本發(fā)明屬于污水處理技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種可實(shí)現(xiàn)亞硝態(tài)氮(NO₂^--N)富積的異養(yǎng)硝化工程菌及其構(gòu)建方法，適用于為短程反硝化工藝或厭氧氨氧化工藝提供電子受體亞硝態(tài)氮(NO₂^--N)。

背景技術(shù)：

亞硝化即短程硝化，是荷蘭Delft大學(xué)開(kāi)發(fā)的脫氮新工藝，它的原理是將硝化過(guò)程控制在亞硝酸鹽階段而終止，然后直接進(jìn)行反硝化脫氮或?yàn)閰捬醢毖趸夹g(shù)(anaerobic ammonium oxidation，Anammox)提供NO₂^--N作為電子受體用于氧化NH₄⁺-N進(jìn)行脫氮。與全程硝化-反硝化反應(yīng)途徑相比，短程硝化可以降低25％的曝氣能耗，同時(shí)為后續(xù)反硝化階段減少有機(jī)碳源，甚至Anammox可以無(wú)需任何外加碳源。此外，NO₂^--N的返硝化速率通常比NO₃^--N高63％左右，因此采用短程硝化技術(shù)還具有較高的脫氮速率。然而實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定的短程硝化一直是廢水脫氮技術(shù)中的難點(diǎn)之一。

目前短程硝化工藝采用富集氨氧化菌(AOB)而抑制亞硝氮氧化菌(NOB)生長(zhǎng)的方式實(shí)現(xiàn)NO2--N的積累，主要有以下幾方面問(wèn)題：(1)高溫下利用短污泥齡(SRT)選擇性富集AOB而沖刷淘汰NOB的方式只適用于污水處理量較低的情況，因?yàn)楦邷匦枰拇罅康哪茉础?2)低溶解氧(DO)抑制NOB活性則會(huì)導(dǎo)致低脫氮率，此外系統(tǒng)長(zhǎng)期處在低溶解氧狀態(tài)下，活性污泥容易解體及絲狀膨脹。(3)利用游離氨(FA)抑制NOB的方式雖然能獲得初期的NO₂^--N積累，但由于NOB可能會(huì)逐漸適應(yīng)高FA濃度，因此效果不能長(zhǎng)時(shí)間維持。另外，F(xiàn)A還會(huì)對(duì)Anammox菌產(chǎn)生抑制作用，導(dǎo)致系統(tǒng)去除率下降。除此之外，廢水或多或少都含有一定濃度的有機(jī)物，這使得自養(yǎng)型的AOB的生長(zhǎng)會(huì)受異養(yǎng)菌的影響。

基于自養(yǎng)亞硝化菌的短程硝化工藝存在上述這些缺點(diǎn)，目前有學(xué)者嘗試以能顯著實(shí)現(xiàn)NO₂^--N積累的異養(yǎng)硝化菌代替自養(yǎng)AOB來(lái)完成短程硝化反應(yīng)。然而由于異養(yǎng)硝化菌同時(shí)具有反硝化功能，其硝化過(guò)程中最高NO₂^--N積累濃度僅為30.1mg/L(進(jìn)水NH₄⁺-N濃度為100mg/L)。

基因敲除是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)重要的分子生物學(xué)技術(shù)，利用微生物體內(nèi)的同源重組系統(tǒng)，在一定選擇壓力下使體外改造的某功能基因與受體細(xì)胞染色體上的功能基因之間發(fā)生同源重組，從而改變細(xì)胞的遺傳特性。利用基因敲除技術(shù)可阻斷細(xì)胞的代謝旁路，或通過(guò)引入突變位點(diǎn)改變目的產(chǎn)物的產(chǎn)量或質(zhì)量，從而達(dá)到微生物育種的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

基于上述問(wèn)題，本發(fā)明目的在于提供一種利用基因敲除技術(shù)對(duì)以NO₂^--N為主要硝化產(chǎn)物的異養(yǎng)硝化菌中的亞硝酸鹽還原酶基因進(jìn)行敲除，使原始菌株喪失將NO₂^--N還原為N₂的能力，從而獲得具有長(zhǎng)期穩(wěn)定累積NO₂^--N的異養(yǎng)硝化工程菌的構(gòu)建方法。

針對(duì)以上問(wèn)題，提供了如下技術(shù)方案：一種可實(shí)現(xiàn)亞硝態(tài)氮富積的異養(yǎng)硝化工程菌的構(gòu)建方法，其特征在于：所述異養(yǎng)硝化工程菌的構(gòu)建方法按以下步驟進(jìn)行：

(1)，篩選出以NO₂^--N為主要硝化產(chǎn)物的異養(yǎng)硝化菌為基因敲除技術(shù)的供試菌；

(2)，對(duì)篩選分離出的供試菌進(jìn)行全基因組序列測(cè)序分析，識(shí)別確定其基因序列中需要敲除的目的基因——亞硝酸鹽還原酶基因(nir)序列和所有同源性基因序列的位置；

(3)，利用PCR技術(shù)對(duì)識(shí)別出的亞硝酸鹽還原酶基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，得到亞硝酸鹽還原酶基因(nir)敲除所需的同源臂序列，并將同源臂序列鏈接到帶有標(biāo)記基因的載體中構(gòu)成供體菌，然后利用三親結(jié)合技術(shù)將供體菌、供試菌接種培養(yǎng)，最終采用標(biāo)記基因的特異位點(diǎn)表達(dá)法獲得成功敲除亞硝酸鹽還原酶基因(nir)的菌株；

(4)，對(duì)供試菌內(nèi)的同源性基因序列做重復(fù)上述步驟三的操作，直至所有同源性基因序列都被成功敲除，最終獲得的即為構(gòu)建出的可實(shí)現(xiàn)NO₂^--N富積的異養(yǎng)硝化工程菌。

本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述步驟一中的供試菌為糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)，將其接種到含如下組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)：(NH₄)₂SO₄ 0.472g，檸檬酸鈉4.902g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄ 0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，F(xiàn)eSO₄ 0.01g，微量元素溶液1ml，H₂O 1000ml，pH值6.0。

本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述糞產(chǎn)堿桿菌實(shí)現(xiàn)亞硝態(tài)氮富積的異養(yǎng)硝化工程菌的構(gòu)建方法按如下步驟進(jìn)行：

(1)，根據(jù)糞產(chǎn)堿桿菌內(nèi)亞硝酸鹽還原酶基因(nir)序列，利用Primer軟件設(shè)計(jì)其上下游同源臂引物；

上游同源臂引物序列：5′ TTGCTGGCGGCTCAAGTA 3′

5′ ACATCATGGCGTGCATGG 3′

下游同源臂引物序列：5′ GGCAAGTTTGATGACCCACCCG 3′

5′ CGTTCCATTCGCCTTCGACCAG 3′

(2)，根據(jù)上下游同源臂引物利用PCR擴(kuò)增出亞硝酸鹽還原酶基因(nir)上下游同源臂，其擴(kuò)增程序和條件為：94℃ 4min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；然后回收純化該片段，再利用重疊延伸PCR，將上下游同源臂兩個(gè)片段連接到T載體上；對(duì)慶大霉素抗性的自殺性質(zhì)粒(pJQ200SK)用Xba I和Sac I進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對(duì)重組的T載體進(jìn)行相同處理，分別回收酶切后的片段進(jìn)行酶連，獲得重組載體即是基因敲除所需的同源重組載體(pJQ-nir)，并將該同源重組載體導(dǎo)入到大腸桿菌中，獲得供體菌。

(3)，采用三親接合技術(shù)將供體菌(內(nèi)含敲除目的基因所需的同源重組載體，Gm^r)、供試菌(Alcaligenes faecalis，Pen^r，Cef^r)和輔助菌(E.coli pRK600，Cm^r)分別接入含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并按1∶2∶1的菌體量在濾膜上混合，然后置于無(wú)抗性的LB平板上30℃靜置培養(yǎng)24h后，用液體無(wú)菌水洗下濾膜上的菌體，稀釋涂布于選擇性抗性平板(Pen、Gm和Cef)，培養(yǎng)12h，挑選接合子作為一次同源重組突變子；

(4)，把一次同源重組突變子培養(yǎng)于雙抗(Pen和Cef)且含10％蔗糖的LB試管中，培養(yǎng)24h，然后涂布于雙抗(Pen和Cef)且含10％蔗糖的LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落，即第二輪同源重組子；

(5)，經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接和抗性平板反復(fù)驗(yàn)證，并用PCR驗(yàn)證片段大小，獲得的重組子為亞硝酸鹽還原酶基因(nir)敲除菌株；

(6)，對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌內(nèi)的同源性基因序列做重復(fù)以上步驟(1)到步驟(5)的操作，直至所有同源性基因序列都被成功敲除，最終獲得的即為可實(shí)現(xiàn)亞硝態(tài)氮富積的異養(yǎng)硝化工程菌。

本發(fā)明進(jìn)一步設(shè)置為：所述微量元素溶液按如下成分配制得到：EDTA·2Na 57.1g，ZnSO₄·7H₂O 3.9g，CaCl₂·2H₂O 7g，CuSO₄·5H₂O 1.6g，H₂O 1000ml，pH＝6.0。

一種根據(jù)上述構(gòu)建方法得到的異養(yǎng)硝化工程菌。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果在于：

(1)利用基因敲除技術(shù)可以對(duì)異養(yǎng)硝化菌亞硝酸鹽還原酶基因進(jìn)行敲除，避免該菌反硝化能力影響硝化主要產(chǎn)物NO₂^--N的積累，獲得長(zhǎng)期穩(wěn)定的短程硝化效果。

(2)利用所獲得的異養(yǎng)硝化工程菌實(shí)現(xiàn)短程硝化過(guò)程，與自養(yǎng)AOB的短程硝化系統(tǒng)相比，可以無(wú)需刻意富集AOB抑制NOB，降低系統(tǒng)運(yùn)行操作維護(hù)難度，同時(shí)也提高了系穩(wěn)定性。

(3)與自養(yǎng)AOB相比，異養(yǎng)硝化工程菌不僅不會(huì)受污水中的COD影響，還能在脫氮的同時(shí)完成脫碳，提高了短程硝化工藝工程實(shí)際應(yīng)用價(jià)值，減少了系統(tǒng)反應(yīng)容積負(fù)荷，并且有利于系統(tǒng)的穩(wěn)定。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例一

(1)，將糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)接種到含如下組分的培養(yǎng)基中培養(yǎng)：(NH₄)₂SO₄ 0.472g，檸檬酸鈉4.902g，MgSO₄·7H₂O 0.05g，K₂HPO₄ 0.2g，NaCl 0.12g，MnSO₄·4H₂O 0.01g，F(xiàn)eSO₄ 0.01g，微量元素溶液1ml，H₂O 1000ml，pH值6.0。其中微量元素溶液按如下成分事先配制：EDTA·2Na 57.1g，ZnSO₄·7H₂O 3.9g，CaCl₂·2H₂O 7g，CuSO₄·5H₂O 1.6g，H₂O 1000ml，pH＝6.0。通過(guò)測(cè)量其培養(yǎng)基中NO₂^--N和NH₄⁺-N的含量，即可知道該菌種的主要硝化產(chǎn)物為NO₂^--N，因此可采用該菌株作為基因敲除技術(shù)的供試菌。

(2)，根據(jù)糞產(chǎn)堿桿菌內(nèi)亞硝酸鹽還原酶基因(nir)序列，利用Primer軟件設(shè)計(jì)其上下游同源臂引物：

糞產(chǎn)堿桿菌(Alcaligenes faecalis)的亞硝酸鹽還原酶基因(nir)序列為：

TTGCTGGCGGCTCAAGTACAAGCCCGCGAGACGGCTGCACCAAAAAAGAACGCGCCCTGGCTGGCCGCGCGTACAGAAGCCCAGATCGCCAAGCTGGAGCGGGTCAAGGTGGATCTGGTTGCGCCTCCTATGGTCCACAAGCACGAGCAGAAAGTGGGTCGCGAGCCTCGCGTGGTGGAATTCCGCATGAGCATCGTGGAAAAAGAGATCGTGGTCGACCGTGACGGCACAACCATGCACGCCATGATGTTTGACGGCTCCATGCCCGGCCCCACCATGGTTGTGCATGAAGGCGACTACCTGGAGCTGACCCTGGTCAACCCGGCCAGCAACACCATGCCGCACAACATCGACTTTCACGCCTCCACAGGGGCGCTGGGCGGTGCCAAGCTGACCAACGTCAACCCTGGTGAGCAAGCCACACTGCGCTTCAAGGCCGACCGTACTGGTACCTTCATTTACCACTGCGCACCCGAAGGTTCCGTAGCCTGGCACGTGGTTCAGGGCATGCACGGTACCGTCATGGTGCTGCCACGCGACGGCCTGAAGGACTCGGCTGGCAACTCGCTGCATTACGACCGTGTCTACACCATTGGTGAATTTGACCTCTACATTCCTCGTGATGAAAAGGGCAATTTCAAGAAGTATGGCTCGTCGGCTGAAAGCTACGGCGACACCCTGGAAGCCATGCGTGGTCTGATCCCCAGCCACGTGGTGTTCAACGGCAAGGTCGGTGCCTTGATGGGCGATGGTGCCATGAAGGCCAATGTGGGCGAAACCGTGTTGTTCATTCACTCGCAGGCCAACCGCGACACCCGTCCTCACCTGATTGGTGGTCACGGTGACTGGGTTTGGGAACTGGGCAAGTTTGATGACCCACCCGCCAAGAACCTGGAAACCTGGTTCATTCGCGGTGGTTCGGCCGGTGTGGCGCTCTACACCTTCAAGCAGCCTGGTGTGTACGCCTACGTGAACCACAACCTGATCGAAGCCATGGAACTGGGCGCCGCAGGTCACGTCCTGGTCGAAGGCGAATGGAACGATGACTTGATGAAGCAAGTCAGCCCTCCCGGCCCGATCAAGGCTTAA

設(shè)計(jì)的上下游同源臂引物序列如下：

上游同源臂引物序列：5′ TTGCTGGCGGCTCAAGTA 3′

5′ ACATCATGGCGTGCATGG 3′

下游同源臂引物序列：5′ GGCAAGTTTGATGACCCACCCG 3′

5′ CGTTCCATTCGCCTTCGACCAG 3′

(3)，同源重組載體的構(gòu)建流程為：根據(jù)上下游同源臂引物利用PCR擴(kuò)增出亞硝酸鹽還原酶基因(nir)的上下游同源臂，上游引物是(nir)-L-arm-up-21F和(nir)-L-arm-down-81R，下游引物是(nir)-L-arm-up-41F和(nir)-arm-down-01R，其擴(kuò)增程序和條件為：94℃ 4min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 30s，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10min；回收相應(yīng)的片段，利用重疊延伸PCR，將上下游同源臂兩個(gè)片段連接到T載體上；對(duì)慶大霉素抗性的自殺性質(zhì)粒(pJQ200SK)用Xba I和Sac I進(jìn)行雙酶切，同時(shí)對(duì)重組的T載體進(jìn)行相同處理，分別回收酶切后的片段進(jìn)行酶連，獲得重組載體即是基因敲除所需的同源重組載體(pJQ-nir)，并將該同源重組載體導(dǎo)入到大腸桿菌中，獲得供體菌。

(4)，采用三親接合技術(shù)將供體菌(內(nèi)含敲除目的基因所需的同源重組載體，Gm^r)、供試菌(Alcaligenes faecalis，Pen^r，Cef^r)和輔助菌(E.coli pRK600，Cm^r)分別接入含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并按1∶2∶1的菌體量在濾膜上混合，然后置于無(wú)抗性的LB平板上30℃靜置培養(yǎng)24h后，用液體無(wú)菌水洗下濾膜上的菌體，稀釋涂布于選擇性抗性平板(Pen、Gm和Cef)，培養(yǎng)12h，挑選接合子作為一次同源重組突變子；

(5)，把一次同源重組突變子培養(yǎng)于雙抗(Pen和Cef)且含10％蔗糖的LB試管中，培養(yǎng)24h，然后涂布于雙抗(Pen和Cef)且含10％蔗糖的LB固體平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)，挑取單菌落，即第二輪同源重組子；

(6)，經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接和抗性平板反復(fù)驗(yàn)證，并用PCR驗(yàn)證片段大小，獲得的重組子為亞硝酸鹽還原酶基因(nir)敲除菌株；

(7)，對(duì)糞產(chǎn)堿桿菌內(nèi)的同源性基因序列做重復(fù)以上步驟(2)到步驟(6)的操作，直至所有同源性基因序列都被成功敲除，最終獲得的即為可實(shí)現(xiàn)亞硝態(tài)氮富積的異養(yǎng)硝化工程菌。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，上述假設(shè)的這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。