本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及一種天然化合物及其從三白草中分離出來的制備方法，還涉及它在急性胃潰瘍損傷中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

三白草，學(xué)名：Saururus chinensis(Lour.)Baill，別稱塘邊藕。分布于河北、河南、山東和長江流域及其以南各地。本品根莖呈圓柱形，稍彎曲，有分枝。全株藥用，內(nèi)服治尿路感染、尿路結(jié)石、腳氣水腫及營養(yǎng)性水腫；外敷治癰瘡癤腫、皮膚濕疹等。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種化合物，該天然產(chǎn)物可以協(xié)同治療急性胃潰瘍損傷；同時(shí)，本發(fā)明還在于提供一種上述化合物從三白草中分離出來的制備方法；并且還提供該化合物在制備治療急性胃潰瘍損傷的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：

一種具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，

上述化合物(Ⅰ)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：(a)將三白草粉碎，用80～90％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85％乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)。

作為優(yōu)選，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。

上述的化合物(Ⅰ)在制備治療急性胃潰瘍損傷的藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明提供一種結(jié)構(gòu)新穎的天然產(chǎn)物，該天然產(chǎn)物單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)急性胃潰瘍損傷具有治療作用；另外，該天然產(chǎn)物還可以和其他現(xiàn)有藥物組合用藥，可以開發(fā)成治療急性胃潰瘍損傷的藥物。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。

實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證

試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。

分離方法：(a)將三白草(2kg)粉碎，用85％乙醇熱回流提取(15L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用85％乙醇洗脫12個(gè)柱體積，收集85％洗脫液，減壓濃縮得85％乙醇洗脫濃縮物；(c)步驟(b)中85％乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1(12個(gè)柱體積)、50:1(10個(gè)柱體積)、25:1(8個(gè)柱體積)和12:1(8個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為20:1(6個(gè)柱體積)、12:1(8個(gè)柱體積)和2:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88％的甲醇水溶液等度洗脫，收集13～16個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(Ⅰ)(HPLC歸一化純度大于98％)。

結(jié)構(gòu)確證：HR-ESI-MS顯示[M+H]⁺為m/z 405.1470，結(jié)合核磁特征可得分子式為C₂₁H₂₄O₈，不飽和度為10。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δ_H(ppm，CDCl₃，500MHz)：H-2(6.18，d，J＝6.8Hz)，H-3(3.79，d，J＝6.8Hz)，H-5(2.66，d，J＝6.8Hz)，H-6(4.57，dd，J＝6.8，9.6Hz)，H-7(3.11，ddt，J＝9.6，3.5，3.3Hz)，H-8(5.14，ddd，J＝9.6，4.7，4.7Hz)，H-9a(2.57，dd，J＝14.0，4.7Hz)，H-9b(2.43，dd，J＝14.0，4.7Hz)，H-13a(6.01，d，J＝3.5Hz)，H-13b(5.51，d，J＝3.5Hz)，H-14a(5.14，s)，H-14b(5.06，s)，H-15a(4.75，d，J＝12.5Hz)，H-15b(4.33，d，J＝12.5Hz)，H-3’a(6.02，s)，H-3’b(5.62，s)，H-4’(1.95，s)，15-OAc(2.05，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δ_C(ppm，CDCl₃，125MHz)：141.2(C，1-C)，117.8(CH，2-C)，83.4(CH，3-C)，83.4(C，4-C)，57.4(CH，5-C)，77.2(CH，6-C)，48.7(CH，7-C)，74.6(CH，8-C)，38.7(CH₂，9-C)，137.8(C，10-C)，134.9(C，11-C)，168.2(C，12-C)，121.3(CH₂，13-C)，116.4(CH₂，14-C)，67.2(CH₂，15-C)，164.6(C，1’-C)，136.1(C，2’-C)，122.4(CH₂，3’-C)，18.1(CH₃，4’-C)，172.8(C，15-COCH₃)，21.7(CH₃，15-COCH₃)。紅外光譜表明該化合物含有五元內(nèi)酯環(huán)(1765cm^-1)和羥基(3600cm^-1)。¹³C-NMR和HSQC譜顯示21個(gè)碳信號(hào)，包括兩個(gè)甲基(一個(gè)乙酰甲基)，五個(gè)亞甲基(一個(gè)連氧亞甲基，三個(gè)烯屬亞甲基)，六個(gè)次甲基(三個(gè)連氧碳和一個(gè)烯屬碳)以及八個(gè)季碳(三個(gè)酯羰基，四個(gè)烯烴季碳以及一個(gè)連氧季碳)。¹H-NMR顯示兩個(gè)特征性的單質(zhì)子雙峰信號(hào)[δ_H6.01(1H，d，J＝3.5Hz，H-13a)和5.51(1H，d，J＝3.5Hz，H-13b)]，且都與H-7[δ_H3.11(1H，ddt，J＝9.6，3.5，3.3Hz)]相連，證實(shí)了α-亞甲基-γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的存在。此外，H-6和H-7的耦合常數(shù)(J_6,7＝9.6Hz)以及H-7和H-13的烯丙基耦合常數(shù)(J_7,13＝3.5Hz)表明內(nèi)酯為反式連接。七元環(huán)環(huán)外雙鍵信號(hào)[δ_H5.14(1H，s，H-14a)和5.06(1H，s，H-14b)]。兩個(gè)單峰質(zhì)子信號(hào)δ_H6.02和5.62(H-3’a和H-3’b)，以及三個(gè)質(zhì)子形成的一個(gè)尖銳單峰信號(hào)δ_H1.95(CH₃-4’)表明該化合物含有一個(gè)2-甲基丙烯酰氧基側(cè)鏈。HMBC譜中H-8(δ_H5.14)與羰基碳C-1’(δ_C164.6)的相關(guān)性表明側(cè)鏈位于C-8位。同時(shí)，H₂-15與C-COCH₃的相關(guān)性說明C-15位連有一個(gè)乙酰氧基。根據(jù)上述核磁數(shù)據(jù)可知該化合物為一個(gè)倍半萜類化合物。通過查閱文獻(xiàn)可以發(fā)現(xiàn)該化合物和已知化合物2α3β4α-trihydroxy-4β-(acetoxymethyl)-8α(4-methacrylate)-1αH,5αH,6βH,7αH-guai-10(14),11(13)-dien-6,12-olide具有相似的結(jié)構(gòu)。比較兩者的核磁數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，該新化合物和已知化合物的區(qū)別在于，新化合物多出了一個(gè)雙鍵信號(hào)。進(jìn)一步的HMBC譜解析，H-2與C-1，H-3與C-2以及H-5與C-2的相關(guān)性說明多出來的雙鍵信號(hào)是位于C-1和C-2位的。NOESY譜中，H-3/H-5，H-5/H-7之間的相關(guān)性說明該化合物中的3-OH，以及C-7位上的基團(tuán)是位于β位的。此外，H-15/H-6，H-6/H-13以及H-8/H-6的相關(guān)性說明4-OH，C-6位上的基團(tuán)以及C-8位上的基團(tuán)是位于α位的。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如下所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致。該化合物化學(xué)式及碳原子編號(hào)如下：

實(shí)施例2：藥理作用

本實(shí)施例采用乙醇制備小鼠急性胃粘膜損傷模型，測定胃粘膜損傷指數(shù)包括小鼠胃組織SOD活性、MAD及PEG₂含量，觀察藥物對(duì)急性胃黏膜損傷的治療作用。

1、材料與方法

1.1動(dòng)物

昆明小鼠，(25±4)g，雌雄各半，山東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供。

1.2試劑與樣品

嗎氯貝胺購自中國藥品生物制品檢定所?；衔?Ⅰ)自制，制備方法見實(shí)施例1。三九胃泰顆粒購自三九醫(yī)藥股份有限公司。超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒、丙二醛(MAD)試劑盒均購自上海藍(lán)基生物科技有限公司。

1.3儀器

紫外可見分光光度計(jì)(型號(hào)：UV-2450/2550)，日本島津公司生產(chǎn)。

1.4小鼠分組及模型制備

選取健康小鼠60只(雌雄各半)，隨機(jī)分為6組，分別為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組(三九胃泰顆粒)和嗎氯貝胺組(80mg·kg^-1)、化合物(Ⅰ)組(80mg·kg^-1)、嗎氯貝胺與化合物(Ⅰ)組合物組【40mg·kg^-1嗎氯貝胺+40mg·kg^-1化合物(Ⅰ)】。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組給予生理鹽水，其他給藥連續(xù)灌胃10d。末次給藥后禁食不進(jìn)水24h，在最后一次給藥1h后，除空白對(duì)照組外，每只均灌胃給無水乙醇，按0.1mL/10g給藥。

1.5胃組織SOD活性、MAD含量測定

胃大體標(biāo)本的制備：動(dòng)物處死后，將其置于冰盒上，快速取全胃，沿胃大彎剪開，用生理鹽水沖洗胃壁內(nèi)側(cè)，展平置于體顯微鏡下觀察胃粘膜損傷程度。根據(jù)試劑盒說明測定組織SOD活性、MAD含量測定。

1.6胃組織PGE₂含量測定

取胃組織勻漿2mL，4℃3000rpm離心15min后取上清液，以放射法測定PGE₂含量。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用Excel工作表進(jìn)行分析，各試驗(yàn)組與對(duì)照組之間采用t檢驗(yàn)進(jìn)行比較。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1對(duì)急性胃粘膜損傷模型小鼠胃組織中SOD、MAD、PGE₂含量的影響

與空白對(duì)照組比，模型對(duì)照組SOD含量降低(P<0.05)、MAD含量升高(P<0.05)、PGE₂含量降低(P<0.05)，說明造模成功；與模型對(duì)照組比，陽性對(duì)照組SOD含量顯著升高(P<0.01)、MAD含量顯著降低(P<0.01)、PGE₂含量升高(P<0.05)；與模型對(duì)照組比，嗎氯貝胺與化合物(Ⅰ)組合物組SOD含量顯著升高(P<0.01)、MAD含量顯著降低(P<0.01)、PGE₂含量顯著升高(P<0.01)；與模型對(duì)照組比，嗎氯貝胺組、化合物(Ⅰ)組SOD含量升高(P<0.05)、MAD含量降低(P<0.05)、PGE₂含量升高(P<0.05)。

試驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1對(duì)急性胃粘膜損傷模型小鼠胃組織中SOD、MAD、PGE₂含量的影響

急性胃粘膜損傷是臨床常見的急癥，近幾年發(fā)現(xiàn)病理機(jī)制主要是內(nèi)源及外源性攻擊因子和胃粘膜保護(hù)機(jī)制的平衡關(guān)系失衡，目前已證實(shí)，OH·自由基和O·自由基與多種類型的胃粘膜損傷有關(guān)，研究認(rèn)為O·自由基既參與組織細(xì)胞的損傷過程，也是細(xì)胞正常代謝的中間產(chǎn)物。由于氧自由基與胃粘膜損傷有關(guān)，即參與組織細(xì)胞的損傷也是細(xì)胞正常代謝產(chǎn)物。MAD含量的高低間接反映了機(jī)體受氧自由基攻擊的程度，SOD能消除自由基，其活性高低間接反映了機(jī)體清除氧自由基的能力。PGE2有抑制胃酸分泌的作用，并且能促進(jìn)胃粘液分泌并增加胃粘膜血流量而發(fā)揮保護(hù)作用，所以其含量高低反映了對(duì)胃粘膜的保護(hù)能力。

上述結(jié)果表明，嗎氯貝胺、化合物(Ⅰ)單獨(dú)作用時(shí)，對(duì)急性胃潰瘍損傷具有保護(hù)作用；嗎氯貝胺和化合物(Ⅰ)聯(lián)合作用時(shí)，對(duì)急性胃潰瘍損傷的保護(hù)作用進(jìn)一步增強(qiáng)，可以開發(fā)成治療急性胃潰瘍損傷的藥物。

上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。