本發(fā)明涉及融合蛋白領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種高糖基化人生長激素融合蛋白及其制備方法和用途。

背景技術(shù)：

人生長激素(human growth hormone，hGH)是由腦垂體前葉嗜酸性細(xì)胞分泌的一種蛋白質(zhì)激素，由191個(gè)氨基酸組成，其生理功能主要是促進(jìn)物質(zhì)代謝和生長發(fā)育。hGH通過促生長因子或胰島素樣生長因子介導(dǎo)作用于軟骨組織，增加骨骼長度，從而達(dá)到促進(jìn)人體的線性生長。最近幾年hGH更多的功能被發(fā)現(xiàn)，包括促進(jìn)骨骼肌和心肌細(xì)胞生長、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能及增強(qiáng)免疫防御能力等作用。hGH的大規(guī)模臨床應(yīng)用也從最初的生長激素缺乏的兒童矮小癥的預(yù)防和治療，拓展到燒傷、急性胰腺炎、老年人延緩衰老等領(lǐng)域，其臨床適應(yīng)證還在不斷擴(kuò)展中。

兒童和成人在生長激素缺乏的情況下，可以通過外源補(bǔ)充生長激素來進(jìn)行治療。天然hGH的體內(nèi)清除半衰期約為0.3小時(shí)，目前商業(yè)化的重組人生長激素的體內(nèi)清除半衰期約為2-3小時(shí)，注射后很快就會通過肝臟、腎臟清除，所以需要每天皮下注射給藥，給患者帶來很多痛苦。此外，長期注射重組人生長激素在少數(shù)病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體而影響療效。因此，需要一種技術(shù)在延長hGH體內(nèi)循環(huán)半衰期的同時(shí)還可以保持較高的活性。構(gòu)建重組長效、高活性、降低的免疫原性及較高的生物利用度的人生長激素成為下一代藥物開發(fā)的首要目標(biāo)。

為了穩(wěn)定蛋白質(zhì)，防止酶解和腎臟的清除作用，可采用諸如聚乙二醇(PEG)修飾(Sada et al.,J.Ferment Bioeng 71:137-139,1991)、糖基化修飾改造(美國專利號US 7,217,689)和與其他蛋白質(zhì)融合(WO 93/15199)的方法以促進(jìn)體內(nèi)吸收、防止被降解和腎臟清除。PEG修飾的蛋白能夠防止水解，不會引起嚴(yán)重副作用，然而PEG與目標(biāo)蛋白偶聯(lián)屬于非特異性共價(jià)結(jié)合，這種隨機(jī)偶聯(lián)不同程度的阻礙目標(biāo)蛋白與其受體之間的相互作用而導(dǎo)致其體內(nèi)活性降低。增加糖基化可以增加目標(biāo)蛋白的分子量，特別對于處在腎臟濾過臨界線的蛋白質(zhì)(～30KD)，糖基化可以降低蛋白質(zhì)對蛋白酶水解的敏感性。韓國專利申請公開號KR10-2013-0029713公開了通過在α-1抗胰蛋白酶上引入至少一個(gè)突變加入N-糖基，嘗試增加體內(nèi)半衰期的方法。蛋白質(zhì)的糖基化修飾有兩類，包括O-糖鏈和N-糖鏈。然而，糖鏈的附著和添加可引起生理活性蛋白質(zhì)失活，可額外附著糖鏈的生理活性蛋白質(zhì)的位點(diǎn)的選擇面也非常窄，因此向蛋白質(zhì)引入額外的糖基化位點(diǎn)的糖基化工程技術(shù)還未廣泛使用。

改善蛋白藥代動力學(xué)和體內(nèi)穩(wěn)定性的另一種方法是將生理活性蛋白的基因連接在一個(gè)具有高穩(wěn)定性的蛋白的表達(dá)基因上，通過基因重組技術(shù)以產(chǎn)生融合蛋白。Fc融合蛋白是利用基因工程等技術(shù)將某種具有生物學(xué)活性的功能蛋白分子(可溶性配體、受體或其他需要延長半衰期的生物活性物質(zhì))與Fc片段融合而產(chǎn)生的新型重組蛋白。該類融合蛋白不僅保留了功能蛋白分子的生物學(xué)活性，還能延長融合蛋白的半衰期并提高其穩(wěn)定性，F(xiàn)c片段的鏈間二硫鍵有利于融合分子形成二聚體，從而增強(qiáng)配體結(jié)合能力和提高生物活性；Fc片段的引入還有利于提高融合分子在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。因此制造含有與人IgG蛋白的Fc區(qū)域相連的融合蛋白，將有助于延長藥物的循環(huán)半衰期和/或增加它的生物活性。專利CN102875683公開了一種長效重組人生長激素的Fc融合蛋白，在hGH和人IgG Fc變體中增加了一段柔性肽接頭來降低空間位阻效應(yīng)，預(yù)期目標(biāo)是使其血清半衰期延長，生物活性增加，從而改善了藥代動力學(xué)和藥效。然而，由于hGH的活性位點(diǎn)主要在C端，C末端融合的其他蛋白大大影響了hGH的活性及功能，CN102875683專利中顯示二聚化的hGH-L-vFc的摩爾比活性為1.2nM，其活性相較重組hGH仍不夠理想。根據(jù)本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，單純的延長柔性肽接頭，增加Fc與hGH C端的空間距離并不能解決問題，需要其它方法來解決融合配體對hGH活性影響的難題。本發(fā)明旨在尋找新的融合方法，進(jìn)一步提高融合蛋白的血清半衰期及體內(nèi)活性。

CTP是一段來自人絨毛膜促性腺激素(hCG)的β-亞基羧基末端的短肽。四種與生殖相關(guān)的多肽類激素，促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH)和絨毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亞基和各自特異的β-亞基。與其它三種激素相比，hCG體內(nèi)半衰期明顯延長，這主要來源于其β-亞基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA et al.Proc Natl Acad Sci USA.89:4304–4308,1992)。CTP含有37個(gè)氨基酸殘基，它具有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，終端是唾液酸殘基。CTP可以增加蛋白質(zhì)的糖基化水平，提高目標(biāo)蛋白的活性，同時(shí)帶負(fù)電、高度唾液酸化的CTP能夠抵抗腎臟對其的清除作用，從而延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。美國專利13,195,931公開了一種通過在hGH上連接絨毛膜促性腺激素羧基末端肽(CTP)的方法，使生長激素循環(huán)半衰期僅延長了約6倍，但并未提及幾種hGH/CTP嵌合蛋白體外活性的大?。惑w內(nèi)藥效顯示融合1個(gè)或2個(gè)CTP分子的嵌合蛋白較重組hGH的效果差，僅CTP-hGH-CTP-CTP這種嵌合了3個(gè)CTP分子的嵌合蛋白藥效略高于重組hGH。本發(fā)明人創(chuàng)造性地將具有多個(gè)O-糖基位點(diǎn)的CTP多肽作為連接肽的一部分，用于連接hGH和Fc片段，而不是作為融合配體發(fā)揮作用，因它具有的天然糖基化位點(diǎn)，不僅能使融合蛋白的半衰期進(jìn)一步延長，生物利用度提高，同時(shí)還大大降低了融合配體Fc對hGH的位阻效應(yīng)，使其保持了較高的生物學(xué)活性。

綜合以上內(nèi)容，目前已經(jīng)有許多蛋白融合方法被構(gòu)建用于研制長效蛋白類藥物，然而迄今尚沒有活性及半衰期非常令人滿意的長效hGH制劑。因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)長效、高活性、純化步驟簡單、便于工業(yè)化生產(chǎn)的長效hGH。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明為了解決重組hGH血清半衰期短及生物活性差的問題，設(shè)計(jì)并制備了一種高糖基化的長效hGH融合蛋白。本發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究，首次設(shè)計(jì)了獨(dú)特的肽接頭來降低融合分子間的空間位阻，由hGH的C端與Fc連接組成的融合蛋白，中間以柔性肽和剛性肽連接。出乎意料地，此融合蛋白比以前本發(fā)明人研制的hGH-L-vFc的體外活性提高了約1倍(參見，中國專利號CN102875683)。此外，還取得了預(yù)料不到的技術(shù)效果，即所述融合蛋白的生物利用度也大幅提高。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組hGH融合蛋白，所述融合蛋白從N端到C端依次含有人生長激素(hGH)、柔性肽接頭(L)、人絨毛膜促性腺激素β-亞基羧基末端剛性肽(CTP)和人免疫球蛋白Fc片段；其中，F(xiàn)c片段優(yōu)選人IgG Fc變體(表示為vFc)。

其中，所述柔性肽接頭優(yōu)選非免疫原性的，并且在hGH和Fc之間產(chǎn)生足夠的距離，使相互之間的位阻效應(yīng)降至最低。較佳地，使用含有以下2個(gè)或多個(gè)氨基酸構(gòu)成的柔性肽接頭：Gly(G)、Ser(S)、Ala(A)和Thr(T)。優(yōu)選地，所述柔性肽接頭包含G和S殘基。連接肽的長度對融合蛋白的活性非常重要。對本發(fā)明而言，優(yōu)選地，所述柔性肽接頭氨基酸組成的結(jié)構(gòu)通式為(GS)_a(GGS)_b(GGGS)_c(GGGGS)_d，其中a，b，c和d是大于或等于0的整數(shù)，且a+b+c+d≥1。

本發(fā)明的一些實(shí)施例中，所述肽接頭選自如下序列：

(a)L1：GSGGGSGGGGSGGGGS；

(b)L2：GSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(c)L3：GSGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS；

(d)L4：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

其中，所述人絨毛膜促性腺激素β-亞基羧基末端肽剛性肽(CTP)選自由人絨毛膜促性腺激素β亞基羧基末端第113至145位氨基酸所組成的全長序列或其片段(以下簡稱CTP)，具體地，所述CTP剛性肽包含SEQ ID NO：1或其截短的序列。

優(yōu)選地，所述CTP剛性肽包含至少2個(gè)糖基化位點(diǎn)；例如，本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例中，所述CTP包含2個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP包含SEQ ID NO：1N端的10個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*(*代表糖基化位點(diǎn))；或所述CTP包含SEQ ID NO：1C端的14個(gè)氨基酸，即S*RLPGPS*DTPILPQ；又如，另一實(shí)施例中，所述CTP包含3個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP包含SEQ ID NO：1N端的16個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*R；再如，另一些實(shí)施例中，所述CTP包含4個(gè)糖基化位點(diǎn)，示例性地，所述CTP序列包含28、29、30、31、32或33個(gè)氨基酸并開始于人絨毛膜促性腺激素β亞基的第113、114、115、116、117或118位，終止于第145位。具體地，所述CTP包含SEQ ID NO：1N端的28個(gè)氨基酸，即SSSS*KAPPPS*LPSPS*RLPGPS*DTPILPQ。每種可能性都代表本發(fā)明的獨(dú)立實(shí)施方式。

在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少70％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少80％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少90％同源；在另一些實(shí)施例中，本發(fā)明提供的CTP剛性單元與天然CTP氨基酸序列至少95％同源。

優(yōu)選地，本發(fā)明的實(shí)施例中，所述CTP剛性肽可優(yōu)選地包含如下序列單元：

(i)CTP¹：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(ii)CTP²：PRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ；

(iii)CTP³：SSSSKAPPPS；

(iv)CTP⁴：SRLPGPSDTPILPQ。

本發(fā)明所述融合蛋白還可以包含2個(gè)或2個(gè)以上的上述CTP剛性肽序列單元，如本發(fā)明的一實(shí)施例中，所述CTP包含2個(gè)CTP³單元：SSSSKAPPPSSSSSKAPPPS(CTP^3-CTP³，或表示為(CTP³)₂)。

其中，延長半衰期部分優(yōu)選自免疫球蛋白IgG、IgM、IgA Fc片段；更優(yōu)選自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4及其變體的Fc片段；進(jìn)一步地，所述人IgG Fc變體包含位于野生型人IgG Fc中的至少一種氨基酸修飾，且變體具有降低的效應(yīng)子功能(ADCC和/或CDC效應(yīng))和/或與新生兒受體FcRn的結(jié)合親和力增強(qiáng)。進(jìn)一步地，人IgG Fc變體可選自下組：

(a)vFcγ₁：含有Leu234Val、Leu235Ala和Pro331Ser突變的人IgG1絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：4所示氨基酸序列)；

(b)vFcγ_2-1：含有Pro331Ser突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：5所示氨基酸序列)；

(c)vFcγ_2-2：含有Pro331Ser、Thr250Gln和Met428Leu突變的人IgG2絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：6所示氨基酸序列)；

(d)vFcγ₄：含有Ser228Pro和Leu235Ala突變的人IgG4絞鏈區(qū)、CH2和CH3區(qū)域(如SEQ ID NO：7所示氨基酸序列)。

較優(yōu)地，所述hGH-L-CTP-vFc融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

在本發(fā)明的第二方面，提供了一種編碼本發(fā)明第一方面所述重組hGH-L-CTP-vFc融合蛋白的DNA分子，優(yōu)選地，所述的DNA序列具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供一種載體，該載體包含本發(fā)明第二方面所述的DNA序列。

根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含本發(fā)明第三方面所述載體，或者轉(zhuǎn)染了上述載體。

在本發(fā)明的具體實(shí)施方式中，宿主細(xì)胞是CHO的衍生細(xì)胞株DXB-11。

優(yōu)選地，所述宿主細(xì)胞在其生長培養(yǎng)基中在每24小時(shí)內(nèi)，產(chǎn)生超過30μg/百萬個(gè)細(xì)胞的如本發(fā)明第一方面所述的重組hGH-L-CTP-vFc融合蛋白。

在本發(fā)明的第五方面，提供了一種制備本發(fā)明第一方面所述重組hGH-L-CTP-vFc融合蛋白的方法，所述方法包括：

(a)將編碼融合蛋白的DNA引入CHO細(xì)胞，生成CHO衍生細(xì)胞系；

(b)篩選步驟(a)中每24小時(shí)期間內(nèi)，表達(dá)超過30μg/10⁶(百萬)個(gè)細(xì)胞的高產(chǎn)量細(xì)胞株；

(c)培養(yǎng)步驟(b)篩選到的細(xì)胞株，表達(dá)融合蛋白；

(d)收獲步驟(c)得到的發(fā)酵液，純化融合蛋白。

在本發(fā)明的第六方面，本發(fā)明提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物包括藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑，以及有效量的所述hGH-L-CTP-vFc融合蛋白。

再一方面，本發(fā)明提供了所述hGH-L-CTP-vFc融合蛋白在用于治療因內(nèi)源性生長激素分泌不足造成的生長發(fā)育障礙，以及特納綜合癥引起的體型矮小、慢性腎功能衰竭、Prader-Willi綜合癥或特發(fā)性體型矮小等病癥。

綜上，本發(fā)明融合蛋白結(jié)構(gòu)具有以下特點(diǎn)：1、融合蛋白采用的融合配體人IgG Fc變體是非裂解性的，降低了與FcγRs及Clq結(jié)合而觸發(fā)的效應(yīng)子功能；2、本發(fā)明制備的融合蛋白無論在發(fā)酵、純化過程以及儲存過程中均具有良好的穩(wěn)定性；3、通過L-CTP連接hGH與Fc變體，CTP剛性肽不僅能進(jìn)一步延長其體內(nèi)半衰期；同時(shí)借助多個(gè)糖基化側(cè)鏈的阻隔作用，增加融合分子間的空間距離，促使hGH和Fc段各自折疊形成正確的三維構(gòu)象而互不影響各自的生物活性，與hGH-L-vFc相比，hGH-L-CTP-vFc的生物活性大幅度提高；4、融合蛋白具有降低的免疫原性，使其誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的風(fēng)險(xiǎn)降低；5、與hGH-L-vFc相比，hGH-L-CTP-vFc具有提高的生物利用度，血藥濃度波動小，安全性提高，改善耐受性；具有延長的體內(nèi)循環(huán)半衰期，可降低注射頻率，提高患者依從性；6、與重組hGH相比，hGH-L-CTP-vFc純化步驟簡單、純化效率高。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實(shí)施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

發(fā)明詳述：

IgG Fc變體

非裂解性Fc變體

Fc元件來源于免疫球蛋白IgG的恒定區(qū)Fc片段，它在消滅病原體的免疫防御中起重要作用。Fc介導(dǎo)的IgG的效應(yīng)子功能發(fā)揮通過兩種機(jī)制：(1)與細(xì)胞表面Fc受體(FcγRs)結(jié)合，由吞噬作用或裂解作用或殺傷細(xì)胞通過抗體依賴性細(xì)胞毒性(ADCC)途徑消化病原體，或(2)與第一補(bǔ)體成分C1的C1q結(jié)合，引發(fā)補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(CDC)途徑，從而裂解病原體。對應(yīng)用于人的治療而言，當(dāng)hGH-L-CTP-vFc融合蛋白結(jié)合于靶點(diǎn)細(xì)胞表面上的hGH受體時(shí)，融合蛋白的Fc區(qū)域最好不具有不良效應(yīng)子功能，從而不會溶解或除去這些靶點(diǎn)細(xì)胞。因此，hGH-Fc的Fc區(qū)域必須是非溶解性的，對結(jié)合于FcγRs和Clq從而觸發(fā)效應(yīng)子功能方面，F(xiàn)c區(qū)域最好是無活性的。在四種人IgG亞型中，IgG1和IgG3能有效結(jié)合FcγRs，IgG4與FcγRs的結(jié)合親和力較低，而IgG2與FcγRs的結(jié)合低得難以測定，所以人IgG2幾乎沒有ADCC效應(yīng)。此外，人IgG1和IgG3還能有效結(jié)合C1q而激活補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng)。人IgG2與C1q結(jié)合相對弱，而IgG4不與C1q結(jié)合(Jefferis R等,Immunol Rev,1998,163:59-76)，所以人IgG2CDC效應(yīng)也較弱。顯然，沒有一種天然IgG亞型非常適合產(chǎn)生hGH融合蛋白。為了得到不具效應(yīng)子功能的非裂解性Fc，最有效方法是對Fc片段上補(bǔ)體、受體結(jié)合域突變改造，調(diào)節(jié)Fc與相關(guān)受體的結(jié)合親和力，降低或消除ADCC和CDC效應(yīng)，只保留Fc的長循環(huán)半衰期特性，而不產(chǎn)生細(xì)胞毒性。更多的非裂解性Fc變體所包含突變位點(diǎn)可以參見Shields RL等,J Biol Chem,2001,276(9):6591-604或中國發(fā)明專利CN 201280031137.2。

藥代動力學(xué)改善的Fc變體

IgG的血漿半壽期取決于它與FcRn的結(jié)合，一般在pH 6.0時(shí)結(jié)合，在pH 7.4(血漿pH)時(shí)解離。通過對兩者結(jié)合位點(diǎn)的研究，改造IgG上與FcRn結(jié)合的位點(diǎn)，使之在pH 6.0時(shí)結(jié)合能力增加。已經(jīng)證明對于結(jié)合FcRn重要的人Fcγ結(jié)構(gòu)域的一些殘基的突變可增加血清半衰期。尤其，在人Fcγ1中，當(dāng)三個(gè)殘基被其他19個(gè)常規(guī)氨基酸替代時(shí)，一些點(diǎn)突變顯示增加的FcRn結(jié)合親和力(Hinton等,J Biol Chem,279(8):6213-6216,2004)。Hinton等發(fā)現(xiàn)T250Q和M428L 2個(gè)突變體分別使與FcRn的結(jié)合增加3和7倍。同時(shí)突變2個(gè)位點(diǎn)，則結(jié)合增加28倍。在恒河猴體內(nèi)，M428L或T250QM428L突變體顯示血漿半壽期增加2倍(Paul R.Hinton等,J Immunol,2006,176:346-356)。此外，有研究對五種人源化抗體的Fc段進(jìn)行T250Q/M428L突變不僅改善了Fc與FcRn的相互作用，且在隨后的體內(nèi)藥代動力學(xué)試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)以皮下注射給藥，F(xiàn)c突變抗體與野生型抗體相比藥代動力學(xué)參數(shù)改善，體內(nèi)暴露量增加，清除率降低，皮下生物利用度得到了改善(Datta-Mannan A等.MAbs.Taylor&Francis,2012,4(2):267-273.)。

羧基末端肽(CTP)

CTP是一段來自人絨毛膜促性腺激素(hCG)的β-亞基羧基末端的短肽。四種與生殖相關(guān)的多肽類激素促卵泡激素(FSH)、黃體生成素(LH)、促甲狀腺素(TSH)和絨毛膜促性腺激素(hCG)含有相同的α-亞基和各自特異的β-亞基。與其它三種激素相比，hCG體內(nèi)半衰期明顯延長，這主要來源于其β-亞基上特有的羧基末端肽(CTP)(Fares FA等,Proc Natl Acad Sci USA,1992,89:4304-4308)。CTP含有37個(gè)氨基酸殘基，它具有4個(gè)O-糖基化位點(diǎn)，終端是唾液酸殘基。帶負(fù)電、高度唾液酸化的CTP能夠抵抗腎臟對它的清除作用，從而延長蛋白在體內(nèi)的半衰期。因而，發(fā)明人創(chuàng)造性地在適當(dāng)長度的柔性連接肽之后增加至少一個(gè)CTP多肽，使得融合蛋白的半衰期進(jìn)一步延長，生物利用度提高。

此外，通過在hGH與Fc變體間增加CTP肽，相當(dāng)于增加了一段剛性連接肽。這一方面保證了N-端融合的hGH不會影響Fc變體與FcRn的結(jié)合位點(diǎn)，從而影響半衰期；另外Fc的Protein A結(jié)合位點(diǎn)對于制備工藝中純化步驟很重要，連接CTP保證N-端融合的hGH也不會“罩住”它與protein A的結(jié)合位點(diǎn)。另一方面，CTP的添加也使得約25KD大小的Fc片段不會干擾N-端融合的hGH的正確折疊，從而使其生物學(xué)活性/功能的下降或喪失。具有多個(gè)糖基側(cè)鏈的剛性CTP多肽，相對于(GGGGS)n這類柔性連接肽的無規(guī)則卷曲，它可以形成穩(wěn)定的立體構(gòu)象，這種“阻隔”作用促使hGH和Fc段獨(dú)立折疊形成正確的三維構(gòu)象而互不影響各自的生物活性。

融合蛋白及其生產(chǎn)方法

本發(fā)明融合蛋白通常由生物合成的方法制備。根據(jù)本發(fā)明所述的核苷酸序列，本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法制得本發(fā)明的編碼核酸。這些方法例如但不限于：PCR，DNA人工合成等，具體的方法可參見J.薩姆布魯克，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》。作為本發(fā)明的一種實(shí)施方式，可通過分段合成核苷酸序列再進(jìn)行重疊延伸PCR的方法來構(gòu)建本發(fā)明的編碼核酸序列。

本發(fā)明還提供了一種表達(dá)載體，包含編碼本發(fā)明的融合蛋白的序列以及與之操作性相連的表達(dá)調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。

表達(dá)載體可采用市售的例如但不限于：pcDNA3、pIRES、pDR，pUC18等可用于真核細(xì)胞系統(tǒng)表達(dá)的載體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細(xì)胞來選擇合適的表達(dá)載體。

根據(jù)已知空載表達(dá)載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列插入合適的限制性位點(diǎn)，制得本發(fā)明的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明還提供了表達(dá)本發(fā)明融合蛋白的宿主細(xì)胞，其中含有本發(fā)明的融合蛋白的編碼序列。所述的宿主細(xì)胞優(yōu)選的是真核細(xì)胞，例如但不限于CHO，COS細(xì)胞，293細(xì)胞，RSF細(xì)胞等。作為本發(fā)明的優(yōu)選方式，所述的細(xì)胞是CHO細(xì)胞，其可良好地表達(dá)本發(fā)明的融合蛋白，可獲得結(jié)合活性良好，穩(wěn)定性良好的融合蛋白。

本發(fā)明還提供一種用重組DNA制備本發(fā)明融合蛋白的方法，其步驟包括：

1)提供編碼融合蛋白的核酸序列(如SEQ ID NO：3序列)；

2)將1)的核酸序列插入到合適的表達(dá)載體，獲得重組表達(dá)載體；

3)將2)的重組表達(dá)載體導(dǎo)入合適的宿主細(xì)胞；

4)在適合表達(dá)的條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞；

5)收集上清液，并純化融合蛋白產(chǎn)物。

將所述編碼序列導(dǎo)入宿主細(xì)胞可采用本領(lǐng)域的多種已知技術(shù)，例如但不限于：磷酸鈣沉淀，原生質(zhì)體融合，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，電穿孔，微注射，反轉(zhuǎn)錄法，噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)法，堿金屬離子法。

有關(guān)宿主細(xì)胞的培養(yǎng)和表達(dá)可參見Olander RM Dev Biol Stand 1996；86：338?？赏ㄟ^離心去除懸浮液中的細(xì)胞和殘?jiān)?，收集清液。可通過瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行鑒定。

可將上述制備獲得的融合蛋白純化為基本均一的性質(zhì)，例如在SDS-PAGE電泳上呈單一條帶。例如，當(dāng)重組蛋白為分泌表達(dá)時(shí)，可以采用商品化的超濾膜來分離所述蛋白，例如Millipore、Pellicon等公司產(chǎn)品，首先將表達(dá)上清濃縮。濃縮液可采用凝膠層析的方法進(jìn)一步加以純化，或采用離子交換層析的方法純化。例如陰離子交換層析(DEAE等)或陽離子交換層析。凝膠基質(zhì)可為瓊脂糖、葡聚糖、聚酰胺等常用于蛋白純化的基質(zhì)。Q-或SP-基團(tuán)是較為理想的離子交換基團(tuán)。最后，還可用羥基磷灰石吸附層析，金屬螯合層析，疏水相互作用層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)等方法對上述純化產(chǎn)物進(jìn)一步精制純化。上述所有純化步驟可利用不同的組合，最終使蛋白純度達(dá)到基本均一。

可利用含有所述融合蛋白的特異性抗體、受體或配體的親和層析柱對表達(dá)的融合蛋白進(jìn)行純化。根據(jù)所使用的親和柱的特性，可利用常規(guī)的方法，如高鹽緩沖液、改變pH等方法洗脫結(jié)合在親和柱上的融合性多肽?？蛇x擇地，所述的融合蛋白的氨基端或羧基端還可含有一個(gè)或多個(gè)多肽片段，作為蛋白標(biāo)簽。任何合適的標(biāo)簽都可以用于本發(fā)明。例如，所述的標(biāo)簽可以是FLAG，HA，HAl，c-Myc，6-His或8-His等。這些標(biāo)簽可用于對融合蛋白進(jìn)行純化。

藥物組合物

本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有有效量(如0.000001-90wt％；較佳的0.1-50wt％；更佳的，5-40wt％)的本發(fā)明的融合蛋白，以及藥學(xué)上可接受的載體。通常，可將有效量的本發(fā)明融合蛋白配制于無毒的、惰性的和藥學(xué)上可接受的水性載體介質(zhì)中，其中pH通常約為5-8，較佳地，pH約為6-8。術(shù)語“有效量”或“有效劑量”是指可對人和/或動物產(chǎn)生功能或活性的且可被人和/或動物所接受的量。“藥學(xué)上可接受的”的成分是適用于人和/或哺乳動物而無過度不良副反應(yīng)(如毒性、刺激和變態(tài)反應(yīng))的，即具有合理的效益/風(fēng)險(xiǎn)比的物質(zhì)。術(shù)語“藥學(xué)上可接受的載體”指用于治療劑給藥的載體，包括各種賦形劑和稀釋劑。

藥學(xué)上可接受的載體包括(但并不限于)：鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。通常藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配，本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。所述的藥物組合物宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量。本發(fā)明的藥物制劑還可制成緩釋制劑。

本發(fā)明所述的融合蛋白的有效量可隨給藥的模式和待治療的疾病的嚴(yán)重程度等而變化。優(yōu)選的有效量的選擇可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)各種因素來確定(例如通過臨床試驗(yàn))。所述的因素包括但不限于：所述的融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)例如生物利用度、代謝、半衰期等；患者所要治療的疾病的嚴(yán)重程度、患者的體重、患者的免疫狀況、給藥的途徑等。通常，當(dāng)本發(fā)明的融合蛋白每天以約0.00001mg-50mg/kg動物體重(較佳的0.0001mg-10mg/kg動物體重)的劑量給予，能得到令人滿意的效果。例如，由治療狀況的迫切要求，可每天給予若干次分開的劑量，或?qū)┝堪幢壤販p少。

附圖說明

圖1、顯示了在pAPG-3表達(dá)載體內(nèi)Spe I-EcoR I片段的融合蛋白的核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列。成熟蛋白中的肽接頭位置用下劃虛線標(biāo)出。在Fc區(qū)域中，粗體的核苷酸和相應(yīng)的氨基酸變體用下劃線標(biāo)出。

圖2、顯示了hGH融合蛋白刺激Nb2-11細(xì)胞增殖的能力。

圖3、顯示了hGH融合蛋白的藥時(shí)曲線。

圖4、顯示了hGH融合蛋白給藥后各組的生長曲線。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

實(shí)施例1、構(gòu)建編碼hGH融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒

編碼hGH前導(dǎo)肽和成熟hGH的基因序列以及不同長度柔性肽接頭、不同長度CTP剛性肽和不同IgG Fc變體的基因序列都是人工優(yōu)化的CHO細(xì)胞偏愛密碼子，經(jīng)化學(xué)合成方法獲得。為了便于將目的片段插入表達(dá)載體的特定位點(diǎn)，在所合成片段5’和3’端各有一個(gè)限制性酶內(nèi)切位點(diǎn)，分別為SpeI和EcoRI。測序驗(yàn)證后的融合基因用SpeI和EcoRI酶切，然后插入到以PCDNA3.1為模板并改造后的表達(dá)質(zhì)粒PXY1A1的相應(yīng)酶切位點(diǎn)間，得到融合基因表達(dá)質(zhì)粒pAPG。PXY1A1質(zhì)粒包含但不限于以下重要表達(dá)元器件:1)人巨細(xì)胞病毒早期啟動子和哺乳動物細(xì)胞高外源表達(dá)所需增強(qiáng)子；2)雙重篩選標(biāo)記物，在細(xì)菌中具有卡那霉素抗性，在哺乳動物細(xì)胞中具有G418抗性；3)鼠二氫葉酸還原酶(DHFR)基因表達(dá)框，當(dāng)宿主細(xì)胞為DHFR基因缺陷型時(shí)，氨甲蝶呤(MTX)能共擴(kuò)增融合基因和DHFR基因(參見美國專利US 4,399,216)。

如表1所示，本發(fā)明構(gòu)建了一系列hGH-Fc融合蛋白，它們具有不同長度的柔性肽接頭、CTP組成及也位置不同，以及幾種不同亞型的IgG Fc變體(vFc)元件組成。其中APG-3的核苷酸序列及翻譯的氨基酸序列如圖1所示。

表1、構(gòu)建的幾種hGH融合蛋白組成

實(shí)施例2、瞬時(shí)表達(dá)不同融合蛋白和體外活性測定

實(shí)施例1中得到的一系列表達(dá)質(zhì)粒，在30ml的搖瓶里使用DNAFect LT試劑(ATGCell)轉(zhuǎn)染3×10⁷CHO細(xì)胞，經(jīng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞在無血清生長培養(yǎng)基中生長5天，根據(jù)對應(yīng)的ELISA方法測定上清液中的融合蛋白濃度，并用實(shí)施例5中描述的方法測定其體外生物學(xué)活性。ELISA結(jié)果顯示幾種質(zhì)粒在該條件下的瞬時(shí)表達(dá)量相差不多，但是它們的活性卻顯示出較大的差異(表2)。其中，我們將APG-1的摩爾比活性定義為100％。APG-2的活性為APG-1的80.9％，表明僅靠延長肽接頭并不能有效改善融合蛋白的活性，即彼此的空間位阻效應(yīng)并不能隨著肽接頭的延伸而削弱。甚至，過長的肽接頭不僅不能提高融合蛋白的活性，反而會使蛋白錯(cuò)誤折疊，以無活性的多聚體形式分泌。我們推測原因，過長的柔性肽接頭使融合蛋白的靈活度更高，使其能夠自由轉(zhuǎn)動，這可能使hGH的立體結(jié)構(gòu)更加靠近Fc區(qū)，而在二者之間加入CTP，一方面相當(dāng)增加了一端剛性肽接頭，使彼此遠(yuǎn)離，更重要的是CTP含多個(gè)糖基側(cè)鏈，相對于柔性肽接頭的無規(guī)則卷曲形態(tài)，CTP可以形成固定的空間構(gòu)象，能夠有效的分開融合蛋白的不同功能區(qū)，這更有利于兩部分獨(dú)立折疊成正確的三維構(gòu)象，保持了較高的活性。通過APG-1、APG-2和APG-3的活性比較驗(yàn)證了這種推測的正確性。而CTP置于Fc C端的APG-4的活性僅為CTP置于Fc N端的APG-3的61.3％，APG-4的活性與不含CTP的APG-1相似。而APG-3的活性比APG-4高，APG-5、APG-6和APG-7的活性也要遠(yuǎn)高于其他融合蛋白。以上結(jié)果，證實(shí)CTP對融合蛋白的活性極為關(guān)鍵，并且CTP置于Fc的N端更有利于提高融合蛋白的活性。

表2、瞬時(shí)表達(dá)的各種融合蛋白的體外活性EC₅₀值比較

實(shí)施例3、融合蛋白在轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中的表達(dá)

將重組的表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入哺乳動物宿主細(xì)胞系，以表達(dá)hGH-L-CTP-vFc融合蛋白。為了穩(wěn)定高水平的表達(dá)，優(yōu)選的宿主細(xì)胞系是DHFR酶缺陷型CHO-細(xì)胞(參見美國專利US 4,818,679)。一種優(yōu)選的轉(zhuǎn)染方法是電穿孔，也可以使用其它方法，包括磷酸鈣共沉降、脂轉(zhuǎn)染和原生質(zhì)融合。在電穿孔中，用設(shè)置為300V電場和1050μFd電容的Gene Pulser Electroporator(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)，在比色杯內(nèi)放置5×10⁷個(gè)細(xì)胞，隨后加入50μg用BspCI線性化的質(zhì)粒進(jìn)行電穿孔。在轉(zhuǎn)染兩天后，將培養(yǎng)基改成含0.6mg/mL G418的生長培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染約2周后，對G418藥物具有抗性的轉(zhuǎn)染子可長成肉眼可見的細(xì)胞群落。用抗人IgG Fc的ELISA分析方法，篩選對選擇用藥具有抗性的轉(zhuǎn)染子。也可用抗hGH的ELISA進(jìn)行融合蛋白表達(dá)量的定量分析。通過極限稀釋96孔培養(yǎng)板，亞克隆產(chǎn)生高水平Fc融合蛋白的孔。

為了實(shí)現(xiàn)融合蛋白較高水平的表達(dá)，宜用受MTX藥物抑制的DHFR基因進(jìn)行共擴(kuò)增。在含有遞增濃度MTX的生長培養(yǎng)基中，用DHFR基因共擴(kuò)增轉(zhuǎn)染的融合蛋白基因。用極限稀釋的亞克隆能在高達(dá)6μM MTX培養(yǎng)基中生長的轉(zhuǎn)染子。測定分泌率對亞克隆的細(xì)胞系進(jìn)行進(jìn)一步的分析。分泌率水平超過約30(較佳地約50)μg/10⁶(即百萬)個(gè)細(xì)胞/24小時(shí)的細(xì)胞系適應(yīng)使用無血清生長培養(yǎng)基的懸浮培養(yǎng)。然后再用條件培養(yǎng)基純化融合蛋白。

實(shí)施例4、融合蛋白的純化與定性

用1N NaOH將含有融合蛋白的條件培養(yǎng)基滴定到pH 7～8，然后用0.45微米的硝酸纖維素過濾器過濾。將濾液加樣到磷酸鹽緩沖液鹽水(PBS)平衡的Protein A柱上。待融合蛋白結(jié)合于Protein A柱后，棄去流出的組分。用PBS洗滌該柱，直到280nm處的OD值低于0.01。然后用0.1M pH為3.75的檸檬酸緩沖液洗脫結(jié)合的融合蛋白。洗脫液用0.4體積的1M K₂HPO₄中和，合并含有純化蛋白的組分，并用PBS透析。然后用0.22微米的硝酸纖維素過濾器過濾，并存儲在4℃。在非還原條件下，由SDS-PAGE對蛋白產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析。用BSA作為標(biāo)準(zhǔn)，通過BCA蛋白質(zhì)分析定量該融合蛋白。

實(shí)施例5、融合蛋白的體外生物活性分析

利用Nb2-11細(xì)胞增殖來檢測重組hGH-L-CTP-Fc融合蛋白的體外生物學(xué)活性。

用含有10％胎牛血清的Fischer's培養(yǎng)基正常培養(yǎng)小鼠淋巴瘤細(xì)胞Nb2-11(美國ATCC細(xì)胞庫)。使用無血清培養(yǎng)基，1000ng/ml起始3倍梯度稀釋融合蛋白，獲得8個(gè)不同濃度的樣本，每孔100μl，添加至96孔板，培養(yǎng)基為陰性對照。取處于對數(shù)期生長期的細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次，調(diào)整密度為每毫升3×10⁶個(gè)細(xì)胞，每孔100μl加入到上述96孔板中。在37℃、5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)，使用CCK-8試劑盒(Cell Counting Kit，購自上海翊圣生物科技有限公司)檢測細(xì)胞增殖情況。用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度，將OD讀數(shù)相對于融合蛋白的濃度作圖，所得劑量反應(yīng)曲線計(jì)算融合蛋白的生物活性。

圖2顯示了hGH融合蛋白刺激Nb2細(xì)胞增殖的能力。表3為不同融合蛋白的半數(shù)有效濃度值(half maximal effective concentration，EC₅₀)。由于生長激素C端的氨基酸與其功能密切相關(guān)，F(xiàn)c直接與hGH的C段連接會影響其生物活性。在hGH與Fc中加入連接肽后，hGH融合蛋白的活性提高。由結(jié)果可以看出，APG-3的活性與APG-1相比，活性提高將近一倍。這可能是由于CTP一方面發(fā)揮自身的功能，另一方面作為Fc和hGH之間的剛性連接肽，CTP與柔性肽偶聯(lián)，這種結(jié)構(gòu)使融合蛋白折疊成更有利的三維結(jié)構(gòu)，保證了hGH的生物活性。

表3、hGH融合蛋白的EC₅₀值

實(shí)施例6、融合蛋白的藥代動力學(xué)測定

雄性SPF級SD大鼠(購自上海必凱實(shí)驗(yàn)動物有限公司)，預(yù)飼一周后每組選用體重294g左右的的大鼠3只，單次0.176mg/kg給予靜脈注射APG-1和APG-3融合蛋白，考察血藥濃度和時(shí)間的變化規(guī)律。對照組和給藥組分別在給藥后0、0.5、1、2、3、4、5、8、10、24、48、72h經(jīng)眼眶采血，血液在室溫放置30min后5000r/min離心10min，分離出血清，-20℃保存。用針對hGH特異的ELISA方法測定各時(shí)間點(diǎn)血清中hGH含量。通過軟件PKSOLVER，計(jì)算各組主要藥代動力學(xué)參數(shù)。各組藥代動力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表4。

表4、hGH融合蛋白的藥代動力學(xué)參數(shù)

由結(jié)果看出，APG-3和APG-1融合蛋白的體內(nèi)半衰期分別為2.6和2.4小時(shí)，半衰期基本一致，這一點(diǎn)也可以從MRT參數(shù)中看出來，二者在體內(nèi)停留的時(shí)間也接近。從圖3的藥時(shí)曲線上發(fā)現(xiàn)APG-3的血藥濃度一直比APG-1高，推測可能是APG-3結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致了其藥代動力學(xué)的性質(zhì)發(fā)生了變化；APG-3的總體清除率只有APG-1的一半，表明APG-3的體內(nèi)清除相對慢，而APG-3的表觀分布容積是APG-1的兩倍，說明APG-1進(jìn)入體內(nèi)后迅速的分布到組織中，導(dǎo)致了其血藥濃度低于APG-3。表觀分布容積和總體清除率發(fā)生了改變，二者共同作用的結(jié)果是APG-3的血藥濃度比APG-1要高，同時(shí)藥物的體內(nèi)暴露量(AUC)也高。

APG-1經(jīng)過Fc位點(diǎn)的突變后，推測其比未突變的相比暴露量增加、清除率降低。APG-3在APG-1的基礎(chǔ)上增加了CTP的結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步降低清除率和增加AUC，在達(dá)到了上述兩個(gè)目的之后，由于引入了CTP剛性結(jié)構(gòu)又近一步降低了表觀分布容積，使其在組織中分布更少，血液中藥物含量更高，導(dǎo)致體內(nèi)暴露量更高，所以APG-3的結(jié)構(gòu)組合優(yōu)勢不僅體現(xiàn)在優(yōu)越的藥代參數(shù)上，而且其藥效可能也優(yōu)于APG-1，因?yàn)锳PG-3經(jīng)過改造后血藥濃度更高，意味著游離的藥物在體內(nèi)多于APG-1，所以APG-3的藥效好于APG-1，生物利用度更高，可以預(yù)期其臨床給藥劑量也將降低。由此可見，APG-3在生物學(xué)活性和藥代動力學(xué)方面表現(xiàn)出優(yōu)異的性能。

實(shí)施例7、融合蛋白的體內(nèi)生物學(xué)活性測定

選取4周齡SPF級雄性SD大鼠，體重60-80g,由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

試驗(yàn)前2周清潔條件下手術(shù)摘除垂體，去垂體手術(shù)后2周為恢復(fù)期，給藥前選擇大鼠體重變化小于手術(shù)前體重±10％的合格健康動物，去垂體大鼠按體重均勻隨機(jī)分為6組，5只/組。以短效rhGH(商品名norditropin，Novo Nordisk A/S生產(chǎn))作為本實(shí)驗(yàn)的陽性參照藥1(Y1)，比活3IU/mg；以PEG-rhGH(長春金賽藥業(yè)有限責(zé)任公司)作為陽性參照藥2(Y2)，比活6IU/mg；APG-3低、中、高劑量設(shè)定分別為5mg/kg/14d、15mg/kg/14d和45mg/kg/14d。根據(jù)分子量大小和摩爾數(shù)，APG-3的中劑量15mg/kg/14d與陽性參照藥Y1和Y2相當(dāng)。給藥方式為頸部皮下注射，不同劑量APG-3融合蛋白和Y2，每鼠于第1天和第8天各給藥1次；Y1每天給藥1次，連續(xù)14天。

給藥后每只大鼠每天稱重，第15天用二氧化碳窒息處死全部大鼠，稱重。每只動物第i天(di)體重(bw_i)與給藥前即第1天(d1)體重(bw₁)之差即增加的體重(必要時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可進(jìn)行尸檢，切開蝶鞍區(qū)，肉眼檢查有無垂體殘留，剔除有垂體殘存的動物)。體重增加計(jì)算公式：Δbw＝bw_i–bw₁，其中：Δbw為體重增重；bw₁為給藥前d1體重；bw_i為給藥后第i天體重。計(jì)量資料以均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差表示，結(jié)果見表5。圖4顯示了給藥后各組的生長曲線。

表5、hGH融合蛋白給藥前后大鼠體重變化(n＝7)

從結(jié)果可以看出，與模型組相比，在給藥后第8天各給藥組Δbw均顯著增加，但各給藥組間Δbw值差異不顯著；而在給藥后第15天，APG-3對大鼠的體重增長具有非常顯著的促進(jìn)作用，高劑量APG-3誘導(dǎo)垂體切除大鼠體重增加(Δbw值)是rhGH(Y1)和PEG-rhGH(Y2)組的約1.5倍；而中劑量APG-3誘導(dǎo)的體重增加略優(yōu)于Y1，與Y2基本一致。我們發(fā)現(xiàn)，APG-3高劑量組在第2次給藥后對大鼠體重增加，與PEG-rhGH組相比表現(xiàn)出更顯著的促進(jìn)作用，而在第1次給藥后一周內(nèi)，兩組的Δbw值卻不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。從這種差異性結(jié)果分析推測出APG-3相比PEG-rhGH應(yīng)具有更長的體內(nèi)活性半衰期，因此重復(fù)給藥后，這種體內(nèi)蓄積效應(yīng)使得APG-3組在第2次給藥后生長曲線的上升趨勢更陡峭。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。