專利名稱：利用膜分離技術(shù)高效制備一類不均一性安絡(luò)小皮傘多糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取濃縮一類不均一性安絡(luò)小皮傘多糖的方法。
背景技術(shù)：
中國(guó)農(nóng)產(chǎn)品每年因作物病害減產(chǎn)數(shù)十億噸，防治農(nóng)作物病害對(duì)保障國(guó)民經(jīng)濟(jì)的穩(wěn)定發(fā)展和不斷提高人民生活水平具有重要的意義。使用化學(xué)農(nóng)藥是減少作物病害損失的有效手段，但由于大量使用、濫用以及農(nóng)藥的不可降解性，造成環(huán)境污染、生態(tài)破壞、食品污染及人畜毒等事件頻發(fā)，并導(dǎo)致嚴(yán)重的3R(殘留、抗性、再增猖獗)問(wèn)題。水稻稻瘟病是全世界稻區(qū)危害最嚴(yán)重的水稻病害之一，一般造成水稻減產(chǎn)10% —20%。以我國(guó)為例，20世紀(jì) 90年代以來(lái)，該病的年發(fā)生面積均在380萬(wàn)公頃以上，年損失稻谷達(dá)數(shù)億千克。由于稻瘟病菌小種構(gòu)成復(fù)雜，而且變化很快，易導(dǎo)致水稻抗病品種喪失，稻瘟病菌的多變性也常使其抗農(nóng)藥性發(fā)展迅速，因此篩選一種新的殺菌劑是十分必要的。真菌多糖一般是指各種真菌的子實(shí)體和類所產(chǎn)生的一類代謝產(chǎn)物，通常是極性大分子化合物，能夠控制細(xì)胞分裂分化，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)衰老的一類活性多糖，被譽(yù)為21世紀(jì)的健康衛(wèi)士。與動(dòng)、植物多糖不同的是真菌多糖分子單體之間，大多以β(1 —3)與β (I — 6)糖苷鍵結(jié)合，形成鏈狀分子，具有螺旋狀的立體構(gòu)型。多糖又分為均一性多糖和不均一性多糖兩類。(I)均一性多糖一般由10個(gè)以上的同一種單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成，可分為直鏈結(jié)構(gòu)，也可有分支結(jié)構(gòu)。(2)不均一性多糖是由不同單糖分子縮合而成的多糖，除含有糖鏈外，還可含有肽鏈或脂類成份。大部分的多糖都屬于不均一性多糖。安絡(luò)小皮傘類多糖是安絡(luò)小皮傘的重要活性成分，它的藥用價(jià)值較高，我國(guó)民間用它的菌絲來(lái)治療跌打損傷、骨折疼痛、坐骨神經(jīng)痛、偏頭痛、麻風(fēng)性神經(jīng)痛和風(fēng)濕關(guān)節(jié)痛等，但是對(duì)于防治作物病害方面國(guó)內(nèi)外報(bào)道的很少。本課題組通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖是一個(gè)高效、殺菌譜廣、對(duì)作物和肺靶標(biāo)生物以及環(huán)境安全的真菌多糖，尤其對(duì)稻瘟病菌有良好的防效，經(jīng)多次試驗(yàn)證明對(duì)稻瘟病菌的菌絲生長(zhǎng)的抑制率高達(dá)93. 5%。目前多糖提取工藝一般多采用水浴、酶提和層析、精餾、重結(jié)晶等工藝過(guò)程，其缺點(diǎn)一、是工藝繁瑣、溫度、時(shí)間要求特定。二、是沒(méi)有進(jìn)行有效組分提純或生產(chǎn)中無(wú)法實(shí)現(xiàn)組分提純，多是以雜多糖形成制品，其產(chǎn)品中無(wú)效的糟柏成分較多、有效功效低，這局限了其在制藥方面的開(kāi)發(fā)和利用。三、是現(xiàn)有工藝成本高，功效低，難以規(guī)模化生產(chǎn)。四、是現(xiàn)有工藝處理步驟中用到的一些化學(xué)藥品，其既浪費(fèi)資源，又污染環(huán)境，而且對(duì)產(chǎn)品的有效成分還有一定程度的破壞。膜分離技術(shù)是國(guó)際上公認(rèn)的20世紀(jì)末至21世紀(jì)中期最有發(fā)展前途的前沿技術(shù)。膜分離是以選擇性透過(guò)膜為分離介質(zhì)，當(dāng)膜兩側(cè)存在推動(dòng)力時(shí)，原料的組分可透過(guò)選擇膜而對(duì)混合物進(jìn)行分離、提純、濃縮的一種分離過(guò)程。膜分離技術(shù)是當(dāng)今世界一項(xiàng)先進(jìn)的精細(xì)分離技術(shù)，膜技術(shù)的分離孔徑從納米級(jí)至微米級(jí)，能把一切物質(zhì)分離開(kāi)，它的分離比以重力為基礎(chǔ)的離心機(jī)收得率高30%以上。因此，本項(xiàng)目以該技術(shù)為基礎(chǔ)原理的所研發(fā)的一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖發(fā)酵后的安絡(luò)小皮傘類多糖制備工藝具有比以濾布為介質(zhì)的板框等分離精度高一個(gè)數(shù)量級(jí)；比化學(xué)萃取工序簡(jiǎn)單，無(wú)相變、無(wú)污染；比蒸餾分離、蒸發(fā)濃縮能耗低80% 90%等優(yōu)點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有的一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖制作方法存在的制作工藝復(fù)雜成本高及制作得到的多糖含量低、發(fā)酵液雜質(zhì)多以及使用化學(xué)藥品對(duì)產(chǎn)品的有效成分造成破壞等。本發(fā)明提供一種利用膜分離技術(shù)濃縮純化一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖制作方法。用以解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的勞動(dòng)強(qiáng)度大、生產(chǎn)效率低、環(huán)境污染嚴(yán)重、生產(chǎn)成本高、產(chǎn)品質(zhì)量差、產(chǎn)品收率低等問(wèn)題。本發(fā)明的膜材料是陶瓷無(wú)機(jī)膜。本發(fā)明所用的陶瓷無(wú)機(jī)膜與高聚物分離膜相比優(yōu)點(diǎn)是(I)熱穩(wěn)定好，適用于高溫、高壓體系。試用溫度一般都可以達(dá)到400°C，有時(shí)可以高達(dá)800°C。(2)化學(xué)穩(wěn)定性好，能耐酸和弱堿，pH值試用范圍寬。(3)抗微生物能力強(qiáng)，與一般微生物不發(fā)生生化及化學(xué)反應(yīng)。(4)陶瓷膜組件機(jī)械強(qiáng)度大。(5)清潔狀態(tài)好。本身無(wú)毒，不會(huì)使被分離體系受到污染。容易再生和清洗。當(dāng)膜污染被堵塞后、可以進(jìn)行反吹及沖洗，也可以在高溫下進(jìn)行化學(xué)清洗。(6)陶瓷膜的孔分布 窄，分離性能好。本發(fā)明一種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取濃縮一類不均一性真菌多糖的芽孢的方法，按照以下步驟進(jìn)行一、將產(chǎn)安絡(luò)小皮傘類多糖的安絡(luò)小皮傘經(jīng)深層發(fā)酵后得到發(fā)酵液；二、將步驟一中的發(fā)酵液冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)破碎，過(guò)60目篩；三、將步驟二中的類干粉加蒸餾水在70°C恒溫水浴鍋浸提2h ;四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25 45°C、膜通量為50 60LMH條件下，經(jīng)過(guò)截留分子量為O. 01 O. 03um的無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜和微濾技術(shù)來(lái)濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，通過(guò)的溶液為安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為6 7倍；五、將步驟四中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25 45°C、膜通量為35 45LMH條件下通過(guò)截留分子量為4000 9000k的無(wú)機(jī)陶瓷超濾膜和超濾技術(shù)來(lái)濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側(cè)液的溶液為不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為10 15倍；六、將步驟五中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液經(jīng)噴霧干燥制成粉末，即得到不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，噴霧干燥的進(jìn)口溫度為170 210°C，出口溫度為80 95°C。本發(fā)明的方法中的膜過(guò)濾技術(shù)自動(dòng)化程度高，操作簡(jiǎn)單，減少了人力成本且不需要使用過(guò)濾劑進(jìn)行過(guò)濾，本發(fā)明的制作方法成本低。本發(fā)明制作得到不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖殺菌劑中安絡(luò)小皮傘類多糖含量高，制作得到的小皮傘真菌多糖殺菌劑不易吸潮，保質(zhì)期長(zhǎng)。


圖I利用膜分離技術(shù)高效制備一類不均一性安絡(luò)小皮傘多糖的工藝生產(chǎn)流程框圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施方式
，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
具體實(shí)施方式
一本實(shí)施方式一種膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離提取濃縮一類不均一性小皮傘真菌多糖的方法按照以下步驟進(jìn)行一、將產(chǎn)安絡(luò)小皮傘類多糖的安絡(luò)小皮傘經(jīng)深層發(fā)酵后得到發(fā)酵液；二、將步驟一中的發(fā)酵液冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)破碎，過(guò)60目篩；三、將步驟二中的類干粉加蒸餾水在70°C恒溫水浴鍋浸提2h ；

四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25_45°C、膜通量為50-60LMH條件下，經(jīng)過(guò)截留分子量為O. 01-0. 03um的無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜來(lái)濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，通過(guò)的溶液為安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為6-7倍；被截留的在膜的近側(cè)液的溶液中主要成分為類和不溶性物等。五、將步驟四中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25_45°C、膜通量為35-45LMH條件下通過(guò)截留分子量為4000_9000k的無(wú)機(jī)陶瓷超濾膜來(lái)濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側(cè)液的溶液為不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為10-15倍；通過(guò)的溶液為鹽、氨基酸等一些小分子物質(zhì)。六、將步驟五中的不均一'丨生安絡(luò)小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液經(jīng)噴霧干燥制成粉末，即得到不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖殺菌劑，噴霧干燥的進(jìn)口溫度為170 210°C，出口溫度為80 95。。。本實(shí)施方式得到的一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的保質(zhì)期為2年以上。本實(shí)施方式得到的一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的分子量為180萬(wàn)。13CNMR譜測(cè)定表I 一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的化學(xué)移植峰號(hào)化學(xué)位移值δ (ppm)峰號(hào)化學(xué)位移值δ (ppm)
1104.61073.2
2103. I1172.8
3102.31272.8
4101. 21369.6
580.51469.8
680.31568.9 778.51664.0
875.81763.8
974.3表2 —類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的C-I區(qū)解析
糖殘基碳原子化學(xué)位移值S (ppm) 峰高比
—2) -Man-(I— C-I104.6 I
-4)- a -D-Glc-Cl- C-I102.3 3
A-D-Glc-(I— C-I101. I I
—2)-Mane - (I— C-I103. I I t表3 —類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的C-6區(qū)解析
糖殘基碳原子化學(xué)位移值δ (ppm)
Glc _(n—C-663.4Man - (n—C-663.8 —2) -Manc - (I—C-668.7
t表4 一類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖取代后的C-2、C-3、C_4區(qū)解析糖殘基碳原子化學(xué)位移值δ (ppm)
—2)_Man - (I—C-280.2—4)- a-D-Glc-(l- C_478.6
—2)-Maru — (I—C~280.7
t具體實(shí)施方式
二 本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟一中將一類不均一性小皮傘接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為為25-28°C，發(fā)酵時(shí)間為60-70h。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一或二不同的是步驟四中小皮傘類多糖溶液濃縮倍數(shù)為7倍。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一或二相同。
具體實(shí)施方式
四本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
三不同的是步驟四中濾液通過(guò)截留分子量為O. 02um的微濾膜過(guò)濾。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
三相同。
具體實(shí)施方式
五本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
四不同的是步驟五中小皮傘類多糖溶液濃縮倍數(shù)為14倍。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
四相同。
具體實(shí)施方式
六本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
五不同的是步驟五中濾液通過(guò)截留分子量為7000k的超濾膜過(guò)濾。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
五相同。
具體實(shí)施方式
七本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟七中噴霧干燥的進(jìn)口溫度為180°C，出口溫度為75°C。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
八本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
二不同的是一類不均一性小皮傘接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28°C，發(fā)酵時(shí)間為70h。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
二相同。
具體實(shí)施方式
九本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式
一不同的是步驟五中將發(fā)酵液通過(guò)截留分子量為5000 8000k的超濾膜過(guò)濾。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式
一相同。
具體實(shí)施方式
十不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的防治效果，采用抑菌圈法首先刮取病原菌孢子制成孢懸液，將孢懸液(I X IO6個(gè)/mL)與融化并冷卻至45°C左右的PDA培養(yǎng)基混勻，制平板。不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖點(diǎn)接于病原菌平板上，28°C培養(yǎng)72h，觀測(cè)抑菌圈。也可將不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖和病原菌成十字交叉排列(病原菌在十字的中央，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖在十字的兩端)。培養(yǎng)3-4天后，觀察抑菌圈大小。得出的結(jié)果見(jiàn)表5和表6。
表5不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的抑菌譜測(cè)定結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種利用膜分離技術(shù)從發(fā)酵液中分離濃縮提取不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖的方法，其特征在于，按照以下步驟進(jìn)行一、將產(chǎn)安絡(luò)小皮傘類多糖的安絡(luò)小皮傘經(jīng)深層發(fā)酵后得到發(fā)酵液；ニ、將步驟一中的發(fā)酵液冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)破碎，過(guò)60目篩；三、將步驟ニ中的類干粉加蒸餾水在70°C恒溫水浴鍋浸提2h ;四、將步驟三中的浸提液在操作溫度為25 45°C、膜通量為50 60LMH條件下，經(jīng)過(guò)截留分子量為O. 01 O. 03um的無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，通過(guò)的溶液為安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為6 7倍；五、將步驟四中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液在操作溫度為25 45°C、膜通量為35 45LMH條件下通過(guò)截留分子量為4000 9000k的無(wú)機(jī)陶瓷超濾膜來(lái)濃縮純化浸提液中不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖，其中被截留的在膜的近側(cè)液的溶液為不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液，不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖濃縮倍數(shù)為10 15倍；六、將步驟五中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液經(jīng)噴霧干燥制成粉末，即得到不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖產(chǎn)品，噴霧干燥的進(jìn)ロ溫度為170 210°C，出ロ溫度為80 95。。。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟一中將安絡(luò)小皮傘接種到發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為25-28°C，發(fā)酵時(shí)間為60 70h。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟三中料水重量比為I: 15。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟四中溶液通過(guò)截留分子量為O.02um的無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在干，步驟五中溶液通過(guò)截留分子量為8000k的超濾膜過(guò)濾。
6.根據(jù)權(quán)利要求I或5所述的方法，其特征在于，步驟五中ー類不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液的濃縮倍數(shù)為14倍。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟六中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，步驟七中噴霧干燥的進(jìn)ロ溫度為190°C，出口溫度為85で。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了利用膜分離技術(shù)高效制備一類不均一性安絡(luò)小皮傘多糖的方法，按照以下步驟進(jìn)行一、深層發(fā)酵后得到發(fā)酵液；二、將發(fā)酵液冷凍干燥至恒質(zhì)量，粉碎機(jī)破碎，過(guò)60目篩；三、恒溫水浴鍋浸提；四、無(wú)機(jī)陶瓷微濾膜濃縮純化；五、通過(guò)截留分子量為4000～9000k的無(wú)機(jī)陶瓷超濾膜濃縮純化；六、將步驟五中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液用sevage液去除蛋白；七、將步驟六中的不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖溶液經(jīng)噴霧干燥制成粉末，即得到不均一性安絡(luò)小皮傘類多糖產(chǎn)品，噴霧干燥的進(jìn)口溫度為170～210℃，出口溫度為80～95℃。本發(fā)明的制作方法成本低，制作得到的產(chǎn)品質(zhì)量好，保質(zhì)期長(zhǎng)，密封條件下可保存2年以上不變質(zhì)。
文檔編號(hào)C12R1/645GK102676609SQ20111044266
公開(kāi)日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者安德榮 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)