本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌高效表達(dá)豬防御素的方法。

背景技術(shù)：

近年來，隨著抗生素在畜禽養(yǎng)殖中廣泛使用，耐藥菌株和多重耐藥菌株的不斷增加，使得病原菌的抗藥性大大提高，這不僅對畜禽養(yǎng)殖產(chǎn)生了極大的影響，而且逐漸使人類抗感染治療也陷入耐藥危機，使食品安全和人類醫(yī)療健康面臨巨大的安全隱患，抗生素的使用正面臨著前所未有嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。研究和應(yīng)用無毒、無公害、無耐藥的新型添加劑技術(shù)方案替代以往的抗生素保健方案已成為發(fā)展健康、安全、綠色畜牧養(yǎng)殖的必然趨勢。

防御素是一類富含半胱氨酸的陽離子活性多肽，其分子量為2000-6000Da，由29-54個氨基酸殘基組成，分子中含有6-8個保守的半胱氨酸，是動物先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。防御素在動物組織細(xì)胞中廣泛表達(dá)，借住于細(xì)胞媒介，在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外均可以直接殺死細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物，是宿主抵抗外界病原微生物入侵的第一道防線。防御素由于其具有抗菌譜廣、抗菌機制特殊、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留低、對動物自身正常細(xì)胞沒有傷害等特點，使防御素成為替代抗生素的最佳候選之一，未來將在畜禽生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

抗菌肽作為一類具有廣譜抗菌活性的短肽，具有分子量低，堿性強，熱穩(wěn)定、水溶性好及基本不對真核細(xì)胞起作用等特點，尤其是具有獨特的抗菌機理，細(xì)菌對其不易產(chǎn)生耐藥性，因此它有望成為新一代抗菌劑，以解決使用傳統(tǒng)抗生素導(dǎo)致產(chǎn)生的大量耐藥菌株這一世界性難題。因此開展對豬抗菌肽的研究具有重要理論和現(xiàn)實意義，豬抗菌肽可作為肉食品保鮮劑和畜禽飼料添加劑，因此，通過克隆表達(dá)豬抗菌膚肽基因獲得抗菌肽能帶來極大的社會效益和經(jīng)濟效益。

目前，國內(nèi)外已對哺乳動物中的牛、羊、兔、人防御素作了一些研究，而對抗菌肽的研究也主要集中于昆蟲抗菌肽的研究，對豬防御素和豬抗菌肽的研究報道極少，關(guān)于豬防御素在枯草芽孢桿菌中的重組和融合表達(dá)尚未見文獻(xiàn)報道，因此急需一種能夠穩(wěn)定獲得豬抗菌肽的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就是為了解決上述技術(shù)問題，而提供一種利用枯草芽孢桿菌高效表達(dá)豬防御素的方法，使得豬防御素在枯草芽孢桿菌中進(jìn)行重組，且融合蛋白在枯草芽孢桿菌中得以高效表達(dá)，能夠穩(wěn)定獲得豬抗菌肽，豬防御素表達(dá)量達(dá)3mg/L。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為，一種利用枯草芽孢桿菌高效表達(dá)豬防御素的方法，包括如下步驟：

(1)選取豬防御素BD基因，在BD基因中加入SacB基因和SamyQ基因，得到改造蛋白SS-BD基因；

(2)將步驟(1)所得改造蛋白SS-BD基因的兩端進(jìn)行KpnI/BamH Ⅰ雙酶切獲得SS-BD目的基因片段；

(3)選用枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體pHT43進(jìn)行KpnI/BamH Ⅰ雙酶切，得到pHT43雙酶切基因片段；

(4)將步驟(2)所得物與步驟(3)所得物進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，得到重組載體pHT-BD，將重組載體pHT-BD轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌上，篩選能生長在氯霉素平板上的陽性轉(zhuǎn)化子；

(5)將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子單克隆后接種于LB培養(yǎng)基中，置于搖床，在37℃、180rpm條件下過夜培養(yǎng)，得到一級培養(yǎng)液，將一級培養(yǎng)液按1％的接種量接種于50mL所述LB培養(yǎng)基中，置于搖床，在37℃、225rpm條件下培養(yǎng)，至OD₆₀₀達(dá)到0.8時加入誘導(dǎo)劑至濃度為2％(m/v)，在37℃下誘導(dǎo)反應(yīng)24h。

本發(fā)明采用枯草芽孢桿菌為宿主菌，選擇pHT43為抗菌肽表達(dá)載體，建立枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)抗菌肽的方法，解決抗菌肽來源限制等問題。同時可以利用枯草芽孢桿菌的益生菌性質(zhì)，能夠產(chǎn)生抗菌素，抑制其他細(xì)菌的生長，在畜禽的腸道內(nèi)還有比較強的奪氧能力，促進(jìn)畜禽營養(yǎng)的消化吸收、提高動物的飼料轉(zhuǎn)化率、防病率、動物生長等方面起到重要作用，為枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

本發(fā)明通過對豬防御素基因的改造，并經(jīng)過KpnI/BamH Ⅰ雙酶切，進(jìn)一步選用質(zhì)粒載體pHT43進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，并將二者進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，獲得重組載體pHT-BD，將重組載體pHT-BD轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌，得到陽性轉(zhuǎn)化子，經(jīng)克隆后選擇適宜的LB培養(yǎng)基，通過兩次培養(yǎng)，獲得了目的蛋白，經(jīng)檢測，豬防御素活性達(dá)3mg/L。

進(jìn)一步的，所述豬防御素BD基因的序列如下：

gaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctga。

進(jìn)一步的，所述步驟(2)是在改造蛋白SS-BD基因的5’端加入BamH Ⅰ酶切位點，在3’端加入KpnI酶切位點。

所述SS-BD目的基因的序列如下：

KpnI

ggtaccccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgcaatccaaacgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagccgtagaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctgaggatcc。

BamH Ⅰ

進(jìn)一步的，所述步驟(4)中枯草芽孢桿菌采用B.subtilis ROTA9300為宿主菌。

進(jìn)一步的，所述步驟(4)中連接方法采用TAKARA的DNA Ligation Kit Ver2.1方法說明操作，轉(zhuǎn)化方法按照TAKARA的E.coli DH5αCompetent Cells的方法說明操作。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中LB培養(yǎng)基為：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，氯霉素10μg/mL，pH為自然。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中將每一份單克隆陽性轉(zhuǎn)化子加入5mL的LB培養(yǎng)基中。

進(jìn)一步的，所述步驟(5)中誘導(dǎo)劑為蔗糖。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了一種豬防御素在枯草芽孢桿菌上進(jìn)行表達(dá)的方法，所獲得的表達(dá)量達(dá)3mg/L；本發(fā)明為豬防御素在枯草芽孢桿菌中的重組和融合表達(dá)提供了理論依據(jù)，建立了枯草芽孢桿菌分泌表達(dá)抗菌肽的方法，解決了抗菌肽的來源限制等問題。

附圖說明

圖1為豬防御素BD基因的改造方法示意圖；

圖2為質(zhì)粒載體pHT43的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為重組表達(dá)載體pHT-BD的合成路線示意圖；

圖4為重組表達(dá)載體pHT-BD的陽性克隆PCR圖；

圖5為SDS-PAGE分析法檢測目的蛋白分泌表達(dá)條帶圖；

圖6為目的蛋白對金黃色葡萄球菌的抑菌圖；

圖7為目的蛋白對大腸桿菌的抑菌圖。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行具體描述，有必要指出的是，以下實施例僅僅用于對本發(fā)明進(jìn)行解釋和說明，并不用于限定本發(fā)明。本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)上述發(fā)明內(nèi)容所做出的一些非本質(zhì)的改進(jìn)和調(diào)整，仍屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實施例

按照如下方法制備豬防御素融合蛋白并進(jìn)行表達(dá)：

(一)從NCBI數(shù)據(jù)庫中調(diào)取已知豬防御素BD基因序列，其序列如下所示：

gaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctga；

(二)目的基因的合成

選取上述豬防御素BD基因進(jìn)行改造，在BD基因中加入SacB和SamyQ基因，改造方法如圖1所示，得到改造蛋白SS-BD基因；在改造蛋白SS-BD基因的5’端加入限制性內(nèi)切酶KpnI酶切位點，SS-BD的3’端加入限制性內(nèi)切酶BamHⅠ酶切位點，進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，獲得SS-BD目的基因片段；酶切方法采用TAKARA酶切體系和說明來操作，均由上海Invitrogen ^TM公司直接合成；

所得SS-BD目的基因片段序列如下所示：

KpnI

ggtaccccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgcaatccaaacgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactgataaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcaccccttacatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggctggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagccgtagaccactacatatgtgccaagaaaggggggacctgcaacttctccccctgcccgctcttcaacaggattgaagggacctgttacagtggcaaggccaagtgctgcatccgctgaggatcc。

BamH Ⅰ

(三)重組表達(dá)載體的構(gòu)建

將枯草芽孢桿菌質(zhì)粒載體pHT43進(jìn)行KpnI/BamH Ⅰ雙酶切，得到pHT43雙酶切基因片段，酶切方法采用TAKARA酶切體系和說明來操作；然后與SS-BD目的基因片段進(jìn)行連接和轉(zhuǎn)化，得到重組表達(dá)載體pHT-BD；連接方法采用TAKARA的DNA Ligation Kit Ver2.1方法說明操作，轉(zhuǎn)化方法按照TAKARA的E.coli DH5αCompetent Cells的方法說明操作；質(zhì)粒載體pHT43的示意圖如圖2所示，重組表達(dá)載體pHT-BD的合成示意圖如圖3所示。

對連接轉(zhuǎn)化得到的載體pHT-BD進(jìn)行驗證，通過PCR陽性克隆所得結(jié)果如圖4所示，證明pHT43和SS-BD已經(jīng)連接轉(zhuǎn)化成功。

(四)枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及篩選

取重組表達(dá)載體pHT-BD，通過MoBiTec公司所提供的方法轉(zhuǎn)化入B.subtilis ROTA9300上，篩選出能生長在氯霉素平板上的陽性轉(zhuǎn)化子；

(五)培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)

將篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子挑選一單克隆后接種于5mL的LB培養(yǎng)基中，LB培養(yǎng)基配方為：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化鈉10g/L，氯霉素10μg/mL，pH為自然；然后置于搖床，在37℃、180rpm條件下過夜培養(yǎng)，得到一級培養(yǎng)液，將一級培養(yǎng)液按1％的接種量接種于50mL上述LB培養(yǎng)基中，置于搖床，在37℃、225rpm條件下培養(yǎng)，至OD₆₀₀達(dá)到0.8時加入誘導(dǎo)劑蔗糖至濃度為2％(m/v)，在37℃下誘導(dǎo)反應(yīng)24h。

(六)對豬防御素蛋白的表達(dá)量進(jìn)行測定，取誘導(dǎo)反應(yīng)后的產(chǎn)物1mL，采用SDS-PAGE方法分析鑒定目的蛋白的分泌表達(dá)情況，檢測目的條帶的情況如圖5所示。

通過圖5可以看出，通過誘導(dǎo)劑蔗糖進(jìn)行誘導(dǎo)后，在目的蛋白大小位置有清晰可見的條帶，說明目的蛋白已經(jīng)被成功誘導(dǎo)分泌表達(dá)，經(jīng)檢測，目的蛋白的表達(dá)量為3mg/L。

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目的蛋白的抑菌活性檢測：

將目的蛋白BD基因冷凍干燥濃縮后，用大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別作為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌的指示菌檢測目的片段BD的抑菌活性，方法為將菌懸液在12000rpm下離心10min后收集上清液，通過真空冷凍干燥將上清液濃縮成粉劑以后，用無菌蒸餾水將粉劑按照0.2g/mL的濃度配置成樣液，然后通過平板擴散法活性檢測，其中：

A組陽性對照：針對不同指示菌的相應(yīng)抗生素；

B組供試樣品：經(jīng)蔗糖誘導(dǎo)的真空冷凍干燥的上清液粉劑

C組陰性對照：未經(jīng)蔗糖誘導(dǎo)的真空冷凍干燥的上清液粉劑

所得結(jié)果如圖6和圖7所示，其中圖6為對革蘭氏陽性菌的檢測結(jié)果，圖7為對革蘭氏陰性菌的檢測結(jié)果。

通過圖6和圖7可以看出B組對革蘭氏陽性菌和陰性菌都具備抑菌效果，而C組則對兩種指示菌都沒有抑菌效果。