本發(fā)明涉及發(fā)酵法生產(chǎn)有機(jī)酸的技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法。

背景技術(shù)：

L-精氨酸-α-酮戊二酸鹽(L-arginine-α-ketoglutarate，AAKG)，簡稱精酮合劑，是由L-L-精氨酸(L-Arg)與α-酮戊二酸(α-KG)絡(luò)合形成的氨基酸鹽，可以從溶液中以鹽的形式結(jié)晶析出。在不同的結(jié)晶條件下，AAKG可以形成單精氨酸酮戊二酸鹽(MAAKG)和雙精氨酸酮戊二酸鹽(DAAKG)兩種形式，目前研究和應(yīng)用較多的主要是MAAKG，其晶型為無色棱柱狀，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于丙酮、乙醚等，在水溶液中能夠完全解離為L-精氨酸和α-酮戊二酸。本文研究的AAKG均指MAAKG，其結(jié)構(gòu)式如下：

AAKG不僅兼具L-精氨酸和α-酮戊二酸的生理功能，而且可以作為功能性營養(yǎng)強(qiáng)化劑和護(hù)肝藥物應(yīng)用于臨床。α-酮戊二酸能直接快速推動(dòng)人體內(nèi)檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán))，產(chǎn)生更大量的細(xì)胞能量(ATP)來供給受損的肝細(xì)胞使肝細(xì)胞保持正常功能，從而使肝臟能得以正常健康的運(yùn)轉(zhuǎn)；同時(shí)L-精氨酸直接快速加入U(xiǎn)rea cycle(尿素循環(huán))，使血液中的氨毒由轉(zhuǎn)氨及去氨雙重作用來去除肝臟疾病所引起的高血氨癥，使肝臟恢復(fù)正常功能及健康。另外，AAKG還可用于增強(qiáng)體格、促進(jìn)肌肉的快速增長和創(chuàng)傷恢復(fù)，促進(jìn)肝細(xì)胞對營養(yǎng)和能量的代謝，增強(qiáng)力量和精力，其生理機(jī)制在于AAKG能夠在短期內(nèi)提高體內(nèi)NO的水平，增強(qiáng)蛋白質(zhì)同化作用。目前，AAKG作為功能食品在國際市場上銷量日益增加，并與鳥苷酸酮戊二酸鹽(OKG)一起，在醫(yī)學(xué)、營養(yǎng)、運(yùn)動(dòng)領(lǐng)域備受重視。

目前AAKG的制備工藝主要有三種方式：直接混合法、凍干法和結(jié)晶法。

直接混合法是將等摩爾的L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末進(jìn)行簡單的混合而成，其制備方法簡單，成本較低，是商品化生產(chǎn)最為通用的方法。但該法生產(chǎn)的AAKG不是結(jié)晶型產(chǎn)品，二者之間沒有鹽鍵結(jié)合，產(chǎn)品質(zhì)量受到原料的品質(zhì)、混合的均勻度影響。

凍干法是將L-精氨酸、α-酮戊二酸粉末進(jìn)行等摩爾混合并溶解，再將溶液冷凍干燥成為凍干粉，該工藝能夠得到相對穩(wěn)定的結(jié)晶型AAKG，但存在晶型不可控、凍干過程能耗大等問題，一般僅適合AAKG注射劑生產(chǎn)。

結(jié)晶法是將L-精氨酸、α-酮戊二酸按等摩爾比例混溶后，通過溶液濃縮或者加入有機(jī)溶劑、降低溫度等方法，使AAKG以晶體形式析出，其產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控。相比而言，混合法和凍干法，在制備過程中不能夠去除原料帶入的雜質(zhì)，對原料品質(zhì)有著較高的要求，而結(jié)晶工藝是一個(gè)能有效去除雜質(zhì)的精制過程，因而能夠使用純度相對較低的原料，甚至是低濃度的發(fā)酵液。

中國專利CN 102531968A中涉及到提取精酮合劑工藝中的α-酮戊二酸來源是通過2,2-二氯戊二酸二甲酯反應(yīng)獲得，其合成路線較長，使用了大量的有機(jī)溶劑，對人體的毒害較大，不適宜用作食品和藥用產(chǎn)品原料；中國專利CN 102020593A中涉及到提取工藝中的α-酮戊二酸是通過微生物發(fā)酵獲得的，其發(fā)酵液副產(chǎn)物成分復(fù)雜(尤其是代謝過程中的有機(jī)酸的積累)，對后期提取造成一定的干擾。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是：

一種L-精氨酸-Α-酮戊二酸(精酮合劑)的制備方法，步驟如下：

(1)制備α-酮戊二酸溶液：采用大腸桿菌BL21(DE3)(Escherichia coli)表達(dá)谷氨酸氧化酶，以L-谷氨酸為底物，通過酶轉(zhuǎn)化法得到α-酮戊二酸酶轉(zhuǎn)化液，酶轉(zhuǎn)化液通過微濾、超濾、離子交換除雜后獲得α-酮戊二酸溶液；

(2)制備L-精氨酸溶液：利用谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)發(fā)酵L-精氨酸，獲得L-精氨酸發(fā)酵液，通過微濾、超濾、離子交換、脫氨后獲得L-精氨酸溶液；

(3)混合結(jié)晶：將α-酮戊二酸溶液與L-精氨酸溶液按照等摩爾比進(jìn)行混合，調(diào)至pH為4.0±0.5，脫色后進(jìn)行減壓濃縮、噴霧干燥，即得。

上述精氨酸生產(chǎn)菌谷氨酸棒桿菌為常用生產(chǎn)菌株、大腸桿菌BL21(DE3)是市場通用菌種。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，具體步驟如下：

(1)將α-酮戊二酸酶轉(zhuǎn)化液和精氨酸發(fā)酵液經(jīng)活菌滅活，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0-4.5，進(jìn)入微濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行微濾，分別得到去除菌體的α-酮戊二酸微濾液和精氨酸微濾液；操作溫度為10-50℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差為0.05-0.1Mpa，過濾過程分多次加入純化水頂洗，直至溶液中α-酮戊二酸和精氨酸的含量低于2.0g/L后停機(jī)，獲得α-酮戊二酸微濾液和精氨酸微濾液；

(2)將步驟(1)所得澄清的α-酮戊二酸微濾液和精氨酸微濾液分別泵入超濾膜過濾器，過濾除蛋白，其操作條件為pH 2-12、溫度10-50℃，操作壓力差(進(jìn)膜壓力與出膜壓力差)為0.05-0.1MPa，得到α-酮戊二酸超濾液和精氨酸超濾液；

(3)將步驟(2)所得α-酮戊二酸超濾液上732陽離子交換樹脂(吸附鈉離子、谷氨酸陽離子等雜質(zhì))，收集pH小于2.0的α-酮戊二酸流出液；精氨酸過濾液上732陽離子交換樹脂吸附，待吸附飽和后用去離子水反洗，之后采用3-8％的氨水洗脫，收集pH為9-11的精氨酸高流分洗脫液，洗脫液經(jīng)過脫氨后獲得L-精氨酸溶液；

(4)將步驟(3)所得α-酮戊二酸流出液和L-精氨酸溶液按照摩爾比1：1的比例進(jìn)行混合，調(diào)至pH為4.0±0.5，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合液；

(5)向步驟(4)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合液中加入1.5-2.0％的活性炭脫色，溫度60℃，攪拌脫色25min，過濾得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脫色液；

(6)將步驟(5)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合脫色液進(jìn)行減壓濃縮至原體積液的12-18％，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合濃縮液；

(7)將步驟(6)所得精氨酸-α-酮戊二酸混合濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，即得目標(biāo)產(chǎn)物(是一種L-精氨酸-α-酮戊二酸合劑粉末)。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，所述微濾膜分離系統(tǒng)采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，微濾膜孔徑為0.1um。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，所述超濾膜過濾器采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，截留分子量為6000。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，所述微濾膜分離系統(tǒng)為中空纖維膜分離系統(tǒng)，微濾膜孔徑為0.1um。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，所述超濾膜過濾器采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，截留分子量為6000。

優(yōu)選的，上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，所述精氨酸-α-酮戊二酸混合液經(jīng)活性炭脫色后溶液透光率大于90％。

本發(fā)明結(jié)構(gòu)有如下有益效果：

上述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，具有如下技術(shù)效果：

(1)采用通過酶轉(zhuǎn)化L-谷氨酸得到α-酮戊二酸酶轉(zhuǎn)化液，同時(shí)采用L-精氨酸生產(chǎn)菌發(fā)酵得到L-精氨酸發(fā)酵液，通過對酶轉(zhuǎn)化液和發(fā)酵液進(jìn)行微濾、超濾、離子交換、脫氨脫色等處理，將二者等摩爾比例混合后進(jìn)行脫色、減壓濃縮、噴霧干燥等單元操作；并采用微濾和超濾雙膜過濾菌體蛋白，去除菌體蛋白效果較好，過濾液澄清透明；

(2)采用陽離子交換工藝，高效去除難分離的谷氨酸等雜質(zhì)，得到的L-精氨酸-α-酮戊二酸經(jīng)高效液相色譜檢測分析其純度達(dá)98.0％以上。

附圖說明

圖1是本發(fā)明所述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的(精酮合劑)提取工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

為進(jìn)一步說明本發(fā)明，現(xiàn)配合附圖進(jìn)行詳細(xì)闡述：

實(shí)施例1

一種L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，具體步驟如下：

a、分別取α-酮戊二酸酶轉(zhuǎn)化液和L-精氨酸發(fā)酵液32.0L和18.1L(α-酮戊二酸和L-精氨酸含量分別為31.2g/L和65.8g/L)于80℃加熱10min以上，用鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.0，進(jìn)入微濾膜分離系統(tǒng)進(jìn)行微濾，分別得到去除菌體的α-酮戊二酸微濾液和L-精氨酸微濾液；所述微濾膜分離系統(tǒng)采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，微濾膜孔徑為0.1um，操作溫度為30℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差為0.05Mpa，過濾過程分多次加入純化水頂洗，直至溶液中α-酮戊二酸和L-精氨酸的含量低于2.0g/L后停機(jī)，獲得α-酮戊二酸微濾液和L-精氨酸微濾液。

b、將經(jīng)a步得到澄清的α-酮戊二酸微濾液和L-精氨酸微濾液泵入超濾膜過濾器，對過濾液進(jìn)行除蛋白和脫色處理，分別得到α-酮戊二酸超濾液和L-精氨酸超濾液；所述超濾膜過濾器采用中空纖維膜分離系統(tǒng)，截留分子量為6000，其操作條件為pH 4.0，操作溫度30℃，進(jìn)膜壓力與出膜壓力差為0.08MPa。

c、將b步獲得的α-酮戊二酸超濾液上732陽離子交換樹脂吸附鈉離子、谷氨酸陽離子等雜質(zhì)，收集pH小于2.0的α-酮戊二酸流出液；精氨酸過濾液上732陽離子交換樹脂吸附，待吸附飽和后用去離子水反洗，之后采用6％的氨水洗脫(可以為3-8％的任意濃度的氨水進(jìn)行洗脫)，收集pH為9-11的精氨酸高流分洗脫液，洗脫液經(jīng)過脫氨后獲得L-精氨酸溶液。

d、將c步獲得的α-酮戊二酸流出液和精氨酸溶液分別按照摩爾比1：1的比例混合，pH為4.0，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合液；

e、將d步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合液加入1.8％的活性炭脫色，溫度60℃，攪拌脫色25min，過濾得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脫色液，透光率為97.5％(一般情況下，保證過濾得到精氨酸-α-酮戊二酸混合脫色液的透光率在97.0％以上即可)；

f、將d步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合脫色液進(jìn)行減壓濃縮至原體積液的17％，得到精氨酸-α-酮戊二酸混合濃縮液；

g、將f步中的精氨酸-α-酮戊二酸混合濃縮液進(jìn)行噴霧干燥，得到L-精氨酸-α-酮戊二酸合劑粉末。

h、將g步得到的L-精氨酸-α-酮戊二酸晶體，稱重1801.7g，計(jì)算收率為82.3％，純度為98.1％。

綜上，本發(fā)明所述L-精氨酸-Α-酮戊二酸的制備方法，利用發(fā)酵法生產(chǎn)L-精氨酸，酶轉(zhuǎn)化液和發(fā)酵液分別含有α-酮戊二酸和L-精氨酸，除此之外還有菌體、水溶性蛋白、色素、谷氨酸鈉鹽等，根據(jù)酶轉(zhuǎn)化液和發(fā)酵液的特點(diǎn)，首先通過雙膜即微濾膜、超濾膜分離系統(tǒng)錯(cuò)流過濾去除菌體、大部分蛋白和色素，膜過濾液依次通過陽離子交換柱除去雜質(zhì)，得到α-酮戊二酸和精氨酸高流分溶液，將兩者按照等摩爾比例混合后通過活性炭脫色、減壓濃縮、噴霧干燥得到純度98.0％的L-精氨酸-α-酮戊二酸晶體，收率達(dá)到82.0％以上。所述制備方法有效解決了現(xiàn)有生產(chǎn)工藝中存在的分離提取工藝復(fù)雜，收率低，產(chǎn)品純度低，大量制備成本高等問題，采用從α-酮戊二酸的酶轉(zhuǎn)化液中加入L-精氨酸發(fā)酵液生產(chǎn)L-精氨酸-α-酮戊二酸，具有生產(chǎn)周期短，副產(chǎn)物少，分離提取相對容易等優(yōu)點(diǎn)。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。