本發(fā)明主要涉及核酸的化學(xué)合成的領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及將RNA寡核苷酸從固相載體切掉的方法。
背景技術(shù)：
：使用亞磷酰胺方法的固相合成方法已廣泛用于核酸(例如DNA寡核苷酸、RNA寡核苷酸等)的化學(xué)合成。在固相亞磷酰胺方法中，核酸合成通常通過以下步驟進(jìn)行。首先，使作為待合成的核酸的3'-端的核苷經(jīng)由3'-OH基團(tuán)與可裂解的接頭(例如琥珀?；?酯鍵鍵合，從而將其預(yù)先負(fù)載在用于固相合成的載體上(核苷接頭)。隨后，將其上負(fù)載有所述核苷接頭的所述用于固相合成的載體放在反應(yīng)柱中并置于核酸自動合成儀上。根據(jù)核酸自動合成儀的合成程序，通常在反應(yīng)柱中進(jìn)行包括以下步驟的合成反應(yīng)：(1)使用酸(例如三氯乙酸/二氯甲烷溶液等)移除受保護(hù)的核苷的5'-OH基團(tuán)的步驟；(2)在活化劑(四唑等)的存在下，使核苷亞磷酰胺(核酸單體)與去保護(hù)的5'-OH基團(tuán)偶聯(lián)的步驟；(3)使用乙酸酐等使未反應(yīng)的5'-OH基團(tuán)加帽的步驟；和(4)使用碘水等氧化亞磷酸的步驟。重復(fù)這個合成循環(huán)，且以從3'-端至5'-端的方向進(jìn)行寡核苷酸的延伸反應(yīng)，從而合成具有目標(biāo)序列的核酸。最后，使用氨水、甲胺溶液等水解可裂解的接頭，且將合成的核酸從所述用于固相合成的載體切除(非專利文件1)。此外，還報道了使用包含NaCl的氫氧化鈉水溶液進(jìn)行裂解(非專利文件2)。當(dāng)進(jìn)行上述的合成時，如上所述，需要通過可裂解的接頭將作為待成為3'-端的起始材料的核苷預(yù)先負(fù)載在用于固相合成的載體上。3'-端根據(jù)期望合成的核酸的序列而變化，在DNA寡核苷酸的情況下需要4種：dA、dG、dC、dT，且在RNA寡核苷酸的情況下需要4種：rA、rG、rC、rU。在要合成修飾的寡核苷酸時，因為需要預(yù)先處理以負(fù)載經(jīng)修飾的核苷的用于固相合成的載體，而使所述過程變得復(fù)雜。為了克服上述問題，已提出用于固相合成的負(fù)載有通用接頭的載體(通用支持物)，作為連接所述固相載體和所述起始材料的接頭，替代至今通常使用的核苷-琥珀酰接頭等。在使用通用支持物時，不考慮將成為期望合成的核酸的3'-端的核苷或核苷酸的種類，按照與一般核酸自動合成相同的那些步驟，通過待成為3'-端的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)開始合成，且在合成后，通過與常規(guī)方法相似的方法將目標(biāo)核酸從通用支持物切掉。有利地，如上所述，不需要用于固相合成的負(fù)載有各種核苷-接頭的載體。按照慣例，作為將RNA寡核苷酸從通用支持物切掉的方法，通常使用包括接觸烷基胺或氨水/烷基胺混合溶液的方法(專利文件1)。此外，近年來，已開發(fā)出包括接觸乙醇胺的方法(專利文件4)。但是，在這些方法中，不能有效地將RNA寡核苷酸從通用接頭切除，產(chǎn)生出大量副產(chǎn)物，且不能以良好的純度切掉目標(biāo)RNA寡核苷酸。也即，在將目標(biāo)RNA寡核苷酸從通用支持物切掉的方法中，僅固相載體被切割，不能良好地將RNA寡核苷酸從通用接頭切除，且有時產(chǎn)生副產(chǎn)物。盡管可以通過更強的親核試劑、更嚴(yán)苛的溫度條件等裂解RNA寡核苷酸和通用接頭之間的鍵，但所述裂解顯著促進(jìn)了RNA寡核苷酸的分解，這被認(rèn)為降低了目標(biāo)RNA寡核苷酸的產(chǎn)量。在另一方面，當(dāng)在溫和條件下進(jìn)行切割以嘗試提高RNA寡核苷酸的產(chǎn)量時，會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物，其中的RNA寡核苷酸和通用接頭沒有被切割。此外，因為所述副產(chǎn)物和所述目標(biāo)RNA寡核苷酸具有相似的特性(例如分子量、極性等)，通過例如層析等的分離和純化技術(shù)進(jìn)行純化成為了難題。主要由于這些原因，難以在RNA寡核苷酸的合成中使用通用支持物。文件列表專利文件[專利文件1]US5804683A[專利文件2]US20040147735A1[專利文件3]US7041817B2[專利文件4]WO2009140125A2[非專利文件][非專利文件1]CurrentProtocolsinNucleicAcidChemistry(2000)3.1.1-3.1.28[非專利文件2]NucleicAcidsResearch(1999)Vol.27,No.10。技術(shù)實現(xiàn)要素：[本發(fā)明要解決的問題]本發(fā)明的目的在于提供能夠抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生并增加目標(biāo)RNA寡核苷酸的產(chǎn)量的切除方法，在所述副產(chǎn)物中，RNA寡核苷酸沒有從通用接頭切掉，所述副產(chǎn)物是在將所述目標(biāo)RNA寡核苷酸從通用支持物切掉的過程中產(chǎn)生的。[解決問題的方式]本發(fā)明人已進(jìn)行了深入研究以試圖解決上述問題，并且發(fā)現(xiàn)通過在將目標(biāo)RNA寡核苷酸從通用支持物切掉的方法中，使固相寡核苷酸接觸含有烷基胺和一價無機鹽的水溶液，可以抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生并且可以提高目標(biāo)RNA寡核苷酸的產(chǎn)量，由此得以完成本發(fā)明。因此，本發(fā)明提供了以下方案。[1]將化學(xué)合成在通用支持物上的RNA寡核苷酸從所述支持物切掉的方法，其包括使所述載有RNA寡核苷酸的支持物與包含烷基胺和一價無機鹽的水溶液接觸的步驟。[2]在上述[1]中所述的方法，其中上述水溶液進(jìn)一步包含醇。[3]在上述[1]或[2]中所述的方法，其中上述烷基胺是伯烷基胺。[4]在上述[1]-[3]中任一項所述的方法，其中上述水溶液中包含的一價無機鹽的濃度是1-100mM。[5]RNA寡核苷酸的生產(chǎn)方法，包括：在通用支持物上化學(xué)合成RNA寡核苷酸的步驟；和根據(jù)上述[1]-[4]中任一項所述的方法將所述合成的RNA寡核苷酸從所述支持物切掉的步驟。[本發(fā)明的效果]本發(fā)明的RNA寡核苷酸切除方法可以抑制副產(chǎn)物的產(chǎn)生并且增加目標(biāo)RNA寡核苷酸的產(chǎn)量，在所述副產(chǎn)物中，所述目標(biāo)RNA寡核苷酸沒有從通用接頭切掉。附圖說明圖1顯示了在實施例1和比較實施例1中獲得的HPLC圖譜。具體實施方式通過參考其優(yōu)選實施方式，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋。本發(fā)明提供了將RNA寡核苷酸從通用支持物切掉的方法。也即，將RNA寡核苷酸單獨從負(fù)載在固相載體上的通用接頭和化學(xué)合成的RNA寡核苷酸的結(jié)合形式切掉的方法。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方式中，也可以在切掉RNA寡核苷酸的同時移除RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基團(tuán)。假定其反應(yīng)機理包括以下過程：(a)通過烷基胺將固相載體和通用接頭之間的酯鍵裂解而將固相載體移除，(b)作為(a)的結(jié)果，在通用接頭的氧上產(chǎn)生的負(fù)電荷與RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基團(tuán)中的磷原子形成新的PO鍵，(c)幾乎與(b)同時，RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基團(tuán)與糖骨架之間的PO鍵被裂解，從而移除RNA寡核苷酸的3'-端的磷酸基團(tuán)和通用接頭，最終獲得3'-端上的磷酸基團(tuán)被移除的RNA寡核苷酸。在過程(b)中，當(dāng)通用接頭的氧上產(chǎn)生的負(fù)電荷沒有與RNA寡核苷酸的3'-端上的磷酸基團(tuán)中的磷原子形成新的PO鍵，而是與反應(yīng)體系中存在的氫原子(質(zhì)子)形成OH鍵時，認(rèn)為產(chǎn)生了其中沒有將目標(biāo)RNA寡核苷酸從通用接頭切除的副產(chǎn)物。認(rèn)為可以通過使固相寡核苷酸與包含烷基胺和一價無機鹽的水溶液接觸，而有效地抑制導(dǎo)致過程(b)中產(chǎn)生副產(chǎn)物的反應(yīng)，這是本發(fā)明的特征。上述水溶液優(yōu)選包含醇。根據(jù)本發(fā)明，可以高效地切掉目標(biāo)RNA寡核苷酸，且可以實現(xiàn)RNA寡核苷酸生產(chǎn)成本的顯著降低。還可以實現(xiàn)由于高成本而至今尚不能實現(xiàn)的使用通用支持物的RNA寡核苷酸的大量合成。也即，可以使用一種通用支持物，按照一般核酸自動合成相同的那些步驟，通過待成為3'-端的核苷亞磷酰胺的反應(yīng)，來合成所期望合成的核酸，而不考慮在期望合成的核酸的3'-端上的核苷或核苷酸的種類。此外，可以以高純度切掉目標(biāo)RNA寡核苷酸，假定其有助于改善核酸藥物產(chǎn)品的質(zhì)量，所述核酸藥物產(chǎn)品是RNA寡核苷酸的主要工業(yè)用途。在本說明書中，“核酸”意為其中核苷酸通過磷酸二酯鍵連接的鏈化合物(寡核苷酸)，且包括DNA、RNA等。雖然核酸可以是單鏈和雙鏈中的任一種，但是因為可以使用核酸合成儀進(jìn)行高效合成，其優(yōu)選為單鏈。在本說明書中，“核酸”不僅包括包含嘌呤堿基(例如腺嘌呤(A)、鳥嘌呤(G)等)和嘧啶堿基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)、尿嘧啶(U)等)的寡核苷酸，還包括包含其他經(jīng)修飾的雜環(huán)類堿基的經(jīng)修飾的寡核苷酸。在本說明書中，“RNA寡核苷酸”是上述“核酸”，其在鏈中具有一個或多個核糖核苷酸單元。RNA寡核苷酸可以在鏈中的不少于10%、不少于20%、不少于30%、不少于40%、不少于50%、不少于60%、不少于70%、不少于80%、不少于90%、不少于95%或全部核苷酸單元中包含核糖核苷酸。盡管對RNA寡核苷酸的核苷酸長度沒有特別地限制，但其優(yōu)選地為2-200個核苷酸。當(dāng)核苷酸長度過長時，獲得的核酸的產(chǎn)量和純度降低。在本說明書中，“接頭”是指通過共價鍵連接兩種物質(zhì)的分子，且在核酸固相合成中連接固相載體和核酸。在本說明書中，“通用接頭”是不考慮期望合成的核酸的3'-端上的核苷或核苷酸的種類，可以按照一般核酸自動合成相同的那些步驟，使待成為3'-端的核苷亞磷酰胺與之反應(yīng)的接頭。為此，通用接頭通常具有兩個相鄰碳原子；所述碳原子之一具有作為核酸合成起點的-OH基團(tuán)，而另一個碳原子具有在移除保護(hù)基團(tuán)后成為親核基團(tuán)的基團(tuán)(例如-OH基團(tuán)、-NH2基團(tuán)、-SH基團(tuán))?？捎糜诒景l(fā)明的通用接頭的特定實例包括，但不限于，在下述實施例中使用的那些，在JP-A-2011-088843和JP-A-2013-177371中描述的那些，UnyLinker(注冊商標(biāo))(由IsisPharmaceuticals制造)等。在本說明書中的“通用支持物”是用于固相合成的載體，其載有通用接頭。對所述固相載體沒有特別地限制，只要其可以容易地通過使用過量的試劑洗滌而移除，例如，可以使用多孔合成聚合物載體，例如玻璃多孔載體、聚苯乙烯載體、丙烯酰胺載體等。固相載體優(yōu)選具有有助于核酸合成的官能團(tuán)。所述“有助于核酸合成”的官能團(tuán)是指能夠成為核酸合成的起點并且允許接頭添加的官能團(tuán)。其特定的實例包括氨基、羥基等。特定固相載體的實例包括在JP-A-2011-088843和JP-A-2013-177371中描述的那些等。在優(yōu)選的實施方式中，可以使用作為NittoPhase(注冊商標(biāo))(由NittoDenkoCorporation制造)可商購獲得的低膨脹聚苯乙烯顆粒。在本說明書中，“烷基胺”優(yōu)選為伯烷基胺，更優(yōu)選為甲胺、乙胺、丙胺或丁胺，最優(yōu)選地為甲胺。在本說明書中，“一價無機鹽”包括，例如，氯化鋰、氯化鉀、氯化鈉、溴化鈉、碘化鉀等。構(gòu)成一價無機鹽且具有更高的原子量陽離子和陰離子都傾向于顯示更好的本發(fā)明的效果?？紤]到效果、易操作性和易得性，溴化鈉是優(yōu)選的。在水溶液中包含的一價無機鹽的濃度優(yōu)選為1-100mM，更優(yōu)選為5-80mM。在本說明書中，“醇”優(yōu)選為甲醇、乙醇、丙醇(異丙醇)或丁醇。支鏈的存在與否沒有特別限制?？紤]到效果、易操作性和易得性，異丙醇是最優(yōu)選的。在水溶液中的醇含量優(yōu)選為1-80體積%，更優(yōu)選為3-60體積%。在本說明書中，“接觸”包括，例如浸漬、攪拌浸漬、液體通流、過濾等。在本說明書中，對包含烷基胺和一價無機鹽的水溶液與固相載體上的寡核苷酸接觸的優(yōu)選溫度和時間沒有特別限制。當(dāng)接觸溫度為20℃±5℃時，接觸時間優(yōu)選為1-24小時，且當(dāng)接觸溫度為40℃±5℃時，接觸時間優(yōu)選為0.25-6小時。本發(fā)明還提供了RNA寡核苷酸的生產(chǎn)方法，其使用上述的本發(fā)明的切除方法。所述生產(chǎn)方法包括在上述通用支持物上化學(xué)合成RNA寡核苷酸的步驟(核酸合成反應(yīng))，和通過上述的切除方法將合成的RNA寡核苷酸從所述支持物切掉的步驟。在本說明書中，“核酸合成反應(yīng)”意為具體組成核酸的核苷酸的延伸反應(yīng)。也即，核苷循序地結(jié)合至結(jié)合在固相載體上的核苷、核苷酸或寡核苷酸，以給出延伸的寡核苷酸。核酸合成反應(yīng)的實例包括H-膦酸酯法、磷酸酯法、固相亞磷酰胺法等。在這些方法中，固相亞磷酰胺方法是優(yōu)選的，因為核酸顯示出高可合成性且可以獲得高純度的核酸。通過固相亞磷酰胺法的核酸合成反應(yīng)的優(yōu)選實施方式包括包含以下步驟的每一步的方法：(a)將通用支持物放置于核酸自動合成儀的反應(yīng)柱中的步驟；(b)使酸(例如二氯乙酸溶液等)流過反應(yīng)柱以移除羥基保護(hù)基團(tuán)，并洗滌的步驟；(c)進(jìn)行將對應(yīng)于3'-端并通過四唑等活化的核苷亞磷酰胺偶聯(lián)至上述羥基，使未反應(yīng)的羥基加帽，和氧化亞磷酸酯的一系列步驟，和重復(fù)所述系列直到獲得目標(biāo)序列的步驟；和(d)在使用儀器完成合成步驟后，按照上述的本發(fā)明的切除方法處理用于核酸固相合成的載體，而獲得目標(biāo)RNA寡核苷酸的步驟。實施例以下通過參考實施例，對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的解釋，所述實施例不應(yīng)理解為限制性的。[實驗1](RNA寡核苷酸的合成)以對應(yīng)于1μmol的通用接頭的量，將結(jié)合以下(A)-(D)的通用接頭的通用支持物(NittoPhase(注冊商標(biāo))(由NittoDenkoCorporation制造))分別填充至反應(yīng)柱中，并且使用核酸合成儀nS-8II(由GeneDesign,Inc.制造)合成21mer的RNA寡核苷酸(5'r(CGAGAAGCGCGAUACCAUGU)dT3')(SEQIDNO:1)。(A)下圖的結(jié)合UnyLinker(注冊商標(biāo))(由IsisPharmaceuticals制造)的通用支持物(B)下圖的通用支持物(C)下圖的通用支持物(D)下圖的通用支持物。[實施例1]在通過使用(A)的通用支持物合成RNA寡核苷酸后，將與RNA寡核苷酸結(jié)合的固相載體于45℃在包含20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液中浸漬4小時，從而將RNA寡核苷酸從固相載體切掉。依次向該溶液添加二甲亞砜和三乙胺三氟化氫，且將混合物在45℃加熱1.5小時以移除RNA2'-端保護(hù)基團(tuán)(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保護(hù)基團(tuán))。向該溶液添加50mM乙酸鈉溶液，且將所述混合物用水稀釋以給出RNA寡核苷酸樣品溶液。[實施例2-4]除了將(A)的通用支持物換為(B)的通用支持物之外，以如實施例1中相同方法，獲得實施例2的RNA寡核苷酸樣品溶液。除了將(A)的通用支持物換為(C)的通用支持物之外，以如實施例1中相同方法，獲得實施例3的RNA寡核苷酸樣品溶液。除了將(A)的通用支持物換為(D)的通用支持物之外，以如實施例1中相同方法，獲得實施例4的RNA寡核苷酸樣品溶液。[比較實施例1]在通過使用(A)的通用支持物合成RNA寡核苷酸后，將與RNA寡核苷酸連接的固相載體于65℃在28%氨水/40%甲胺水溶液的(1:1)混合溶液中浸漬1.5小時，從而將RNA寡核苷酸從固相載體切掉。依次向該溶液添加二甲亞砜和三乙胺三氟化氫，且將混合物在65℃加熱1.5小時以移除RNA2'-端保護(hù)基團(tuán)(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保護(hù)基團(tuán))。向該溶液添加50mM乙酸鈉溶液，且將所述混合物用水稀釋以給出RNA寡核苷酸樣品溶液。[比較實施例2-4]除了將(A)的通用支持物換為(B)的通用支持物之外，以如比較實施例1中相同方法，獲得比較實施例2的RNA寡核苷酸樣品溶液。除了將(A)的通用支持物換為(C)的通用支持物之外，以如比較實施例1中相同方法，獲得比較實施例3的RNA寡核苷酸樣品溶液。除了將(A)的通用支持物換為(D)的通用支持物之外，以如比較實施例1中相同方法，獲得比較實施例4的RNA寡核苷酸樣品溶液。(測量RNA寡核苷酸純度和副產(chǎn)物的量)通過吸收分光光度計測量在實施例1-4和比較實施例1-4中獲得的RNA寡核苷酸樣品溶液的吸光度(OD/μmol：OD/1μmol的通用接頭)。此外，通過高效液相層析(HPLC)測量在實施例1-4和比較實施例1-4中獲得的RNA寡核苷酸樣品溶液(測量條件：柱：WatersXBridgeOSTC182.5μm50×4.6mm，UV檢測：260nm，緩沖液A：在水中100mMHFIP/7mMTEA,pH8.0，緩沖液B：甲醇，溫度：60℃)。實施例1和比較實施例1中獲得的HPLC圖譜顯示在圖1中。在圖1中，目標(biāo)RNA寡核苷酸的保留時間為大約14.8分鐘，且連接至RNA寡核苷酸的通用接頭的副產(chǎn)物的保留時間被檢測為大約16.2分鐘。表1顯示了實驗1中獲得的數(shù)據(jù)。在實施例中，證實了作為RNA寡核苷酸產(chǎn)量的指標(biāo)的OD×FLP((每1μmol通用接頭的吸光度:OD:光密度)×(通過HPLC測量的目標(biāo)RNA寡核苷酸的純度:FLP:全長純度))增加，且其中通用接頭與目標(biāo)RNA寡核苷酸結(jié)合的副產(chǎn)物的產(chǎn)生被抑制。在另一個方面，證實在比較實施例中RNA寡核苷酸純度低于實施例中的RNA寡核苷酸純度，且副產(chǎn)物的量高。表1。[實驗2](RNA寡核苷酸的合成)以對應(yīng)于151μmol通用接頭的量，將(A)的通用支持物填充至反應(yīng)柱中，且使用核酸合成儀AKTAoligopilotplus100(由GEHealthcareJapan制造)合成21mer的RNA寡核苷酸(5'r(CGAGAAGCGCGAUACCAUGU)dT3')(SEQIDNO:1)。[實施例5-11]制備具有以下組成的水溶液(切除試劑)。實施例5:(E)含有20mM氯化鋰的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例6:(F)含有20mM氯化鉀的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例7:(G)含有20mM碘化鉀的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例8:(H)含有20mM氯化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例9:(I)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例10:(J)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/乙醇(1:1)混合溶液實施例11:(K)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液。將其中結(jié)合上述RNA寡核苷酸的固相載體于45℃在上述的切除試劑(E)-(K)中浸漬2小時，從而將RNA寡核苷酸從所述固相載體切掉。依次向該溶液添加二甲亞砜和三乙胺三氟化氫，且將混合物在60℃加熱1小時以移除RNA2'-端保護(hù)基團(tuán)(叔丁基二甲氧基甲硅烷基保護(hù)基團(tuán))。向該溶液添加50mM乙酸鈉溶液，且將所述混合物用水稀釋以給出RNA寡核苷酸樣品溶液。[比較實施例5-7]除了制備具有以下組成的水溶液(切除試劑)，以如比較實施例5中相同方法，獲得RNA寡核苷酸樣品溶液。比較實施例5:(L)40%甲胺水溶液比較實施例6:(M)40%甲胺水溶液/28%氨水(1:1)混合溶液比較實施例7:(N)40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液。(測量RNA寡核苷酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物的量)在與實施例1-4和比較實施例1-4中相似的條件下，通過高效液相層析(HPLC)測量在實施例5-11和比較實施例5-7中獲得的RNA寡核苷酸樣品溶液。表2顯示了在實驗2中獲得的數(shù)據(jù)。在實施例中，證實了作為RNA寡核苷酸產(chǎn)量的指標(biāo)的峰面積/nmol(每1nmol通用接頭的RNA寡核苷酸的HPLC峰面積)增加，且其中通用接頭與目標(biāo)RNA寡核苷酸結(jié)合的副產(chǎn)物的產(chǎn)生被抑制。表2。[實驗3]制備具有以下組成的水溶液(切除試劑)。實施例12:(O)含有10mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例13:(P)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例14:(Q)含有30mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(1:1)混合溶液實施例15:(R)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(9:1)混合溶液實施例16:(S)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(8:2)混合溶液實施例17:(T)含有20mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(6:4)混合溶液實施例18:(U)含有60mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(95:5)混合溶液實施例19:(V)含有60mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(9:1)混合溶液實施例20:(W)含有60mM溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(8:2)混合溶液。將在實驗2中獲得的其中結(jié)合RNA寡核苷酸的固相載體于45℃在實施例12-17的切除試劑((O)-(T))中浸漬2小時，和于23℃在實施例18-20的切除試劑((U)-(W))中浸漬4小時，從而將RNA寡核苷酸從固相載體切掉。依次向該溶液添加二甲亞砜和三乙胺三氟化氫，且將實施例12-14((O)-(Q))在60℃加熱1小時，和將實施例15-20((R)-(W))在45℃加熱1.5小時，以移除RNA2'-端保護(hù)基團(tuán)和TBDMS保護(hù)基團(tuán)。向這些溶液添加50mM乙酸鈉溶液，且將所述混合物用水稀釋以給出RNA寡核苷酸樣品溶液。(測量RNA寡核苷酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物的量)以如實施例5-11和比較實施例5-7中相同的方式進(jìn)行測量。表3顯示了實驗3中獲得的數(shù)據(jù)。在實施例中，證實作為RNA寡核苷酸產(chǎn)量的指標(biāo)的峰面積/nmol(每1nmol通用接頭的RNA寡核苷酸的HPLC峰面積)增加，且其中通用接頭與目標(biāo)RNA寡核苷酸結(jié)合的副產(chǎn)物的產(chǎn)生被抑制。表3。[實驗4](RNA寡核苷酸的合成)以對應(yīng)于80μmol通用接頭的量，將(A)的通用支持物填充至反應(yīng)柱中，且使用核酸合成儀AKTAoligopilotplus100(由GEHealthcareJapan制造)合成19mer的RNA寡核苷酸(5'-r(CCAUUAACGAGCUGCUUAA)-3'(SEQIDNO:2)。相似地，以對應(yīng)于80μmol通用接頭的量，將(A)的通用支持物填充至反應(yīng)柱中，且使用核酸合成儀AKTAoligopilotplus100(由GEHealthcareJapan制造)合成19mer的RNA寡核苷酸(5'-r(UUAAGCAGCUCGUUAAUGG)-3'(SEQIDNO:3)。(將RNA寡核苷酸從固相載體切掉)制備具有以下組成的水溶液(切除試劑)。切除試劑(X):含有80M溴化鈉的40%甲胺水溶液/異丙醇(8:2)混合溶液。在實施例21中，將如上文所述獲得的結(jié)合SEQIDNO:2的RNA寡核苷酸的固相載體于25℃在切除試劑(X)中浸漬18小時，從而將所述RNA寡核苷酸從所述固相載體切掉。在實施例22中，將如上文所述獲得的結(jié)合SEQIDNO:3的RNA寡核苷酸的固相載體于25℃在切除試劑(X)中浸漬14小時，從而將所述RNA寡核苷酸從所述固相載體切掉。依次向這些溶液添加二甲亞砜和三乙胺三氟化氫，且將混合物在65℃加熱1.5小時以移除RNA2'-端保護(hù)基團(tuán)和TBDMS保護(hù)基團(tuán)。向這些溶液添加50mM乙酸鈉溶液，且將所述混合物用水稀釋以給出RNA寡核苷酸樣品溶液。(測量RNA寡核苷酸產(chǎn)量和副產(chǎn)物的量)以如實施例5-11和比較實施例5-7中相同方式進(jìn)行測量。表4顯示了實驗4中獲得的數(shù)據(jù)。在實施例21和22中，證實作為RNA寡核苷酸產(chǎn)量的指標(biāo)的峰面積/nmol(每1nmol通用接頭的RNA寡核苷酸的HPLC峰面積)增加，且其中通用接頭與目標(biāo)RNA寡核苷酸結(jié)合的副產(chǎn)物的產(chǎn)生被抑制。表4峰面積/nmolFLP(%)副產(chǎn)物(%)實施例21481064371.22實施例22512820075.93本申請是基于在日本提交的專利申請?zhí)?015-123222(提交日期：2015年6月18日)，其內(nèi)容以其整體并入本文。當(dāng)前第1頁1 2 3