本發(fā)明涉及一種從苦瓜中提取雷公藤紅素的方法，屬于植物活性成分提取技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

雷公藤紅素分子式為C₂₉H₃₈O₄，又名南蛇藤素，是一種從衛(wèi)矛科雷公藤屬及南蛇藤屬植物中分離出的活性較高的五環(huán)三萜類物質(zhì)，其具有很強(qiáng)的抗炎、免疫抑制及抗腫瘤等藥理活性。自中美科學(xué)家發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素的抗腫瘤新機(jī)制以來，引發(fā)了雷公藤紅素的抗癌活性研究熱潮。

目前，世界上雷公藤紅素主要是從衛(wèi)矛科植物中提取。雷公藤紅素在植物中的含量很低,基本上在0.001％左右,因此往往需要繁瑣的提取過程。因此選擇合適的原料，摸索合適的方法，對雷公藤紅素工業(yè)制備意義重大。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決雷公藤紅素提取方法復(fù)雜和原材料范圍局限的問題，本發(fā)明提供了一種從苦瓜中提取雷公藤紅素的方法，采取的技術(shù)方案如下：

本發(fā)明的目的在于提供一種從苦瓜中提取雷公藤紅素的方法，該方法是將苦瓜粉碎后利用乙醇進(jìn)行回流提取獲得濃縮液，將濃縮液與硅膠進(jìn)行混合拌勻后獲得顆粒原料，再向利用二氯甲烷-甲醇溶液制備好的分離柱中加入顆粒原料，再利用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，脫水減壓濃縮后洗滌獲得雷公藤紅素。

所述方法的步驟如下：

1)將苦瓜粉碎成2～5mm的小段；

2)利用乙醇對步驟1)所得的苦瓜小段進(jìn)行回流提取后獲得濃縮液；

3)將步驟2)所得的濃縮液與60-80目硅膠按1:1的體積比混合拌勻后干燥，獲得顆粒原料；

4)利用二氯甲烷-甲醇溶液平衡制備的200～300目硅膠分離柱后，將步驟3)所得的顆粒原料加入到分離柱中，加入洗脫劑進(jìn)行洗脫；

5)收集步驟4)所得洗脫液，脫去洗脫劑水分后減壓回收洗脫劑，再利用甲醇或無水乙醇洗滌后獲得雷公藤紅素。

優(yōu)選地，步驟2)所述乙醇，為90～100％的乙醇。

優(yōu)選地，步驟2)所述回流提取，是將苦瓜和乙醇按照苦瓜質(zhì)量(Kg)：乙醇體積(L)＝1:10～30進(jìn)行混合后，在60～80℃下提取5～10h。

優(yōu)選地，步驟4)所述二氯甲烷-甲醇溶液，二氯甲烷與甲醇的體積比為25～15:1。

優(yōu)選地，步驟4)所述將顆粒原料加入到分離柱中，是按照質(zhì)量比為顆粒原料：硅膠＝1:2～4。

優(yōu)選地，步驟4)所述洗脫劑為二氯甲烷-甲醇溶液與氨水的混合液，其中二氯甲烷-甲醇溶液與氨水的體積比二氯甲烷-甲醇：氨水＝100：0.1～0.5的比例混合。

更優(yōu)選地，所述二氯甲烷-甲醇溶液，體積比為二氯甲烷：甲醇＝20～5：1。

所述方法的具體步驟如下：

1)將苦瓜粉碎成2～5mm的小段；

2)利用90～100％的乙醇對步驟1)所得的苦瓜小段按照苦瓜質(zhì)量(Kg)：乙醇體積(L)＝1:10～30進(jìn)行混合后在60～80℃下回流提取5～10h，提取后獲得濃縮液；

3)將步驟2)所得的濃縮液與60-80目硅膠按照1:1的體積比混合拌勻后干燥，獲得顆粒原料；

4)利用按照體積比為二氯甲烷：甲醇＝25～15:1混合獲得的二氯甲烷-甲醇溶液平衡制備的200～300目硅膠分離柱后，將步驟3)所得的顆粒原料按照質(zhì)量比為顆粒原料：硅膠＝1:2～4加入到分離柱中，加入二氯甲烷-甲醇與氨水的混合液作為洗脫劑進(jìn)行洗脫；所述二氯甲烷-甲醇溶液與氨水的混合液中二氯甲烷-甲醇溶液與氨水的體積比二氯甲烷-甲醇：氨水＝100：0.1～0.5；

5)收集步驟4)所得洗脫液，加入無水硫酸鈉脫去水分后在40～60℃下減壓回收洗脫劑獲得雷公藤紅素純品，再用甲醇或無水乙醇洗滌后獲得雷公藤紅素純品。

以上所述任一方法在制備含有雷公藤紅素的藥品中的應(yīng)用。

本發(fā)明獲得的有益效果：

使用苦瓜為原料，降低成本原料易得；采用高濃度乙醇提取，目標(biāo)成分提取徹底，而大極性及水溶性雜質(zhì)較少，簡化了純化步驟；硅膠柱純化步驟采用堿性二氯甲烷-甲醇體系作為洗脫劑，是產(chǎn)品色帶集中，一步洗脫可得到純品的雷公藤紅素。綜上，本發(fā)明具有工藝簡單、高效、環(huán)保、收率高、產(chǎn)量大的有點(diǎn)，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

附圖說明

圖1為雷公藤標(biāo)準(zhǔn)品的液相色譜圖。

圖2為實(shí)施例1提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

圖3為實(shí)施例2提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

圖4為實(shí)施例3提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

圖5為實(shí)施例4提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

圖6為實(shí)施例6提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

圖7為實(shí)施例7提取的雷公藤樣品的液相色譜圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。

以下實(shí)施例所用材料、試劑、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)材料、試劑、儀器和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。

實(shí)施例1

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

1)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

2)用濃度為90％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:10，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為5h；提取液于60℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

3)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

4)將200～300目硅膠置于體積比為25:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為15cm，用體積比為25:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:2的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為20:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.1，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于40℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為98.6％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖2所示，圖形中雜波很少，最高峰在12.754分鐘，與圖1中的最高峰時(shí)間13.008分鐘很接近，且為峰型尖銳對稱的單一峰，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素純度很高。

實(shí)施例2

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

1)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

2)用濃度為92％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:15，提取溫度為65℃，提取時(shí)間為6h；提取液于62℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

3)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

4)將200～300目硅膠置于體積比為22:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為18cm，用體積比為22:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:3的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為20:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.2，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于45℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為98.5％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖3所示，圖形中雜波很少，最高峰在12.754分鐘，與圖1中的最高峰時(shí)間13.008分鐘很接近，且為峰型尖銳對稱的單一峰，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素純度很高。

實(shí)施例3

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

1)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

2)用濃度為95％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:20，提取溫度為70℃，提取時(shí)間為7h；提取液于65℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

3)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

4)將200～300目硅膠置于體積比為20:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為20cm，用體積比為20:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:3的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為20:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.3，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于50℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為98.9％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖4所示，圖形中雜波很少，最高峰在12.754分鐘，與圖1中的最高峰時(shí)間13.008分鐘很接近，且為峰型尖銳對稱的單一峰，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素純度很高。

實(shí)施例4

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

1)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

2)用濃度為98％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:25，提取溫度為75℃，提取時(shí)間為8h；提取液于68℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

3)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

4)將200～300目硅膠置于體積比為18:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為22cm，用體積比為18:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:4的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為18:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.4，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于55℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為98.4％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖5所示，圖形中雜波很少，最高峰在12.754分鐘，與圖1中的最高峰時(shí)間13.008分鐘很接近，且為峰型尖銳對稱的單一峰，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素純度很高。

實(shí)施例5

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

1)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

2)用濃度為100％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:30，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為10h；提取液于70℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

3)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

4)將200～300目硅膠置于體積比為15:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為25cm，用體積比為15:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:2的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為15:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.5，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于60℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為98.3％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖6所示，圖形中雜波很少，最高峰在12.754分鐘，與圖1中的最高峰時(shí)間13.008分鐘很接近，且為峰型尖銳對稱的單一峰，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素純度很高。

實(shí)施例6

本實(shí)施例按以下步驟制備雷公藤紅素單體：

5)備料：將苦瓜粉碎成2～5mm的段。

6)用濃度為100％的乙醇對粉碎好的苦瓜段進(jìn)行回流提取，苦瓜的質(zhì)量(kg)與乙醇的體積(L)的比例為1:9，提取溫度為80℃，提取時(shí)間為10h；提取液于70℃減壓回收乙醇，得濃縮液。

7)將上述步驟(2)獲得的濃縮液用60～80目硅膠按1:1拌樣，干燥成分散狀顆粒后得到顆粒狀原料，備用。

8)將200～300目硅膠置于體積比為15:1的二氯甲烷-甲醇溶液中濕法裝柱，分離株直徑為25cm，用體積比為15:1的二氯甲烷-甲醇溶液分離平衡柱；平衡好后，按質(zhì)量比為原料：硅膠＝1:2的比例上顆粒狀原料；然后用洗脫劑進(jìn)行梯度洗脫，洗脫劑由體積比為15:1～5:1的二氯甲烷-甲醇溶液和氨水組成，二氯甲烷-甲醇溶液于氨水的體積比例為100:0.5，洗脫劑中還加入少量無水硫酸鈉以脫去洗脫劑中的水分；收集洗脫液，得到雷公藤紅素粗溶液；將雷公藤紅素粗溶液于60℃減壓回收洗脫劑，得到雷公藤紅素純品；將雷公藤紅素純品用甲醇或無水乙醇洗滌，得到雷公藤紅素單體，為紅色結(jié)晶狀粉末。

色譜分析：將雷公藤紅素單體用反相高效液相色譜柱分離(RP-HPLC)，分析液相檢測，其純度為64.1％。色譜柱填料為C18，粒度5μm，流動相為含1％醋酸的87％(體積百分比濃度)甲醇水溶液，檢測波長為425nm，流速1ml/min。本實(shí)施實(shí)例的雷公藤紅素的液相色譜圖如圖7所示，圖形中雜波很多，在13.008分鐘沒有尖峰，且為峰型不單一，雜峰多，表明本實(shí)施案例的雷公藤紅素沒有被提取出來。

雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。