技術(shù)特征：

1.一種提高擴(kuò)增子文庫數(shù)據(jù)均一性的文庫構(gòu)建方法，所述方法包括如下步驟：

1)確定多個目標(biāo)區(qū)域的擴(kuò)增子序列，并針對每個所述多個擴(kuò)增子序列分別設(shè)計多重引物，所述多重引物的5’端含有通用序列，為測序接頭序列3’端的一部分；

2)將多重引物劃分為多個反應(yīng)管，每個反應(yīng)管內(nèi)的多重引物滿足：

a)每個反應(yīng)管內(nèi)所有引物的解鏈溫度基本一致；

b)反應(yīng)管內(nèi)的引物相互之間不能形成引物二聚體；

c)引物只能引發(fā)目標(biāo)擴(kuò)增子的擴(kuò)增，不會引發(fā)非特異性擴(kuò)增條帶的形成；

d)引物擴(kuò)增得到擴(kuò)增子之間不存在序列上的互補(bǔ)，不會形成人工融合體；

3)計算每條引物的起始用量，使每個擴(kuò)增子得到均一性擴(kuò)增，得到的擴(kuò)增子濃度差別不大于20％，優(yōu)選不大于10，最優(yōu)選不大于5％，并根據(jù)步驟2)中劃分的反應(yīng)管制備每個反應(yīng)管的多重引物混合物；

4)用每個反應(yīng)管的多重引物混合物對目標(biāo)區(qū)域序列進(jìn)行第1輪擴(kuò)增，得到擴(kuò)增子，并將通用序列引入到擴(kuò)增子的兩側(cè)；

5)對步驟4)獲得的每個反應(yīng)管的擴(kuò)增子進(jìn)行純化和定量；

6)將所有所述反應(yīng)管的擴(kuò)增子進(jìn)行混合，并使得各個擴(kuò)增子的數(shù)目相差在10％以內(nèi)，優(yōu)選5％以內(nèi)；

7)以混合后的擴(kuò)增子混合物為模板、以測序接頭引物進(jìn)行第2輪PCR反應(yīng)，將測序接頭引入到擴(kuò)增子的兩側(cè)；

8)對擴(kuò)增子文庫進(jìn)行純化、定量、測序(優(yōu)選二代測序)。

2.權(quán)利要求1的方法，其中所述擴(kuò)增子純化采用磁珠進(jìn)行。

3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述測序接頭是P5和P7。

4.權(quán)利要求1-3任一項的方法，其中每個反應(yīng)管內(nèi)所有引物的解鏈溫度的標(biāo)準(zhǔn)差≤5℃，優(yōu)選≤2℃。

5.權(quán)利要求1-4任一項的方法，其中反應(yīng)管內(nèi)的引物相互之間不能形成引物二聚體，反應(yīng)管內(nèi)引物的平均解鏈溫度為T_primer–二聚體的解鏈溫度為T_dimer≥10℃，優(yōu)選≥15℃。

6.權(quán)利要求1-5任一項的方法，其中引物只能引發(fā)目標(biāo)擴(kuò)增子的擴(kuò)增，不引發(fā)非特異性擴(kuò)增條帶的形成，設(shè)定反應(yīng)管內(nèi)目標(biāo)擴(kuò)增子引物的平均解鏈溫度為T_primer–非特異擴(kuò)增子引物的解鏈溫度為T_non-specific≥10℃，優(yōu)選≥15℃。

7.權(quán)利要求1-6任一項的方法，其中擴(kuò)增子之間不存在序列上的互補(bǔ)，不形成人工融合體，將擴(kuò)增子之間進(jìn)行兩兩比對，并對比對結(jié)果進(jìn)行熱力學(xué)解鏈溫度(T_pp)計算，反應(yīng)管內(nèi)目標(biāo)擴(kuò)增子引物的平均解鏈溫度為T_primer–T_pp≥10℃，優(yōu)選≥15℃。

8.權(quán)利要求1-7任一項的方法，其中使得每個反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增得到的擴(kuò)增子的數(shù)目相差在10％以內(nèi)，優(yōu)選5％以內(nèi)，按如下進(jìn)行：

對于每個反應(yīng)管中的引物，引物A與DNA模板結(jié)合的平衡方程為：其中在溫度t下，有平衡常數(shù)其中ΔG_A＝-RT×ln(K_A)，[AT]為擴(kuò)增產(chǎn)物、[A]為引物A濃度、[T]為模板濃度、R是氣體常數(shù)，約等于1.9872cal/(K·mol)，T是絕對溫度，對于引物B有同樣的計算公式其中ΔG_B＝-RT×ln(K_B)，[BT]為擴(kuò)增產(chǎn)物、[B]為引物B濃度、[T]為模板濃度、R是氣體常數(shù)，約等于1.9872cal/(K·mol)，T是絕對溫度，使得[AT]＝[BT]，因此有公式：而對于每條引物,ΔG是自由能變化量，通過基于熱力學(xué)的最鄰近法計算獲得；

對于每個反應(yīng)管中的引物，選定任意一個引物的濃度作為基準(zhǔn)濃度，其余的每一個引物都可以通過上面的公式算出與基準(zhǔn)引物濃度的比例，從而可以確定每個引物的濃度。

9.權(quán)利要求1-8任一項的方法，其中使得各個反應(yīng)管之間擴(kuò)增子的數(shù)目大致相當(dāng)，按如下方式實現(xiàn)：調(diào)節(jié)各反應(yīng)管合并時所需體積，所述體積由各反應(yīng)管內(nèi)擴(kuò)增子的數(shù)目和濃度決定，比如擴(kuò)增子劃分為3個反應(yīng)管，每個反應(yīng)管內(nèi)的擴(kuò)增子數(shù)目分別為A、B和C，對應(yīng)的濃度分別為a、b和c，那么這三個反應(yīng)管合并所需的體積分別為：1、aB/Ab和aC/Ac。