本發(fā)明涉及分子生物學領域，特別地，涉及一種用于制備針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體的方法。

背景技術：

胱天蛋白酶(caspases)是存在于多細胞生物中的一類保守的天冬氨酸專一性半胱氨酸蛋白酶。胱天蛋白酶作為細胞凋亡的中樞效應器，在細胞凋亡的啟動及進程中發(fā)揮著關鍵的作用。胱天蛋白酶家族成員通過對凋亡信號的募集、傳遞和執(zhí)行，完成胱天蛋白酶成員之間的級聯(lián)反應，推動細胞凋亡進程。胱天蛋白酶家族根據(jù)生理功能分為炎癥和凋亡胱天蛋白酶兩個亞家族。凋亡胱天蛋白酶又可以分為起始(initiator caspases)和執(zhí)行胱天蛋白酶(effector caspases)。在細胞凋亡啟動時，起始胱天蛋白酶的激活是細胞選擇凋亡或生存的一個關鍵點，使其成為人類增生性和退化性疾病治療的一個重要靶標。執(zhí)行胱天蛋白酶進行選擇性的有順序的一系列蛋白切割反應，推進細胞凋亡過程。因此，胱天蛋白酶系作為細胞凋亡的中樞效應器，在細胞凋亡的啟動及進程中發(fā)揮著關鍵的作用。

正常情況下，胱天蛋白酶在體內(nèi)均以無活性的酶原形式存在于胞質(zhì)溶膠中。胱天蛋白酶酶原分子由一個大亞基(p20)，小亞基(p10)和N端前域組成。胱天蛋白酶酶原的N端前域比較長，并且其中包含募集域(caspase-recruiment domains,CARDs)或死亡效應域(death effector domains，DEDs)。酶原分子激活后，N端前域和大小亞基都被切割分離，分離的大小亞基之間形成異二聚體，兩個異二聚體形成一個四聚體，即成熟的胱天蛋白酶。在成熟的胱天蛋白酶中，大亞基處于外周，小亞基處于內(nèi)部，并且構成四聚體的兩個異二聚體各自具有一個活性中心。

本課題組鑒定了甜菜夜蛾caspase-5的編碼基因，其全長序列為1659bp，其中5’UTR和3’UTR分別為134bp和160bp，并且甜菜夜蛾caspase-5的5’UTR中第一個堿基是G，據(jù)推測有可能是轉(zhuǎn)錄起始位點；編碼區(qū)中開放閱讀框(Open Reading Frame，ORF)長度為1365bp，編碼455個氨基酸。在結(jié)構上包含一個長的N端前域，其中包含有募集結(jié)構域(CARD)；大亞基和小亞基。氨基酸序列比較分析表明，甜菜夜蛾caspase-5氨基酸序列與鱗翅目昆蟲斜紋夜蛾，棉鈴蟲及家蠶caspase-5的同源性為60.72％。

為了研究甜菜夜蛾caspase-5執(zhí)行其生物學功能過程中的作用機制，必須制備甜菜夜蛾caspase-5抗體，尤其是其大亞基的抗體來特異性地檢測甜菜夜蛾caspase-5及其大亞基。

然而，目前本領域中，尚未能制備出甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體。而且在鱗翅目昆蟲中，目前只是有推測的N端以及大小亞基的斷裂位點，并沒有實際的實驗證明。Caspase-5作為起始胱天蛋白酶，通過募集凋亡信號并切割活化執(zhí)行胱天蛋白酶。而這些功能在昆蟲也沒有直接的證據(jù)證明。甜菜夜蛾caspase-5的蛋白結(jié)構抗原性比較弱，并不是隨便選取一段肽段就能得到針對甜菜夜蛾caspase-5尤其是其大亞基的抗體。發(fā)明人曾試著選取了全長的caspase-5作為免疫原來制作抗體，結(jié)果免疫兔子的過程中發(fā)現(xiàn)兔子無法耐受，發(fā)明人又曾多次選取一些區(qū)段的肽段作為抗原來作為抗體，結(jié)果也未得需要的抗體。例如，參見圖4，發(fā)明人選取部分N端前域和大部分大亞基序列(85-346aa)作為免疫原來免疫兔子，所得的血清只能檢測到caspase-5全酶，但是檢測不到caspase-5大亞基。

因此，需要一種針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體，以及用于制備該抗體的多肽。

技術實現(xiàn)要素：

為解決以上技術問題，已經(jīng)進行的多次實驗推論，猜測N端前域有可能對caspase-1分子的折疊或加工有影響，部分N端前域的缺失導致所表達的多肽的部分區(qū)段尤其是大亞基區(qū)段不能正確折疊或加工，因此可能導致所得到的多肽不含大亞基區(qū)段的大部分或全部抗原位點。因此，發(fā)明人試著選取包括全部N端前域和部分大亞基序列(1-200aa，SEQ ID NO:1)作為免疫原來制備針對甜菜夜蛾caspase-1大亞基的抗體，出人意料的是，由此制備的抗體確實能夠識別甜菜夜蛾caspase-1大亞基。

基于此，本發(fā)明提供了一種用于制備針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體的方法，包括以下步驟：使用氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的多肽作為抗原免疫動物后，收集所述動物的血清，然后從所述血清中純化得到所述針對甜菜夜蛾caspase-1大亞基的抗體。

進一步地，所述多肽通過表達序列如SEQ ID NO:2所示的基因得到。

進一步地，所述動物為兔子。

進一步地，所述多肽通過以下方法來得到：將所述基因插入至pET16b質(zhì)粒載體中，然后將攜帶所述基因的pET16b載體轉(zhuǎn)入原核表達宿主中進行表達。

進一步地，所述方法包括以下步驟：

1)從甜菜夜蛾組織中提取總RNA，將所述總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；；

2)以所述cDNA為模板，用SEQ ID NO:3所示的引物-1和SEQ ID NO:4所示的引物-2進行PCR擴增得到序列如SEQ ID NO:2所示的DNA片段；

3)將所述DNA片段插入到質(zhì)粒pET16b的內(nèi)切酶位點BamH I和Xho I之間，形成重組質(zhì)粒，并用所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主中，誘導轉(zhuǎn)化有所述重組質(zhì)粒的表達宿主表達序列如SEQ ID NO:1所示的多肽；

4)用所述多肽作為抗原免疫兔子，并在第一次免疫后第2周和第6周加強免疫，最后一次免疫2周后收集被免疫的兔子的血清，即得到包含針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體的血清；

5)使用親和層析的方法對所述血清進行純化，得到所述針對甜菜夜蛾caspase-1大亞基的抗體。

本發(fā)明還提供了一種針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體，其由上述方法制備得到。

本發(fā)明還提供了一種用于檢測甜菜夜蛾caspase-5大亞基的方法，包括使用上述抗體檢測樣品中是否存在甜菜夜蛾caspase-5大亞基。

進一步地，所述檢測通過蛋白免疫印跡、免疫熒光染色或免疫組化染色進行。

經(jīng)過Western-blot試驗，發(fā)現(xiàn)該多克隆抗體能夠檢測到喜樹堿及羥基喜樹堿誘導的甜菜夜蛾細胞凋亡過程中，caspase-5的活化，即大亞基的形成。本抗體的成功制備以及應用，為首次檢測到昆蟲細胞凋亡過程中caspase-5蛋白的活化，即大小亞基斷裂。對研究昆蟲caspase基因家族的毒理學意義及以caspase為靶標的新殺蟲劑的開發(fā)都具有重要意義。

附圖說明

圖1為caspase-5基因片段的PCR結(jié)果電泳照片；

圖2為caspase-5片段的SDS-PAGE電泳照片；

圖3為本發(fā)明的抗體檢測caspase-5全酶和大亞基的蛋白免疫印跡照片；

圖4為使用85-346aa的免疫兔子得到的血清進行蛋白免疫印跡照片。。

具體實施方式

以下結(jié)合實例和附圖對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.甜菜夜蛾Caspase-5基因片段的克隆和表達

1.1總RNA提取

采用QIAGEN公司RNA提取試劑盒(Mini Kit)與反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT Kit)，根據(jù)說明書指示操作。

(1)用配制好的0.1％DEPC水浸泡各類槍頭與離心管，于37℃下過夜處理，第二天將處理好的用具在121℃高壓滅菌30min，室溫保存，為RNA提取做好準備；

(2)裂解細胞，釋放RNA：將傳代3日后的IOZCAS-Spex-II細胞培養(yǎng)液4.5mL置于2mL小管中，若細胞數(shù)小于5×10⁶個，取350μL buffer RLT裂解，若細胞數(shù)小于1×10⁷個，取600μL buffer RLT裂解，在渦旋器上渦旋30s，加入1體積的70％的乙醇，攪拌混勻；

(3)轉(zhuǎn)柱富集RNA：將細胞裂解液轉(zhuǎn)到RNeasy mini柱中，于10,000×g轉(zhuǎn)速下離心15s，棄去流動相，RNA被固定于膜上；

(4)加入700μL buffer RWL到RNeasy mini柱中，于10,000×g轉(zhuǎn)速下離心15s，棄去流動相；

(5)加入500μL buffer RPE到RNeasy mini柱中，于10,000×g轉(zhuǎn)速下離心15s，棄去流動相；

(6)加入500μL buffer RPE到RNeasy mini柱中，于10,000×g轉(zhuǎn)速下離心2min，棄去流動相，然后繼續(xù)空管全速離心1min抽去過多液體；

(7)將RNeasy mini柱轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，垂直于微膜加入20μL無RNAase的滅菌DEPC水，于10,000×g轉(zhuǎn)速下離心1min，所收集到的流體即RNA原液，同時取2μL原液于1.0％瓊脂糖凝膠中電泳中檢測RNA完整性，最終將原液保存于-80℃中，為轉(zhuǎn)錄工作做準備。

1.2采用QIAGEN公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT Kit)，根據(jù)說明書指示操作，反轉(zhuǎn)錄出cDNA。

1.3目的片段的擴增

以上述cDNA為模板，用引物-1：atcggatccATGCAGAGAGAACACAGAGAAGC(SEQ ID NO:3)和引物-2：agcctcgagttaGTACGTGAAGTCGAGCAAGAT(SEQ ID N0：4)進行PCR擴增反應，擴增體系如下：

PCR儀按照如下程序進行：94℃預變性5min，94℃變性30s，56℃退火溫度30s，72℃延伸30s，共進行30個循環(huán)，最后72℃延伸10min后終止反應。

如圖1所示，擴增后得到擴增甜菜夜蛾Caspase-5基因中1-600nt的片段(SEQ ID N0：2)，并且兩端帶有BamH I和Xho I酶切位點。

通過瓊脂糖電泳和DNA純化提取試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)純化擴增得到的DNA片段。

1.4目的片段插入質(zhì)粒PET16b多克隆位點

BamH I和Xho I酶切條件不同，有必要單獨分開連接，因此其各自酶的反應體系如下：

質(zhì)粒pET16b和目標序列在30℃條件下進行BamH I單酶切1小時，酶切后的DNA還要經(jīng)過如下步驟沉淀分離：加入2μL 3M CH₃COONa(pH5.2)和2倍原體積的冰冷無水乙醇，均勻混合后在-20℃下靜置30min，然后在10,000rpm轉(zhuǎn)速下離心5min回收沉淀，用70％乙醇清洗沉淀，離心后干燥獲得單酶切后的DNA片段，用于下一步單酶切。酶切體系如下：

BamH I酶切體系

XhoI酶切體系

BamH I酶切后的質(zhì)粒pET16b和目標序列在37℃條件下進行Xho I單酶切1小時，酶切后的產(chǎn)物要經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳，檢測是否發(fā)生完整酶切，然后經(jīng)2％瓊脂糖凝膠電泳分離純化。

將分別酶切后的質(zhì)粒和目的片段在T4DNA連接酶的作用下連接，4℃靜置過夜，形成重組質(zhì)粒，連接反應體系如下：

連接產(chǎn)物用于轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，37℃培養(yǎng)過夜，經(jīng)藍白斑篩選，挑取陽性克隆，小量制備質(zhì)粒，用PCR擴增，限制性酶切和測序鑒定正確后，將得到重組質(zhì)粒用于接下來的操作。

1.5甜菜夜蛾caspase-5蛋白的1-200aa片段(SEQ ID NO:1)的表達和純化

通過以下方法表達該多肽片段：

1)用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達宿主BL21(DE3)，通過酶切檢測正確后將攜帶重組質(zhì)粒的BL21(DE3)接種至液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)過夜；

2)將上述培養(yǎng)得到的菌液按照1:50的比例轉(zhuǎn)接入20mL新鮮的氨芐抗性LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對數(shù)中期；

3)加入終濃度為0.1mM的IPTG(設置1管對照，不加入IPTG)誘導表達，于室溫繼續(xù)振蕩培養(yǎng)；

4)分別于誘導后1hr和3hr收集1mL菌液，12000rpm離心1min收集菌體沉淀；

5)用12％聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳分析表達結(jié)果。

SDS-PAGE電泳結(jié)果(圖2)顯示，得到了40KD左右的目標多肽，然后進行大體系表達。收集經(jīng)誘導的菌體后，超聲破碎菌體，并過鎳柱純化，得到純化的目標多肽。

2.針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體的制備

通過免疫兔子來得到針對甜菜夜蛾caspase-5大亞基的抗體，方法如下：

1)取1mg各組免疫原溶解在500μl PBS緩沖中，與等量弗氏完全佐劑徹底混合，乳化可以在用多聚乙烯管連接的兩個一次性注射器之間進行，當乳化完成時，一滴乳化液在水面上呈現(xiàn)球形；

2)選擇6只13周齡雄性新西蘭大白兔，免疫前采血0.5mL作為樣本對照，首次免疫混合弗氏完全佐劑(1:1,v/v)，在0.5mL弗氏完全佐劑中加入0.5mL抗原溶液，用2mL注射器抽拉該乳化液，排除注射器中的氣泡；

3)每只兔子的免疫體積為1mL。免疫方式為后頸部皮下注射。免疫后第2周和第6周用不完全弗氏佐劑(IFA)進行加強免疫，免疫劑量相同，最后一次免疫2周后收集血，37℃1hr,然后3500rpm收集血清，收集血清，分裝并-80℃保存。對最后一次血清進行蛋白免疫印跡檢測。

得到的血清可通過蛋白-Sepharose 4B親和層析進行純化。

3.樣品中甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亞基的檢測

使用蛋白免疫印跡的方法來檢測樣品中甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亞基，方法如下：

1)SDS-PAGE電泳：取10μl蛋白樣品(0.01ng/孔)與2×SDS上樣緩沖液，沸水煮樣品5min，將樣品小心注入12％SDS-PAGE凝膠上樣孔，80伏電壓跑濃縮膠，待溴酚藍進入分離膠后將電壓調(diào)為100伏；

2)轉(zhuǎn)膜：待溴酚藍跑到凝膠底部時，結(jié)束電泳，按照濾紙、膠、硝酸纖維素膜、濾紙的順序放到夾子上(注意之間不要存在氣泡，膜靠近正極)，80mA恒流轉(zhuǎn)膜60min，用麗春紅染色看蛋白轉(zhuǎn)移效果；

3)封閉：封閉液(含5％脫脂奶粉的TBST)室溫輕搖封閉3h。

4)一抗結(jié)合：用封閉液按一定比例稀釋一抗，將膜和稀釋后的抗體封閉在封口膜中，4℃過夜，TBST振蕩洗膜5次，每次3min；

5)二抗結(jié)合：用封閉液按一定比例稀釋二抗(辣根過氧化物酶偶聯(lián)的IgG)，室溫輕搖1h，TBST振蕩洗膜5次，每次3min；

6)顯影：將化學發(fā)光底物涂在膜上顯色4min，壓片、曝光、顯影、定影。

結(jié)果(圖3)顯示，該抗體可特異地檢測出甜菜夜蛾caspase-5全酶及其大亞基。圖中第2和7泳道為未處理的樣品，免疫印跡大小為約52kDa，第3和8泳道為DMSO分別處理24小時和48小時的陰性對照樣品，免疫印跡大小為約52kDa，與甜菜夜蛾Caspase-5蛋白的理論分子量大小一致，第4、5、9、10泳道為分別用喜樹堿和羥基喜樹堿處理24小時和48小時的樣品，檢測到Caspase-5斷裂形成大亞基，約36kDa(箭頭標示)。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。