本發(fā)明涉及組織工程中的生物打印領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)胞球精準(zhǔn)定位生物打印裝置及方法。

背景技術(shù)：

現(xiàn)有的細(xì)胞片形成方法主要有溫敏培養(yǎng)皿、細(xì)胞包埋法、膠原凝膠法、磁力組織工程法、表面粗糙顆粒單分子層法和聚合電解質(zhì)等。各自的特性與技術(shù)缺陷說明如下：

溫敏培養(yǎng)皿法：在皿底壁涂抹溫度敏感性聚N-異丙基酰胺，當(dāng)溫度低于32℃時(shí)，細(xì)胞構(gòu)建親水性表面而獲得單層細(xì)胞膜片，此法培養(yǎng)過程操作復(fù)雜，特殊設(shè)備價(jià)格昂貴，要獲得完整細(xì)胞片并不容易。即使獲得了完整細(xì)胞片，所獲得的細(xì)胞片的力學(xué)性能差，不利于移植操作。

細(xì)胞包埋法：將細(xì)胞與富血小板血漿、纖維蛋白膠、膠原、明膠等天然生物材料混合，用物理刮取法獲得具有一定韌性厚的細(xì)胞片，這種方法的培養(yǎng)時(shí)間長，一般需10天至2周。另外，在生物材料內(nèi)培養(yǎng)的細(xì)胞片不利于上皮細(xì)胞通過氣-液培養(yǎng)獲得復(fù)層上皮細(xì)胞，也難以獲得成熟屏障細(xì)胞片的極性結(jié)構(gòu)。

酶消化法：用膠原蛋白作為細(xì)胞培養(yǎng)支架，用膠原蛋白酶消化分離得到細(xì)胞片，但酶消化過程對細(xì)胞會(huì)有損傷，使得細(xì)胞活性降低。另外，酶消化法不易控制，難以獲得較大成片的細(xì)胞片。

磁力組織工程法：將精氨酸、甘氨酸、天冬氨酸結(jié)合磁性陽離子脂質(zhì)體添加至由親水性、中性的共價(jià)水凝膠層組成的培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿表面。在培養(yǎng)板（皿）下面放置一塊磁鐵，細(xì)胞培養(yǎng)后，移去培養(yǎng)板（皿）底的磁鐵，此時(shí)的細(xì)胞片含有磁性納米粒子，可將磁鐵棒伸入培養(yǎng)孔收獲細(xì)胞片。此法細(xì)胞培養(yǎng)過程復(fù)雜，部分磁性物質(zhì)會(huì)殘留細(xì)胞片中，使得細(xì)胞活性降低。

表面粗糙顆粒單分子層法：將細(xì)胞移植到聚苯乙烯-丙烯酰胺單分子層上培養(yǎng)，輕輕吹打后細(xì)胞收縮分離得到細(xì)胞片，不需酶處理，但單分子層粗糙表面制作復(fù)雜，需要用到價(jià)格昂貴的特殊設(shè)備。

聚合電解質(zhì)法：在聚合電解質(zhì)精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-聚L-賴氨酸-聚乙二醇薄膜上培養(yǎng)細(xì)胞，待細(xì)胞增殖生長后，在電化學(xué)控制下解除細(xì)胞片黏附，這種方法操作復(fù)雜，同時(shí)需要用到特殊的材料和設(shè)備。

三維打印技術(shù)又稱為增材制造，根據(jù)零件或者物體的三維模型數(shù)據(jù)，快速準(zhǔn)確地制造零件或者物體實(shí)體模型。而隨著生物制造概念的提出，用組織工程方法進(jìn)行組織器官的修復(fù)和重建是當(dāng)前科學(xué)研究的熱點(diǎn)之一，其基本原理是將細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，附著于預(yù)先設(shè)計(jì)的生物支架，構(gòu)成細(xì)胞-支架復(fù)合體。生物支架主要使用快速成型技術(shù)制備，但目前使用快速成型技術(shù)制備生物支架出現(xiàn)很多難題，其中最大的難題是：難以將細(xì)胞或聚集的細(xì)胞精確定位于支架中，而細(xì)胞打印技術(shù)的出現(xiàn)可很好地解決這一問題。三維生物打印技術(shù)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，以計(jì)算機(jī)三維設(shè)計(jì)模型為基礎(chǔ)，通過控制軟件對細(xì)胞或者材料控制重組得到具有生物活性的人工組織器官、醫(yī)療輔具等醫(yī)學(xué)產(chǎn)品。

圣地亞哥的Invetech和Organovo兩家公司合作研制出一款生物打印機(jī)(NoveGen MMX Bioprinter^TM)，該技術(shù)特點(diǎn)是可利用計(jì)算機(jī)編程控制特制的生物”噴墨”打印機(jī)逐層打印，將特定細(xì)胞或細(xì)胞/基質(zhì)作為堆積對象進(jìn)行堆積成形，精確定位，并可最終用來制造三維器官。目前此項(xiàng)技術(shù)尚處于研究起始階段，被制造的三維結(jié)構(gòu)層與層之間的連接不可靠，難于成形具有三維高度要求的多層細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，且成形結(jié)構(gòu)的機(jī)械強(qiáng)度不高。

申請?zhí)枮?01510164921.6的中國發(fā)明專利文獻(xiàn)公開一種三維生物打印裝置和生物打印方法，三維生物打印裝置，包括打印平臺(tái)、噴頭、噴頭電控制器、兩個(gè)帶光源的CCD 光學(xué)系統(tǒng)、等離子除菌機(jī)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)控制系統(tǒng)、氣壓控制機(jī)構(gòu)、濕度調(diào)節(jié)器、溫度控制單元、儲(chǔ)液罐、可盛裝培養(yǎng)液的敞口容器、安裝架、外殼，該專利在一定程度上解決了現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，但是其結(jié)構(gòu)不適用于高活性、多種類細(xì)胞球的多層細(xì)胞片結(jié)構(gòu)的制造。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種細(xì)胞球精準(zhǔn)定位生物打印裝置，采用的技術(shù)方案如下：

一種細(xì)胞球精準(zhǔn)定位生物打印裝置，包括顯微成像系統(tǒng)、中央控制處理系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)、吸取打印平臺(tái)、三維控制系統(tǒng)、加注系統(tǒng)，三維控制系統(tǒng)由控制方位角的旋轉(zhuǎn)控制裝置、控制高度的高度調(diào)整裝置和控制徑向距離的徑向距離調(diào)整裝置組成，加注系統(tǒng)固定于三維控制系統(tǒng)的徑向距離調(diào)整裝置上，所述中央控制處理系統(tǒng)連接了吸取打印平臺(tái)、加注系統(tǒng)、三維控制系統(tǒng)、顯微成像系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)，所述顯微成像系統(tǒng)在工作時(shí)對準(zhǔn)加注系統(tǒng)在吸取打印平臺(tái)上面的投影位置，所述吸取打印平臺(tái)包括二維位移平臺(tái)、瓊脂糖固定裝置和培養(yǎng)皿固定裝置，所述培養(yǎng)皿固定裝置用于固定培養(yǎng)皿，所述瓊脂糖固定裝置用于固定瓊脂糖，所述瓊脂糖中培養(yǎng)有細(xì)胞球，此細(xì)胞球即為打印過程中所使用的生物墨水。

本發(fā)明對細(xì)胞球進(jìn)行打印，而不是細(xì)胞懸液，打印過程都能在顯微成像系統(tǒng)下觀察細(xì)胞球，極大的提高了細(xì)胞存活率，以及打印后材料的緊密連接性，并且適用于多種生物細(xì)胞的打印。

瓊脂糖和培養(yǎng)皿同時(shí)固定在二維位移平臺(tái)上，通過二維位移平臺(tái)精確控制瓊脂糖和培養(yǎng)皿的位置。三維控制系統(tǒng)用于調(diào)整加注系統(tǒng)的位置，加注系統(tǒng)在細(xì)胞打印過程中只通過高度調(diào)整裝置在較小的范圍內(nèi)調(diào)整高度，不做水平方向運(yùn)動(dòng)，始終位于顯微鏡工作范圍內(nèi)。

作為優(yōu)選，所述三維控制系統(tǒng)包括旋轉(zhuǎn)控制裝置、高度調(diào)整裝置和徑向距離調(diào)整裝置，所述三維控制系統(tǒng)采用圓柱坐標(biāo)系，所述旋轉(zhuǎn)控制裝置用于調(diào)整噴頭的相對方位角，所述的高度調(diào)整裝置用于調(diào)整噴頭的高度，所述徑向距離控制裝置用于調(diào)整噴頭的徑向距離。

在打印過程中，由于加注系統(tǒng)只在有限范圍內(nèi)做高度方向的運(yùn)動(dòng)，因此加注系統(tǒng)始終在顯微鏡的觀察范圍內(nèi)，也即細(xì)胞球始終在顯微鏡有效景深內(nèi)，采集卡能夠全程對細(xì)胞球成像并實(shí)時(shí)監(jiān)控細(xì)胞球狀態(tài)，一旦打印過程出現(xiàn)差錯(cuò)，控制處理系統(tǒng)會(huì)進(jìn)行智能糾錯(cuò)。

打印所使用的生物墨水為培養(yǎng)于瓊脂糖上的細(xì)胞球，打印所使用的細(xì)胞球，在打印前或者打印中都培養(yǎng)于瓊脂糖中，以便保持細(xì)胞活性。

作為優(yōu)選，所述加注系統(tǒng)包括噴頭、加注器、加注器控制器、以及加注器固定裝置，所述噴頭與加注器連接，所述加注器與加注器控制器連接，所述加注器固定裝置固定于三維控制系統(tǒng)的徑向距離調(diào)整裝置上。

作為優(yōu)選，所述顯微成像系統(tǒng)包括陣列LED照明裝置、顯微鏡和圖像采集卡。

顯微鏡可以選擇具有長工作距離以及大景深的顯微鏡。

作為優(yōu)選，所述加注器包括氣壓控制結(jié)構(gòu)，所述氣壓控制結(jié)構(gòu)包括空氣壓縮機(jī)和氣壓調(diào)節(jié)閥，由加注器控制器控制。

作為優(yōu)選，所述噴頭和備用噴頭采用透光性良好的透明材料制造，以便使得細(xì)胞球無論是在打印過程前位于瓊脂糖上、打印過程中位于噴頭內(nèi)還是打印過程后位于培養(yǎng)皿中都能通過顯微鏡成像并被中央控制處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測，以此來保證整個(gè)打印過程的順利進(jìn)行以及高質(zhì)量的打印效果。

采用上述生物打印裝置進(jìn)行生物打印的方法，包括以下步驟：

培育細(xì)胞球；

制備培養(yǎng)基；

固定瓊脂糖及培養(yǎng)皿；

輸入打印圖形信息和作為生物墨水的打印源細(xì)胞信息；

根據(jù)打印源細(xì)胞信息，中央控制處理系統(tǒng)自動(dòng)選擇最優(yōu)噴頭規(guī)格，中央處理控制系統(tǒng)通過三維控制系統(tǒng)控制加注器在噴頭更換平臺(tái)上選擇合適規(guī)格的噴頭，再通過三維控制系統(tǒng)控制噴頭到達(dá)工作位置；

初始化裝置：粗調(diào)顯微成像系統(tǒng)的位置以及角度，使得顯微鏡的工作位置為噴頭在吸取打印平臺(tái)上的投影位置；

粗調(diào)二維位移平臺(tái)，使得在顯微成像系統(tǒng)中可以觀測到噴頭對準(zhǔn)第一個(gè)細(xì)胞球；

精調(diào)顯微成像系統(tǒng)的位置以及角度及吸取打印平臺(tái)的位置，使得在顯微成像系統(tǒng)中可以同時(shí)清晰的觀測到細(xì)胞球以及噴頭，并且它們在同一個(gè)水平位置上；

打印開始，打印過程分為依次進(jìn)行的細(xì)胞球吸取過程、狀態(tài)切換過程和細(xì)胞球擠出過程：

細(xì)胞球吸取過程：高度調(diào)整裝置在等待高度時(shí)，中央控制處理系統(tǒng)通過加注器控制器使得加注器擠出噴頭內(nèi)部空氣，使噴頭內(nèi)形成負(fù)壓；中央控制處理系統(tǒng)控制高度調(diào)整裝置向下運(yùn)動(dòng)，連帶加注器還有噴頭移至吸取高度，此時(shí)中央控制處理系統(tǒng)通過加注器控制器控制加注器釋放噴頭內(nèi)壓力，使得噴頭將對準(zhǔn)的細(xì)胞球連同培養(yǎng)液一同吸取；中央控制處理系統(tǒng)控制高度調(diào)整裝置向上運(yùn)動(dòng)，使得加注器和噴頭移至等待高度；

狀態(tài)切換過程：細(xì)胞球吸取完成之后，中央控制處理系統(tǒng)控制吸取打印平臺(tái)上的二維位移平臺(tái)移至擠出坐標(biāo)位置，該過程中加注器和噴頭始終在等待位置等待；

細(xì)胞球擠出過程：當(dāng)二維位移平臺(tái)運(yùn)動(dòng)至擠出坐標(biāo)位置后，中央控制處理系統(tǒng)通過加注器控制器控制加注器將噴頭內(nèi)的細(xì)胞球以及培養(yǎng)液一同擠出至打印坐標(biāo)。

整個(gè)打印過程由細(xì)胞球吸取過程、狀態(tài)切換過程和細(xì)胞球打印過程組成。每完成一次細(xì)胞球吸取以及細(xì)胞球擠出后，中央控制處理系統(tǒng)根據(jù)打印完成狀態(tài)以及細(xì)胞球形態(tài)決定是否進(jìn)入下一個(gè)過程，并讀取下一個(gè)吸取細(xì)胞球的坐標(biāo)和打印坐標(biāo)，由于瓊脂糖上的細(xì)胞器是均勻規(guī)律排布的，每一個(gè)細(xì)胞球的坐標(biāo)都是已知的，而打印坐標(biāo)由控制處理系統(tǒng)全部計(jì)算出。

整個(gè)過程中，由于加注器以及噴頭始終在吸取位置、等待位置和擠出位置上工作，水平方向上沒有發(fā)生位置變化，因此吸取以及打印的細(xì)胞球始終在顯微成像系統(tǒng)的工作范圍內(nèi)，細(xì)胞球無論是在打印過程前位于瓊脂糖上、打印過程中位于噴頭內(nèi)還是打印過程后位于培養(yǎng)皿中都能通過顯微鏡成像并被中央控制處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測，以此來保證整個(gè)打印過程的順利進(jìn)行以及高質(zhì)量的打印效果。并由控制處理系統(tǒng)判斷該次細(xì)胞球打印過程是否順利，只有該次細(xì)胞球打印過程順利完成才會(huì)進(jìn)入下一個(gè)細(xì)胞球的打印過程，否則會(huì)放棄該細(xì)胞球，以此來保證細(xì)胞球在整個(gè)打印過程中始終有較高活性，保證整個(gè)打印過程的高質(zhì)量完成。

作為優(yōu)選，本發(fā)明的打印過程均在無菌環(huán)境下完成。

作為優(yōu)選，本發(fā)明采用以下方法培育作為生物墨水的細(xì)胞球：向高壓滅菌過的多孔橡膠模具中加入熱的1%-3% G-10瓊脂糖溶液,待其冷卻后折疊橡膠模具取出瓊脂糖并存放在培養(yǎng)皿中, 將密度為1×10⁶~10×10⁶的指定細(xì)胞加入到瓊脂糖中,并在培養(yǎng)皿周圍加入適量的培養(yǎng)基,置于37℃和5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天即可獲得裝有指定細(xì)胞球的瓊脂糖。

作為優(yōu)選，培養(yǎng)基采用高糖DMEM和10%的胎牛血清，另外培養(yǎng)上皮細(xì)胞系時(shí)再加入1%雙抗、1%非必需氨基酸和10 ng/mL上皮生長因子。

將培養(yǎng)有指定細(xì)胞球的瓊脂糖以及準(zhǔn)備好用于打印的培養(yǎng)皿分別安放在吸取打印平臺(tái)上的瓊脂糖固定裝置和培養(yǎng)皿固定裝置上。以此將載有打印細(xì)胞源的瓊脂糖和用于打印的培養(yǎng)皿準(zhǔn)確的固定在吸取打印平臺(tái)的預(yù)設(shè)坐標(biāo)上，中央控制處理系統(tǒng)通過控制吸取打印平臺(tái)上的二維位移平臺(tái)便可實(shí)現(xiàn)對瓊脂糖或者說打印源細(xì)胞球位置的精確控制。

作為優(yōu)選，培育細(xì)胞球時(shí)的參數(shù)如下：

培養(yǎng)時(shí)間：3天—5天；

培養(yǎng)溫度：37℃；

培養(yǎng)基的基本成分包括：HG DMEM,10%FBS、NEAA非必需氨基酸、Human EGF生長因子、P/S雙抗加入ROCK抑制劑：0.1uM—1uM；培養(yǎng)基也可以參照不同的細(xì)胞給予相應(yīng)的體細(xì)胞培養(yǎng)液以及干細(xì)胞培養(yǎng)液。

作為優(yōu)選，打印過程中的參數(shù)控制如下：

兩個(gè)細(xì)胞球的間距：0.3mm—1.5mm；

包裹細(xì)胞球的液滴的體積：3uL—8uL；

細(xì)胞球貼壁的時(shí)間：12小時(shí)—18小時(shí)；

細(xì)胞球展開至融合成片的時(shí)間：5天—8天。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將細(xì)胞球的間距、包裹細(xì)胞球的液滴的體積、細(xì)胞球貼壁時(shí)間和展開至融合成片的時(shí)間控制在上述范圍內(nèi)，細(xì)胞球打印形成細(xì)胞片效果最佳。

與現(xiàn)有的細(xì)胞打印方法相比較而言，本發(fā)明將一般的細(xì)胞懸液打印改為細(xì)胞球打印，細(xì)胞球相對于細(xì)胞而言具有更好的增殖能力、抗凋亡能力、抗衰老和細(xì)胞干性（例如β3-tubulin、Nestin等表達(dá)的上調(diào)）。與傳統(tǒng)平面培養(yǎng)的細(xì)胞相比，三維培養(yǎng)的體細(xì)胞球（例如角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞球等）具有較高的干性潛力，有利于分化為特有細(xì)胞。同時(shí)由細(xì)胞球打印出來的生物結(jié)構(gòu)相對于直接由細(xì)胞懸液打印出來的生物結(jié)構(gòu)而言，更有利于保持細(xì)胞的特有表型與結(jié)構(gòu)（例如角膜內(nèi)皮細(xì)胞球和視網(wǎng)膜上皮細(xì)胞球貼壁后更有利于六邊形細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成與細(xì)胞間的緊密連接）。另外細(xì)胞球比散細(xì)胞更有利于組織損傷的修復(fù)。

打印初期根據(jù)不同的打印要求以及細(xì)胞種類的不同，將細(xì)胞成球至不同直徑，再由此設(shè)定兩個(gè)打印坐標(biāo)之間的距離以及噴頭規(guī)格，可以滿足不同生長要求的打印過程，同時(shí)由于實(shí)際完成吸取以及擠出的加注器和噴頭始終在顯微鏡工作的景深范圍內(nèi)，細(xì)胞球始終處于監(jiān)控中，保證打印質(zhì)量。

本發(fā)明的3D細(xì)胞球打印可以形成的根據(jù)需要的不同面積與體積的細(xì)胞片，細(xì)胞片的厚度可根據(jù)需要打印形成單層細(xì)胞薄片或多層細(xì)胞片，而打印的細(xì)胞種類可根據(jù)需要形成單種細(xì)胞片、不同種多細(xì)胞單片或不同種多細(xì)胞多層細(xì)胞片。也可以根據(jù)組織結(jié)構(gòu)，打印形成有曲率、球面、以及符合需要移植的缺損組織形態(tài)及大小的細(xì)胞片。

本發(fā)明的3D細(xì)胞球打印形成的細(xì)胞片不需特殊的支架材料，也不需磁力等特殊材料和設(shè)備，與有支架材料的組織構(gòu)建方法相比，本發(fā)明構(gòu)成的細(xì)胞片僅含有細(xì)胞，提高了其生物相容性，避免了由于支架材料引入引起的炎癥反應(yīng)，及生物材料降解后的細(xì)胞排列順序紊亂和組織纖維化的副作用，也避免了膠原改性可能帶入有害物質(zhì)(如交聯(lián)劑)。

本發(fā)明的3D細(xì)胞球打印可以可通過機(jī)器參數(shù)設(shè)定，快速打印細(xì)胞片的二維或三維基本結(jié)構(gòu)，通過細(xì)胞培養(yǎng)獲得生物活性良好的細(xì)胞片。細(xì)胞片形成與細(xì)胞生長速度相關(guān)，本發(fā)明的3D細(xì)胞球打印使用的是細(xì)胞球，與單散細(xì)胞打印比較，細(xì)胞活性、增殖潛能與干細(xì)胞特征都更好，對促進(jìn)細(xì)胞快速增殖、遷移有很好的效果，同時(shí)由于細(xì)胞球展開后可以形成完整、連續(xù)的高密度及有極性的細(xì)胞片，對細(xì)胞間形成緊密連接有很大幫助，不干擾細(xì)胞正常生理過程，移植時(shí)可直接粘附于受傷組織。

本發(fā)明的3D細(xì)胞球打印使用的是細(xì)胞球，與單散細(xì)胞打印比較，由于細(xì)胞活性高，細(xì)胞功能的建立更完善，特別有利于構(gòu)建需要建立屏障功能的細(xì)胞片。

（1）建立打印的計(jì)算機(jī)實(shí)體模型，對其進(jìn)行切片分層，得到每層的形狀信息；

（2）根據(jù)打印要求培養(yǎng)細(xì)胞成球至指定直徑，同時(shí)準(zhǔn)備培養(yǎng)及打印過程中所需的培養(yǎng)液；

（3）根據(jù)每層的形狀信息，以及打印細(xì)胞球的直徑和細(xì)胞球種類選擇噴頭和打印間距，并計(jì)算出每個(gè)細(xì)胞球的打印坐標(biāo)；

（4）中央控制處理系統(tǒng)通過三維控制系統(tǒng)控制加注器，在噴頭更換平臺(tái)上選取最優(yōu)規(guī)格噴頭并移動(dòng)至工作位置；

（5）打印裝置初始化，此時(shí)培養(yǎng)細(xì)胞球的瓊脂糖上，第一個(gè)細(xì)胞球?qū)?zhǔn)噴頭，并記錄此時(shí)的吸取坐標(biāo)；

（6）步驟（3）中的每個(gè)細(xì)胞球的打印坐標(biāo)輸入控制處理系統(tǒng)中，通過控制處理系統(tǒng)控制協(xié)調(diào)裝置的運(yùn)行及工作；

（7）控制二維位移平臺(tái)移動(dòng)至吸取坐標(biāo)，通過高度調(diào)整裝置調(diào)整加注系統(tǒng)的高度，使其移動(dòng)到吸取高度，控制加注系統(tǒng)的氣壓控制結(jié)構(gòu)，使得加注系統(tǒng)的噴頭吸取對應(yīng)的細(xì)胞球；

（8）細(xì)胞球吸取完成后，通過控制處理系統(tǒng)控制二維位移平臺(tái)移動(dòng)至打印坐標(biāo)，并通過高度調(diào)整裝置調(diào)整加注系統(tǒng)的高度，使其移動(dòng)到打印高度，同時(shí)通過控制氣壓控制結(jié)構(gòu)使得噴頭打印對應(yīng)細(xì)胞球；

（9）重復(fù)步驟（7）和（8），直至打印完成。

附圖說明

圖1是本發(fā)明的打印裝置的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2是本發(fā)明的吸取打印平臺(tái)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3是本發(fā)明的加注系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4是本發(fā)明的顯微成像系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5是人角膜上皮細(xì)胞系融合生長及成球示意圖；

圖6是人角膜上皮細(xì)胞系成球第5天的效果示意圖；

圖7是人角膜上皮細(xì)胞系細(xì)胞球打印后展開后第五天的示意圖；

圖8是人角膜上皮細(xì)胞系細(xì)胞球打印后展開后第七天的示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例：

如圖1一種細(xì)胞球精準(zhǔn)定位生物打印裝置包括：固定底板1、吸取及打印平臺(tái)2、方位角控制裝置3、高度調(diào)整裝置4、徑向距離調(diào)整裝置5、加注系統(tǒng)6、噴頭更換平臺(tái)7、顯微成像系統(tǒng)8、中央控制處理系統(tǒng)9和顯示系統(tǒng)10，方位角控制裝置3、高度調(diào)整裝置4和徑向距離調(diào)整裝置5構(gòu)成三維控制系統(tǒng)，加注系統(tǒng)6固定于三維控制系統(tǒng)的徑向距離調(diào)整裝置上，所述控制處理系統(tǒng)9連接了吸取打印平臺(tái)2、加注系統(tǒng)6、三維控制系統(tǒng)的方位角控制裝置3、高度調(diào)整裝置4和徑向距離調(diào)整裝置5、顯微成像系統(tǒng)8和顯示系統(tǒng)10，所述顯微成像系統(tǒng)8在工作時(shí)對準(zhǔn)加注系統(tǒng)6在吸取打印平臺(tái)2上面的投影位置，所述吸取打印平臺(tái)2包括二維位移平臺(tái)201、瓊脂糖固定裝置202和培養(yǎng)皿固定裝置205，所述培養(yǎng)皿固定裝置用于固定培養(yǎng)皿206，所述瓊脂糖固定裝置202用于固定瓊脂糖203，所述瓊脂糖203中培養(yǎng)有作為生物墨水的細(xì)胞球204，打印所使用的生物墨水為培養(yǎng)于瓊脂糖203上的細(xì)胞球204。

所述加注系統(tǒng)包括噴頭601、加注器602、加注器控制器603、以及加注器固定裝置604，所述噴頭601與加注器602連接，所述加注器602與加注器控制器603連接，所述加注器固定裝置604固定于三維控制系統(tǒng)的徑向距離調(diào)整裝置5上。

所述顯微成像系統(tǒng)包括陣列LED照明裝置801、顯微鏡802和圖像采集卡803。

顯微鏡802選擇具有長工作距離以及大景深的顯微鏡。

所述加注器602包括氣壓控制結(jié)構(gòu)，所述氣壓控制結(jié)構(gòu)包括空氣壓縮機(jī)和氣壓調(diào)節(jié)閥，由加注器控制器控制。

所述噴頭601為中央控制處理系統(tǒng)9根據(jù)輸入的打印源細(xì)胞信息自動(dòng)選擇并通過三維控制系統(tǒng)的方位角控制裝置3、高度調(diào)整裝置4和徑向距離調(diào)整裝置5控制加注系統(tǒng)6在噴頭更換平臺(tái)7選取，所有噴頭均采用透光性良好的透明材料制造，以便使得細(xì)胞球204無論是在打印過程前位于瓊脂糖203上、打印過程中位于噴頭601內(nèi)還是打印過程后位于培養(yǎng)皿206中都能通過顯微鏡成像并被中央控制處理系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)測，以此來保證整個(gè)打印過程的順利進(jìn)行以及高質(zhì)量的打印效果。

所述三維控制系統(tǒng)包括方位角控制裝置3和徑向距離調(diào)整裝置4與高度調(diào)整裝置5，所述三維控制系統(tǒng)采用圓柱坐標(biāo)系，所述方位角控制裝置3用于調(diào)整噴頭601位置的相對方位角，所述的高度調(diào)整裝置5用于調(diào)整噴頭601的高度，所述徑向距離調(diào)整裝置4用于調(diào)整噴頭601的徑向距離。采用上述生物打印裝置進(jìn)行生物打印的方法，包括以下步驟：

培育細(xì)胞球204；

制備培養(yǎng)基；

固定瓊脂糖203及培養(yǎng)皿206；

輸入打印圖形信息和作為生物墨水的打印源細(xì)胞信息；

根據(jù)打印源細(xì)胞信息，中央控制處理系統(tǒng)9自動(dòng)選擇最優(yōu)噴頭規(guī)格，中央處理控制系統(tǒng)9通過三維控制系統(tǒng)的方位角控制裝置3、高度調(diào)整裝置4和徑向距離調(diào)整裝置5控制加注器6在噴頭更換平臺(tái)7上選擇合適規(guī)格的噴頭，再通過三維控制系統(tǒng)控制噴頭601到達(dá)工作位置；初始化裝置：粗調(diào)顯微成像系統(tǒng)8的位置以及角度，使得顯微鏡802的工作位置為噴頭601在吸取打印平臺(tái)2上的投影位置；

粗調(diào)二維位移平臺(tái)2，使得在顯微成像系統(tǒng)6中可以觀測到噴頭601對準(zhǔn)第一個(gè)細(xì)胞球204；

精調(diào)顯微成像系統(tǒng)8的位置以及角度及吸取打印平臺(tái)2的位置，使得在顯微成像系統(tǒng)8中可以同時(shí)清晰的觀測到細(xì)胞球204以及噴頭601，并且它們在同一個(gè)水平位置上；

打印開始，打印過程分為依次進(jìn)行的細(xì)胞球吸取過程、狀態(tài)切換過程和細(xì)胞球擠出過程：

細(xì)胞球吸取過程：高度調(diào)整裝置4在等待高度時(shí)，中央控制處理系統(tǒng)9通過加注器控制器603使得加注器602擠出噴頭601內(nèi)部的空氣，使噴頭601內(nèi)形成負(fù)壓；中央控制處理系統(tǒng)9控制高度調(diào)整裝置4向下運(yùn)動(dòng)，使得加注器602和噴頭601移至吸取高度，此時(shí)中央控制處理系統(tǒng)9通過加注器控制器603控制加注器602釋放噴頭601內(nèi)壓力，使得噴頭601將對準(zhǔn)的細(xì)胞球204連同培養(yǎng)液一同吸??；中央控制處理系統(tǒng)9控制高度調(diào)整裝置4向上運(yùn)動(dòng)，使得加注器602和噴頭601移至等待高度；

狀態(tài)切換過程：細(xì)胞球204吸取完成之后，中央控制處理系統(tǒng)9控制二維位移平臺(tái)201移至擠出坐標(biāo)位置，該過程中加注器602和噴頭601始終在等待位置等待；

細(xì)胞球擠出過程：當(dāng)二維位移平臺(tái)201運(yùn)動(dòng)至擠出坐標(biāo)位置后，中央控制處理系統(tǒng)9通過加注器控制器603控制加注器602將噴頭601內(nèi)的細(xì)胞球204以及培養(yǎng)液一同擠出至打印坐標(biāo)。

整個(gè)打印過程由細(xì)胞球吸取過程、狀態(tài)切換過程和細(xì)胞球打印過程。每完成一次細(xì)胞球吸取以及細(xì)胞球擠出后，中央控制處理系統(tǒng)9讀取下一個(gè)吸取細(xì)胞球204的坐標(biāo)和打印坐標(biāo)，由于瓊脂糖203上的細(xì)胞器是均勻規(guī)律排布的，每一個(gè)細(xì)胞球204的坐標(biāo)都是已知的，而打印坐標(biāo)由控制處理系統(tǒng)全部計(jì)算出。

本實(shí)施例的打印過程均在無菌環(huán)境下完成。

本實(shí)施例采用以下方法培育作為生物墨水的細(xì)胞球：向高壓滅菌過的多孔橡膠模具中加入熱的1%-3% G-10瓊脂糖溶液，待其冷卻后折疊橡膠模具取出瓊脂糖并存放在培養(yǎng)皿中, 將密度為1×10⁶~10×10⁶的指定細(xì)胞加入到瓊脂糖中，并在培養(yǎng)皿周圍加入適量的培養(yǎng)基，置于37℃和5% CO₂的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3-4天即可獲得裝有指定細(xì)胞球的瓊脂糖。

本實(shí)施例中，培養(yǎng)基采用高糖DMEM和10%的胎牛血清，另外培養(yǎng)上皮細(xì)胞系時(shí)再加入1%雙抗、1%非必需氨基酸和10 ng/mL上皮生長因子。培養(yǎng)基也可以參照不同的細(xì)胞給予相應(yīng)的體細(xì)胞培養(yǎng)液以及干細(xì)胞培養(yǎng)液。

將培養(yǎng)有指定細(xì)胞球的瓊脂糖以及準(zhǔn)備好用于打印的培養(yǎng)皿分別安放在吸取打印平臺(tái)上的瓊脂糖固定裝置和培養(yǎng)皿固定裝置上。以此將載有打印細(xì)胞源的瓊脂糖和用于打印的培養(yǎng)皿準(zhǔn)確的固定在吸取打印平臺(tái)的預(yù)設(shè)坐標(biāo)上，中央控制處理系統(tǒng)通過吸取打印平臺(tái)上的二維位移平臺(tái)便可實(shí)現(xiàn)對瓊脂糖或者說打印源細(xì)胞球位置的精確控制。本實(shí)施例中，培育細(xì)胞球時(shí)的參數(shù)如下：

培養(yǎng)時(shí)間：3天—5天；

培養(yǎng)溫度：37℃；

培養(yǎng)基的成分包括：HG DMEM，10%FBS、NEAA非必需氨基酸、Human EGF生長因子、P/S雙抗加入ROCK抑制劑：0.1uM—1uM；培養(yǎng)基也可以參照不同的細(xì)胞給予相應(yīng)的體細(xì)胞培養(yǎng)液以及干細(xì)胞培養(yǎng)液。

本實(shí)施例中，打印過程中的參數(shù)控制如下：

兩個(gè)細(xì)胞球的間距：0.3mm—1.5mm；

包裹細(xì)胞球的液滴的體積：3uL—8uL。