagtatca atgtagataa ccaatttaac 1680

tatgtaccaa gtaatattgg aggtatgaaa attgtatatg agaaatctca actagcacct 1740

agaaaattat attaa 1755

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物VP2.F

<400> 2

agtcgtacga tgagtgatgg agcagt 26

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物VP2.R

<400> 3

ccctgctagc ttaatataat tttct 25

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 引物pDV2.F

<400> 4

cggggtacca tggttcctca ggttct 26

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 引物pDV2.R

<400> 5

gcctgcagtt ttatccatat tattc 25