本發(fā)明屬于基因檢測
技術(shù)領(lǐng)域：
，涉及一種用于檢測癌癥相關(guān)基因的試劑盒及檢測方法，具體涉及雜交的序列捕獲文庫的制備方法及技術(shù)。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤，俗稱癌癥，據(jù)統(tǒng)計癌癥已經(jīng)成為我國城鄉(xiāng)居民的首要死因。近百年來，人們對于癌癥的研究一直沒有間斷，但具體病因仍然不能確定。隨著科學(xué)進(jìn)步發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)癌基因與抑癌基因在癌癥發(fā)生上起到關(guān)鍵作用。癌基因(oncogene)一般可定義為某種基因，它的異常表達(dá)或表達(dá)產(chǎn)物的異常直接決定細(xì)胞惡性表型的產(chǎn)生?，F(xiàn)已知道在腫瘤發(fā)生中，作為環(huán)境因素的病毒、化學(xué)致癌物和射線，它們作用于機(jī)體內(nèi)的靶分子都是DNA，導(dǎo)致原癌基因的激活引發(fā)癌癥發(fā)生。癌基因可以促進(jìn)細(xì)胞增殖與遷移，可以抑制細(xì)胞分化和凋亡，其在腫瘤細(xì)胞中大量表達(dá)。抑癌基因(tumor-suppressorgene)存在于正常細(xì)胞中，在被激活情況下它們具有抑制細(xì)胞增殖與遷移，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用，它們的丟失、突變或失去功能，使激活的癌基因發(fā)揮作用而致癌。近年來隨著基因組學(xué)的發(fā)展，不少基因檢測為主的研究項目已經(jīng)取得標(biāo)志性的階段成果，尤其對于癌癥的診斷預(yù)防具有不可替代的優(yōu)勢。20世紀(jì)初，人們認(rèn)識到癌癥是一種遺傳病，并且在整個20世紀(jì)，科學(xué)家們開展了大量的細(xì)致、有突破性的研究來發(fā)掘癌癥的發(fā)生發(fā)展與基因之間的聯(lián)系。在研究的過程中，涌現(xiàn)了許多先進(jìn)的技術(shù)和研究手段，使得科學(xué)家們更高效地找到了更多與癌癥相關(guān)的遺傳變異，其中細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)逐漸嶄露頭角，例如熒光原位雜交(FISH)和比較基因組雜交(CGH)技術(shù)廣泛應(yīng)用于鑒定染色體變異，揭示癌癥生物學(xué)的重要信息。隨后一代測序技術(shù)廣泛應(yīng)用于目標(biāo)區(qū)域測序，并且鑒定了許多熱點突變基因。到20世紀(jì)90年代，基因芯片技術(shù)的發(fā)展使得人們有機(jī)會更大規(guī)模地研究癌癥相關(guān)基因。在過去的十年，關(guān)于癌癥的研究取得了空前的進(jìn)步，而這都?xì)w功于新一代測序技術(shù)提供的技術(shù)和大量的數(shù)據(jù)。與一代測序技術(shù)相比，二代測序技術(shù)具有高通量、高準(zhǔn)確性的技術(shù)特點，可對數(shù)以億計的DNA片段同時進(jìn)行測序，這一技術(shù)進(jìn)步使得測序成本大大降低。雖然二代測序技術(shù)的高通量特點大大降低了測序成本，但是得到一個人的完整基因組數(shù)據(jù)仍然需要花費1萬美元，并且由于研究進(jìn)展限制很多得到的序列信息并不了解臨床意義，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用。另一方面，對于研究人類某些疾病的科學(xué)家來說，他們并不需要對整個基因組進(jìn)行測序，他們感興趣的往往只是與疾病密切相關(guān)的很小部分的基因組區(qū)域，如果能選擇性地對這些區(qū)域進(jìn)行測序，可以顯著地降低測序成本同時也能縮短測序時間和生物信息分析周期。目標(biāo)序列捕獲技術(shù)的出現(xiàn)，緩解了上述問題。目標(biāo)序列捕獲測序是針對已知的特定基因組區(qū)域設(shè)計探針捕獲后進(jìn)行測序。目前常用的序列捕獲方法有：PCR法、分子倒置探針法(MolecuLarinsersionprobe，MIP)和雜交法。PCR法具有高靈敏性、高特異性和重復(fù)性好等優(yōu)點，不過這種方法通量小，適合捕獲一些很小的區(qū)域，并且PCR反應(yīng)由于在同一反應(yīng)中使用多種引物，導(dǎo)致大量非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生和部分區(qū)域無法擴(kuò)增等問題。分子倒置探針法具有樣品前期處理簡單、樣品需求量小等優(yōu)點，然而其分子探針合成成本較高，均一性較差，難以對一些區(qū)域較大的基因組序列進(jìn)行捕獲。雜交法在二代測序平臺中應(yīng)用較為廣泛，主要分為固相雜交法和液相雜交兩種方法，固相雜交法所用的探針通常都是固定在固體支持物上，如玻璃片、塑料球等，其中最典型的是基因芯片。液相雜交與固相雜交最大的差異在于雜交反應(yīng)的環(huán)境不同。液相雜交是通過在溶液中，目標(biāo)DNA片段和已帶有生物素標(biāo)記探針直接雜交，然后通過生物素親和素的反應(yīng)使目標(biāo)DNA片段錨定在帶有親和素的微珠上。洗去非目標(biāo)DNA，洗脫后，富集的DNA用于測序。液相雜交與固相雜交相比有兩大優(yōu)勢：雜交效率更高；易于操作，時間短，便于自動化操作。因此，基于以上研究成果及技術(shù)特點，開發(fā)一種合適的、準(zhǔn)確度高的、低成本的檢測癌癥相關(guān)基因的測序方法是迫切需要的技術(shù)進(jìn)步，這一方法可以有效地評估人們的患癌風(fēng)險，根據(jù)結(jié)果對高風(fēng)險人群進(jìn)行科學(xué)的健康管理，達(dá)到提早預(yù)防和發(fā)現(xiàn)癌癥的目的。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明一方面在于提供了一種從人的血液樣本DNA或癌組織樣本DNA中有選擇地捕獲特定外顯子或目標(biāo)基因的高效而低成本的捕獲文庫的構(gòu)建方法。本發(fā)明涉及的腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因的捕獲文庫的構(gòu)建方法，是針對腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因的207個高突變區(qū)域(如TP53、KRAS、HRAS等)設(shè)計的，其基因名稱和染色體坐標(biāo)信息如表2，再根據(jù)表2所述的每個區(qū)域設(shè)計特異擴(kuò)增引物(如表3，其堿基序列如SEQIDNO.1～414所示)，分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，207個PCR產(chǎn)物純化后分別定量，等量混合擴(kuò)增片段，最終構(gòu)建捕獲文庫。上文所述的捕獲文庫的構(gòu)建方法，還包括利用堿基序列如SEQIDNO.1～414所述的引物，用標(biāo)準(zhǔn)的人基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增、純化、分別定量后，均一等量混合207個PCR產(chǎn)物，將混合的PCR產(chǎn)物進(jìn)行片斷化處理，獲得大小為70-130bp的DNA片斷，通過表面帶有鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠來分離純化帶有生物素標(biāo)記的含有目標(biāo)基因DNA片斷，從而獲得帶有生物素標(biāo)記的捕獲文庫。具體的，上文使用3.0熒光計(ThermoFisherScientific)對每個PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。根據(jù)定量的結(jié)果均一等量混合207個PCR產(chǎn)物。具體的，本發(fā)明實施例中是將PCR產(chǎn)物統(tǒng)一稀釋至25ng/uL，后每個取2uL混合。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)需要自行調(diào)整此濃度。對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述進(jìn)行片斷化處理的方法為超聲波打斷法。對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述PCR擴(kuò)增體系為：PCR擴(kuò)增條件為：95℃、5min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35個循環(huán)；72℃、10min；4℃、∞。上述操作涉及將生物素標(biāo)記的Biotin-11-dUTP摻入合成的DNA產(chǎn)物中，通過優(yōu)化PCR的反應(yīng)體系，主要是優(yōu)化dUTP與dTTP的比例，當(dāng)dUTP：dTTP為1：3時，擴(kuò)增帶有Biotin-11-dUTP的PCR產(chǎn)物效果最佳。本發(fā)明的另一方面在于，保護(hù)利用上述方法獲得的腫瘤相關(guān)突變基因的捕獲文庫。本發(fā)明的另一方面在于，保護(hù)利用上述的捕獲文庫，制備的腫瘤相關(guān)突變基因的檢測試劑盒。對于上述技術(shù)方案，優(yōu)選的情況下，所述的檢測試劑盒，其特征在于：包括以下試劑：建庫試劑：KAPAHyperPrepKitIlluminaplatforms封閉試劑：COTDNA、封閉引物雜交試劑：Hybridiation緩沖液(Roche)探針：權(quán)利要求5所述的雜交捕獲文庫生物素親和磁珠：invitrogenMyOneTMStreptavidinT1洗脫試劑：1×Wash緩沖液I(1×SSC,0.1％SDS)，1×Wash緩沖液II(0.1×SSC,0.1％SDS)富集試劑：KAPAHiFiHotStartReadyMix，Post-LM-PCROligos1&2,5uM。具體的利用上述的捕獲文庫制備的腫瘤相關(guān)突變基因的檢測試劑盒，其使用方法已經(jīng)在本發(fā)明實施例中寫明。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實施例中的所述方法，即：3.樣本基因組DNA提取及文庫制備；4.目標(biāo)序列的雜交捕獲、洗脫與富集；5.文庫質(zhì)檢；6.高通量測序與數(shù)據(jù)分析最終獲得檢測結(jié)果。有益效果：本發(fā)明所構(gòu)建的捕獲文庫中每個PCR產(chǎn)物是均一等量混合，從而確保了目標(biāo)區(qū)域捕獲的一致性，同時由于每個PCR產(chǎn)物被隨機(jī)打斷成一些較短的DNA片段，每個短DNA片段都能特異的通過互補(bǔ)配對雜交捕獲相對應(yīng)的目標(biāo)區(qū)域，從而確保了文庫具有更高的捕獲效率。這就解決了目前芯片捕獲存在的捕獲不均一的問題和捕獲效率低的問題，可以提高測序的有效數(shù)據(jù)量。本發(fā)明提供的捕獲文庫構(gòu)建方法，非常的適合應(yīng)用于選擇性的捕獲特異性的目標(biāo)基因，因此可以針對與特定疾病相關(guān)的基因。在這樣的應(yīng)用中，通常會針對疾病相關(guān)的十幾個甚至數(shù)百個特定的基因，所以要求實驗中能具有高特異性的捕獲率和高通量的測序驗證。為了解決靶基因捕獲測序，本發(fā)明另一方面在于提供了一種從人的血液樣本DNA或癌組織樣本DNA中選擇性地捕獲特定外顯子或目標(biāo)基因的方法，提供了一種針對腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因207個高突變區(qū)域的高效而低成本的檢測試劑盒。本發(fā)明應(yīng)用構(gòu)建好的捕獲文庫對待測樣本的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行雜交，從而有選擇地捕獲目標(biāo)區(qū)域。這種方法不但具有高性價比的優(yōu)勢，而且檢測結(jié)果具有較高的準(zhǔn)確性和檢出率。本發(fā)明中，構(gòu)建的捕獲文庫可以同時雜交4-8個樣品，樣品可以通過本領(lǐng)域熟悉的二代建庫方法先將待捕獲樣品分別進(jìn)行測序文庫構(gòu)建，加上不同的index標(biāo)記，一端加上Illumina公司的TruSeqUniversalAdapter，另一端加上例如但不限于Illumina公司的TruseqAdapterindex1或者TruseqAdapterindex2或者TruseqAdapterindex3或者TruseqAdapterindex4，將加上不同index的4-8個樣品進(jìn)行等量混合，然后用捕獲文庫進(jìn)行雜交捕獲目標(biāo)區(qū)域，最后將捕獲的產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，捕獲的不同樣品的目標(biāo)區(qū)域后續(xù)分析時通過建庫時加上的index標(biāo)記進(jìn)行區(qū)分。一種具體的實施方法，將本發(fā)明獲得的腫瘤相關(guān)的熱點突變基因捕獲文庫與含有待捕獲的靶標(biāo)基因組區(qū)域DNA片段雜交，捕獲目標(biāo)區(qū)域DNA片段，通過測序完成對腫瘤相關(guān)的熱點突變基因的檢測。具體實施方式下面將結(jié)合實施例對本發(fā)明的實施方案進(jìn)行詳細(xì)的描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會理解，在本發(fā)明各實施方式中，為了使讀者更好地理解本申請而提出了許多技術(shù)細(xì)節(jié)。但是，即使沒有這些技術(shù)細(xì)節(jié)，也可以實現(xiàn)本申請各權(quán)利要求保護(hù)的技術(shù)方案。實施例1具體而言，將本發(fā)明根據(jù)現(xiàn)有的或已獲得的腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因信息為基礎(chǔ)，構(gòu)建了針對腫瘤相關(guān)50個熱點突變基因207個高突變區(qū)域的檢測試劑盒，試劑盒首先將提取到的樣本DNA經(jīng)過超聲打斷成200-250bp的DNA片段(但不限于超聲波打斷法)，經(jīng)過末端修復(fù)、加“A”及連接過程將DNA片段連上index接頭，隨后利用構(gòu)建的捕獲文庫與含有待捕獲的靶標(biāo)基因區(qū)域DNA片段雜交，捕獲腫瘤相關(guān)熱點突變基因的DNA片段，對這些DNA片段進(jìn)行測序，經(jīng)過生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析后獲得樣本檢測結(jié)果。該技術(shù)方案包括從樣品基因組DNA到測序結(jié)果輸出的全部實驗流程，主要包括樣本采集、文庫構(gòu)建、雜交捕獲、測序及數(shù)據(jù)分析四方面內(nèi)容。1.樣本采集、運送保存本發(fā)明樣本采集使用無菌操作收集疾病樣本(原癌灶或癌旁組織)或正常血液樣本。樣本運送需在低溫條件下進(jìn)行，樣本需在低溫環(huán)境中運輸且需在24小時內(nèi)送達(dá)實驗室。采集的樣本在2-8℃條件下保存不超過72小時；-20℃條件保存不超過1個月；需長期保存的樣本需放于-80℃條件下保存。從樣品采集之日起一周之內(nèi)完成基因組DNA的提取。2.腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因捕獲文庫構(gòu)建用于基因捕獲的文庫DNA序列要具有較高的特異性，不受其他同源核酸序列的影響。本發(fā)明按照以下方式獲得腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因207個高突變區(qū)域的捕獲文庫，具體描述如下：i)本發(fā)明構(gòu)建的捕獲文庫包含目前已明確的與腫瘤密切相關(guān)的50個熱點突變基因(如表1)207個高突變區(qū)域(如表2)，這些基因被注釋為癌基因與抑癌基因，其與腫瘤的發(fā)病密切相關(guān)，具體基因名稱與染色體定位如下：表1捕獲文庫腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因信息表表2.207個高頻突變區(qū)域的坐標(biāo)信息如下ii)確定目標(biāo)基因并基于NCBI等數(shù)據(jù)庫獲得基因序列信息后，利用專業(yè)引物設(shè)計軟件Primer5設(shè)計出擴(kuò)增這些基因片段的特異性引物，共207對(如表3)。引物設(shè)計遵循以下原則：①引物核苷酸長度在20-35nt；②引物Tm值適中(50-65℃)，且無發(fā)卡等結(jié)構(gòu)；③利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的blast功能確定引物的高特異性。引物列表如下：表3針對50個熱點基因設(shè)計的207對引物列表iii)通過普通PCR方法擴(kuò)增每對引物后(此操作涉及將生物素標(biāo)記的dUTP摻入合成的DNA產(chǎn)物中，實驗證明擴(kuò)增體系中dUTP:dTTP＝1：3時，擴(kuò)增帶有生物素標(biāo)記的PCR產(chǎn)物效率最高)，產(chǎn)物進(jìn)行柱純化(參照TIANGENUniversalDNAPurificationKit)得到純化后的含有目標(biāo)基因的DNA片段，然后對207個PCR產(chǎn)物進(jìn)行Qubit定量，根據(jù)定量結(jié)果將207個產(chǎn)物進(jìn)行等量混合(將PCR產(chǎn)物統(tǒng)一稀釋至25ng/uL，后每個取2uL混合)。所述的PCR擴(kuò)增體系如下：共25uLPCR擴(kuò)增條件如下：95℃、5min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，35個循環(huán)；72℃、10min；4℃、∞隨后利用超聲打斷儀CovairsS220將目的DNA片段打斷至70-130bp。通過表面帶有鏈霉親和素標(biāo)記的磁珠(invitrogenMyOneTMStreptavidinT1)來分離純化帶有生物素標(biāo)記的目標(biāo)DNA片斷，最后利用0.1％SDS溶液在100℃金屬浴10分鐘的條件下將含有目標(biāo)基因的DNA片段洗脫下來，得到帶有生物素標(biāo)記的捕獲文庫。本發(fā)明利用等量混合多對PCR產(chǎn)物的方法，使得每對引物對應(yīng)的PCR產(chǎn)物能夠均一的存在構(gòu)建的捕獲文庫中，這為后續(xù)的測序提高了效率，提高了測序的有效數(shù)據(jù)量、均一性和覆蓋度。3.樣本基因組DNA提取及文庫制備樣本基因組DNA的提取方法參照Qiagen公司的QIAampDNABloodMiniKit試劑盒，分別提取了編號為S19、S20、S23三個人全血基因組樣本。將得到的高質(zhì)量基因組DNA樣本片段化成200-250bp的DNA片段，隨后經(jīng)過末端修復(fù)、加“A”及連接等過程，將DNA片段連上index接頭(相關(guān)試劑來自KAPAHyperPrepKitIlluminaplatforms)，經(jīng)過PCR擴(kuò)增純化后得到樣本DNA文庫。4.目標(biāo)序列的雜交捕獲、洗脫與富集i)樣品準(zhǔn)備：將上述獲得的S19、S20、S23三個樣本DNA文庫等量混合，總量1ug，隨后將COTDNA樣本DNA文庫與封閉引物按照如下比例混合。其中COTDNA作為基因組中重復(fù)率較高的一部分DNA片段，在雜交時有助于提高雜交效率。將上述混合好的樣本在真空濃縮儀中60℃蒸干，用于后續(xù)雜交。ii)文庫雜交與序列捕獲：向上述混合好的樣本中加入10.5uL雜交緩沖液和4.5uL雜交捕獲探針文庫，體系如下，渦旋30s充分溶解混勻后全速離心30s。將上述反應(yīng)體系放入熱循環(huán)儀運行下列程序：步驟溫度時間變性95℃10min雜交47℃(熱蓋溫度57℃)64-72h將上述封閉后的樣本在熱循環(huán)儀中47℃保持，向反應(yīng)管中加入4.5uL制備好的雜交捕獲探針文庫?；靹蚝笤跓嵫h(huán)儀上47℃進(jìn)行雜交，反應(yīng)64-72小時。雜交反應(yīng)后，將15uL樣品轉(zhuǎn)移至事先經(jīng)過1×BeadWash緩沖液洗滌重懸的100uL鏈霉親和素標(biāo)記磁珠中，混勻后于47℃孵育45min，每隔15分鐘吹打混勻一次，讓捕獲的片段與磁珠結(jié)合，特異吸附目標(biāo)片段，將雜交到的片段抓取出來。iii)洗脫與富集：樣品的洗脫按照如下洗脫液依次進(jìn)行：①孵育45min后，快速離心反應(yīng)管，利用磁力架分離磁珠與緩沖液并去除上清液。②向反應(yīng)管中加入200uL的1×Wash緩沖液I(1×SSC,0.1％SDS)，吹打10次重懸磁珠，后于渦旋混合儀上渦旋8s，將反應(yīng)管放于磁力架上，待液體澄清后小心棄上清。③向反應(yīng)管中加入200uL47℃預(yù)熱1×Wash緩沖液II(0.1×SSC,0.1％SDS)，緩慢吹打10次重懸磁珠，47℃溫浴10min后，將反應(yīng)管放于磁力架上，待液體澄清后小心棄上清。④重復(fù)③步驟3次。最后確保Wash緩沖液II去除干凈。⑤將反應(yīng)管從磁力架上去下，向管內(nèi)加入50uL的PCR級別用水重懸磁珠。洗脫后磁珠帶著捕獲的目標(biāo)DNA片段，進(jìn)入樣本的LM-PCR富集。LM-PCR反應(yīng)體系如下(一個捕獲樣本做兩管PCR反應(yīng))：PCR反應(yīng)條件為：98℃預(yù)變性45s；98℃變性15s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共14個循環(huán)；72℃延伸1min；4℃保溫。反應(yīng)后，利用純化磁珠AMPurebeads純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到捕獲后的樣本文庫，質(zhì)檢后用于測序分析。5.文庫質(zhì)檢本發(fā)明的文庫質(zhì)檢包括三方面，一是文庫片段大小質(zhì)檢，二是目標(biāo)基因的富集度測定，三是文庫定量檢測。這三項指標(biāo)是檢測文庫構(gòu)建成功與否的必要步驟，更是測序獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)的必要保證。6.高通量測序與數(shù)據(jù)分析本發(fā)明采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的二代測序平臺進(jìn)行高通量測序，將捕獲的序列在Illumina測序平臺采用邊合成邊測序的方法進(jìn)行序列測定(測序試劑均購自Illumina商業(yè)測序試劑盒)，對得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析可知其上的標(biāo)簽序列，根據(jù)標(biāo)簽序列確定其對應(yīng)的樣本DNA來源。二代測序具有高通量的特點，為這一技術(shù)應(yīng)用提供了快速高效的便利條件。本發(fā)明利用二代測序手段對上面方法獲得的測序文庫進(jìn)行了測序并且獲得了測序數(shù)據(jù)，有關(guān)分析結(jié)果如下：表3測序后數(shù)據(jù)分析結(jié)果液相雜交捕獲方法對腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因測序的結(jié)果總結(jié)：在液相雜交體系中對約51kb大小的基因組區(qū)域進(jìn)行序列捕獲，結(jié)果顯示，所有樣本均取得了良好的測序捕獲效果，平均測序深度都在5000X以上，且各位點均一性較好，覆蓋率在99％以上，突變位點檢出率在96％以上。結(jié)果顯示該方法能有效的對50個熱點突變基因進(jìn)行測序檢測，數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，檢測結(jié)果可信。本發(fā)明是針對腫瘤相關(guān)的50個熱點突變基因進(jìn)行的基因檢測，研究表明，這50個熱點突變基因與癌癥的發(fā)生有著密切聯(lián)系，對臨床上早期發(fā)現(xiàn)癌癥預(yù)防癌癥有著重大意義，同時本發(fā)明可應(yīng)用于癌癥的風(fēng)險評估。下面根據(jù)三個具體檢測結(jié)果進(jìn)行具體說明。針對樣本S19的檢測結(jié)果如表4。表4樣本S19檢測分析結(jié)果針對樣本S19的檢測結(jié)果如表5。表5樣本S20檢測分析結(jié)果針對樣本S23的檢測結(jié)果如表6。表6樣本S23檢測分析結(jié)果針對本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解，上述各實施方式是實現(xiàn)本發(fā)明的具體實施實施例，而在實際操作中可在操作細(xì)節(jié)上作出適當(dāng)改變，而不偏離發(fā)明的精神和范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3