本發(fā)明屬于藥物化學(xué)及制劑領(lǐng)域，具體涉及一系列卡巴他賽藥物前體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卡巴他賽(cabazitaxel，CTX)是一種半合成紫杉烷類化合物(C.J.Paller and E.S.Antonarakis.Cabazitaxel:a novel second-line treatment for metastatic castration-resistant prostate cancer,Drug Des.Dev.Ther.,2011,5,117-124)。其前體從紫杉樹針葉中提取獲得，化學(xué)名稱為苯甲酸{(2α,5β,7β,10β,13α)-4-乙酰基-13-{(2R,3S)-3-[(叔丁氧基羰基)氨基]-2-羥基-3-苯丙酰氧基}-1-羥基-7,10-二甲氧基-9-氧代-5,20-環(huán)氧紫杉烷-11-烯-2-基}酯，結(jié)構(gòu)式如下：

CTX是一種廣譜的抗癌小分子藥物，其抑制腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制跟紫杉醇及多西紫杉醇類似，主要通過促進(jìn)微管聚合，降低微管的解聚速度，從而使微管處于非功能性狀態(tài)，達(dá)到阻止腫瘤細(xì)胞有絲分裂和增殖的目的(C.Villanueva,et al.,Cabazitaxel:A Novel Microtubule Inhibitor,Drugs,2011,71,1251-125)。但是與其他紫杉烷類藥物不同的是，CTX與腫瘤的耐藥密切相關(guān)的P-糖蛋白(P-glycoprotein)的親和力較低，因此能夠克服紫杉醇及多西紫杉醇帶來的耐藥問題。此外，CTX具有更強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力，于2010年6月，CTX由美國FDA批準(zhǔn)用于激素難治性前列腺癌的治療。

盡管CTX具有良好的臨床應(yīng)用前景，但是其水溶性差，臨床上使用CTX注射液(商品名為JEVTANA，由賽諾菲-安萬特公司研發(fā))需要通過添加表面活性劑聚山梨脂80(吐溫80)及乙醇作為助溶劑來增加藥物的溶解性。但該增溶方法存在諸多缺點(diǎn)：首先吐溫80易引發(fā)過敏反應(yīng)，患者用藥前需要進(jìn)行抗過敏治療；其次，吐溫80的血液性毒性較高，成為限制治療劑量的主要因素；再次藥物穩(wěn)定性差，經(jīng)稀釋后易沉淀析出。此外，臨床應(yīng)用CTX注射液發(fā)現(xiàn)具有非常嚴(yán)重的骨髓抑制等副作用，在臨床I期的試驗(yàn)結(jié)果顯示其藥物最大耐受劑量(maximum tolerated dose,MTD)僅為25mg/m²，遠(yuǎn)低于紫杉醇的175mg/m²跟多西紫杉醇的60-100mg/m²的最大耐受劑量(Alain C.Mita,et al.,Phase I and Pharmacokinetic Study of XRP6258(RPR116258A),a Novel Taxane,Administered as a 1-Hour Infusion Every 3Weeks in Patients with Advanced Solid Tumors)。綜上，為降低CTX的系統(tǒng)性毒性，需要對該藥物的核心分子進(jìn)行重新設(shè)計(jì)以提高其臨床應(yīng)用潛力及適應(yīng)癥。

在本發(fā)明中我們通過對CTX的羥基位點(diǎn)進(jìn)行疏水基團(tuán)后，可在不損傷藥物抗腫瘤活性的前提下，通過前藥小分子的自組裝形成納米藥物的方式或者溶于兩親性表面活性劑或者兩親性高分子聚合物膠束增加CTX的水溶性。此外更為重要的是，我們驚奇地發(fā)現(xiàn)，該技術(shù)大大提高了MTD，可擴(kuò)大CTX的臨床應(yīng)用范圍和應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決卡巴他賽水溶性差，藥物穩(wěn)定性差，藥物體內(nèi)最大耐受劑量低等問題，本發(fā)明提供了一種卡巴他賽(CTX)藥物前體，CTX藥物前體結(jié)構(gòu)式如式(I)所示：

其中R表示疏水性基團(tuán)。

本發(fā)明中，所述的CTX藥物前體由疏水性基團(tuán)與CTX通過可斷裂的酯鍵連接，利于前體藥物在體內(nèi)通過水解的方式直接釋放抗腫瘤成分。

本發(fā)明中，所述的疏水性基團(tuán)由脂肪酸提供。所述脂肪酸可選擇飽和脂肪酸或不飽和脂肪酸，優(yōu)選為不飽和脂肪酸。

作為優(yōu)選，所述脂肪酸的碳鏈長度為C₂～C₂₂。

更為優(yōu)選地，所述脂肪酸的碳鏈長度為C₁₈～C₂₂。

相比于飽和脂肪酸，不飽和脂肪酸修飾的CTX在水中具有更高的溶解度并能夠更好地在水中通過自組裝的方式形成納米粒顆粒。所述不飽和脂肪酸優(yōu)選為DHA(二十二碳六烯酸)、亞麻酸、油酸或亞油酸，更優(yōu)選為DHA、亞麻酸或亞油酸，所述飽和脂肪酸可選用硬脂酸。

本發(fā)明提供的CTX藥物前體既能溶解于吐溫等兩親性表面活性劑，又可以溶解于水，這大大增加了CTX的應(yīng)用范圍。

同時，本發(fā)明還提供了所述CTX藥物前體式(1)化合物的制備方法，包括：

(1)在縮合劑存在下，CTX與脂肪酸發(fā)生酯化反應(yīng)；

作為優(yōu)選，所述縮合劑為N,N’-二環(huán)己基碳二亞胺(DCC)，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，N,N’-二異丙基碳二亞胺(DIPC)，六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基(PyBOP)，三吡咯烷基溴化鏻六氟磷酸鹽(PyBroP)。

(2)反應(yīng)完成后對粗產(chǎn)物進(jìn)行分離純化，獲得結(jié)構(gòu)式如式(Ⅰ)所示的CTX藥物前體，分離純化步驟主要用于除去反應(yīng)中未反應(yīng)的原料以及所用的縮合劑、催化劑等雜質(zhì)。

在第(1)步反應(yīng)中，反應(yīng)溶劑選自但不限于二氯甲烷，DMF(二甲基甲酰胺)、DMSO(二甲基亞砜)或者上述溶劑兩種或者三種的混合液。

優(yōu)選的，可以在第(1)步反應(yīng)中加入堿或堿/催化劑，所述的催化劑選自但不限于DMAP(4-二甲氨基吡啶)；所述的堿選自但不限于DIEA(N,N-二異丙基乙胺)，Et₃N(三乙胺)。

優(yōu)選的步驟(1)在室溫到60℃進(jìn)行反應(yīng)。

本發(fā)明中所述CTX可以按照姚全興，李婭，朱小鋒，李靖，一種卡巴他賽的合成新方法，化學(xué)與生物工程2014年第31卷第2期55-57頁中提供的方法制備。

本發(fā)明還提供了所述CTX藥物前體在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：

(1)本發(fā)明的CTX藥物前體比臨床藥物CTX具有相類似的抗腫瘤活性，但是動物體內(nèi)的耐受劑量大大提高。在體內(nèi)能夠以緩慢水解的方式釋放抗癌活性成分，有效減小直接注射CTX造成的體內(nèi)毒性。

(2)本發(fā)明的CTX藥物前體在水中具有較好的溶解性(達(dá)9mg/mL)，避免了制劑輔料的使用，并且具有較高的體內(nèi)外穩(wěn)定性。

(3)本發(fā)明通過單步酯化法即可獲得所述藥物前體，產(chǎn)率高，制備成本低，穩(wěn)定性高，安全性好，符合臨床用藥的要求，符合大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的要求，具備良好的市場前景與臨床應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實(shí)施例1中含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物1的合成路線；

圖2為實(shí)施例2中含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物2的合成路線；

圖3為實(shí)施例3中含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物3的合成路線；

圖4為實(shí)施例4中含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物4的合成；

圖5為實(shí)施例5中含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物5的合成；

圖6為實(shí)施例6中含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物6的合成；

圖7為實(shí)施例7中含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物7的合成；

圖8為實(shí)施例1制備的CTX藥物前體1在水相中自組裝形成納米粒的透射電鏡圖；

圖9為實(shí)施例3制備的CTX藥物前體3在水相中自組裝形成納米粒的透射電鏡圖；

圖10-15依次為實(shí)施例1、3、4和5中制備的CTX藥物前體1,3,4,5在ICR小鼠體內(nèi)毒性。以生理鹽水及CTX(溶于吐溫80/乙醇體積1:1)作為對照；

其中，CTX表示卡巴他賽，DHA表示順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸，DCM表示二氯甲烷，EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺的鹽酸鹽，DMAP表示4-二甲氨基吡啶，DIEA表示N,N-二異丙基乙胺。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。

實(shí)施例1 含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物1的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(100mg，0.12mmol)和順式-4,7,10,13,16,19-二十二碳六烯酸(DHA，39mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水DCM(二氯甲烷)中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(16mg，0.13mmol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物1(80mg，產(chǎn)率58％)。

產(chǎn)物1的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.90(t,3H),1.20-1.22(d,6H,J＝6.4),1.25(s,3H),1.35(s,9H),1.57-1.63(t,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.04-2.09(t,2H),2.32-2.35(t,3H),2.39-2.49(m,5H),2.77-2.86(m,11H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.34-5.37(m,12H),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS：計(jì)算值[C₆₇H₈₇NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝1146.6148；檢測值:1146.6171.

實(shí)施例2 含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物2的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(100mg，0.12mmol)和亞麻酸(34mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水二氯甲烷中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，4-二甲氨基吡啶(16mg，0.13mmol)和N,N-二異丙基乙胺(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物2(115mg，產(chǎn)率87％)。

產(chǎn)物2的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.90(t,3H),1.22(s,9H),1.26(s,8H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.62-1.67(m,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.04-2.08(m,4H),2.31-2.37(m,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),2.76-2.79(t,4H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.34-5.37(m,6H),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS：計(jì)算值[C₆₃H₈₅NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝1096.5992；檢測值:1096.6005.

實(shí)施例3 含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物3的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(100mg，0.12mmol)和亞油酸(34mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水二氯甲烷中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，4-二甲氨基吡啶(16mg，0.13mmol)和N,N-二異丙基乙胺(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物3(120mg，產(chǎn)率91％)。

產(chǎn)物3的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ0.86-0.90(t,3H),1.22(s,9H),1.26(s,14H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.62-1.67(m,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.04-2.08(m,4H),2.31-2.37(m,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),2.76-2.79(t,2H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.34-5.37(m,4H),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS：計(jì)算值[C₆₃H₈₇NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝1098.6148；檢測值:1098.6166.

實(shí)施例4 含不飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物4的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(100mg，0.12mmol)和油酸(34mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水DCM(二氯甲烷)中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(16mg，0.13mmol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物4(98mg，產(chǎn)率76％)。

產(chǎn)物4的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.90(t,3H),1.22(s,9H),1.26(s,20H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.62-1.67(m,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,7H),2.31-2.37(m,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.34-5.37(m,2H),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS:計(jì)算值[C₆₃H₈₉NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝1100.6305；檢測值:1100.6265.

實(shí)施例5 含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物5的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(CTX)(100mg，0.12mmol)和硬脂酸(34mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水DCM(二氯甲烷)中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(16mg，0.13mmol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物5(93mg，產(chǎn)率70％)。

產(chǎn)物5的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl₃):δ0.86-0.90(t,3H),1.22(s,9H),1.26(s,28H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.62-1.67(m,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.31-2.37(m,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS:計(jì)算值[C₆₃H₉₁NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝1102.6461；檢測值:1102.6479.

實(shí)施例6 含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物6的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(CTX)(100mg，0.12mmol)和庚酸(16mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水DCM(二氯甲烷)中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(16mg，0.13mmol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物6(80mg，產(chǎn)率71％)。

產(chǎn)物6的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ0.86-0.90(t,3H),1.22(s,9H),1.26(s,6H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.62-1.67(m,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.31-2.37(m,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),3.30(s,3H),3.44(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.30-4.33(d,1H,J＝8.4),4.83(s,1H),4.99-5.01(d,1H,J＝4.8),5.64-5.66(d,1H,J＝7.2),6.24-6.29(m,1H),7.29-7.31(t,3H),7.38-7.41(t,2H),7.48-7.52(t,2H),7.59-7.63(t,1H),8.10-8.12(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS:計(jì)算值[C₅₂H₆₉NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝948.4740；檢測值:948.4753.

實(shí)施例7 含飽和烷烴鏈化合物的CTX前體藥物7的合成

在100mL圓底燒瓶中加入CTX(CTX)(100mg，0.12mmol)和乙酸(7.2mg，0.12mmol)，溶解在5mL無水DCM(二氯甲烷)中，再加入EDC·HCl(25mg，0.13mmol)，DMAP(4-二甲氨基吡啶)(16mg，0.13mmol)和DIEA(N,N-二異丙基乙胺)(21μL，0.13mmol)。25℃攪拌過夜，然后分別用5％檸檬酸，飽和碳酸氫鈉，飽和食鹽水清洗；有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，過濾，收集濾液后減壓除去溶劑；固體用柱層析色譜分離純化(DCM:MeOH＝200:1)后得到產(chǎn)物7(95mg，產(chǎn)率90％)。

產(chǎn)物7的¹H NMR核磁數(shù)據(jù)以及質(zhì)譜數(shù)據(jù)如下：

¹H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.22(s,9H),1.35(s,9H),1.51-1.55(t,2H),1.76-1.82(m,2H),2.00(s,3H),2.31-2.37(m,3H),2.42(s,3H),2.45(s,3H),2.67-2.74(m,1H),3.32(s,3H),3.46(s,3H),3.84-3.92(m,2H),4.16-4.18(d,1H,J＝8.8),4.31-4.34(d,1H,J＝8.4),4.85(s,1H),5.00-5.02(d,1H,J＝4.8),5.68-5.71(d,1H,J＝7.2),6.26-6.30(m,1H),7.20-7.31(t,3H),7.40-7.43(t,2H),7.49-7.53(t,2H),7.58-7.59(t,1H),8.11-8.13(d,2H,J＝7.2).

HR-ESI Qq-LTMS:calcd for[C₄₇H₆₀NO₁₅]⁺[M+H]⁺＝878.3957；obsd 878.4012.

實(shí)施例8 CTX前藥在水相中的自組裝能力測試

取實(shí)施例1、3中制備得到的CTX前藥1與3各10mg，溶于100μl的二甲基亞砜(DMSO)中，再緩慢注入水中，形成澄清的溶液；經(jīng)水溶液中透析后即可除去DMSO溶液。上述水溶液使用透射電鏡(TEM)觀察顆粒的形貌，結(jié)果如圖8和9。

實(shí)施例9 CTX前藥抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力

考察實(shí)施例中CTX前藥對腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，具體方法如下：

取對數(shù)生長期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板(5000個細(xì)胞/孔)。放入在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)24h后，加入各納米藥物，取7個濃度梯度，以CTX(溶于二甲亞砜)作為對照組，每種藥每個濃度4個重復(fù)值，加完藥后將96孔細(xì)胞板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72h后，在96孔板的每孔內(nèi)加入30μL的四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)，繼續(xù)放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入100μL二甲亞砜，用酶標(biāo)儀檢測490nm處的吸光值。計(jì)算細(xì)胞存活率，得到藥物對細(xì)胞生長的IC₅₀(半數(shù)抑制濃度)。合成的CTX前藥對腫瘤細(xì)胞的體外毒性結(jié)果見表1。

表1.CTX化合物在腫瘤細(xì)胞中的MTT活性測試(IC₅₀±SD，μM)。

表1結(jié)果顯示，與人乳腺癌細(xì)胞Bcap-37及人腸癌細(xì)胞LoVo共培養(yǎng)72h后，CTX前藥4,5與上述細(xì)胞共培養(yǎng)72h后，其抑制腫瘤細(xì)胞的能力降低較明顯。但是CTX前藥1-3能夠高效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，其IC₅₀值與CTX藥物接近。因此細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明，CTX前藥1-3具有較強(qiáng)的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力，具有廣闊的抗腫瘤應(yīng)用前景。

實(shí)施例10 藥物體內(nèi)毒性評價實(shí)驗(yàn)

取實(shí)施例1、3、4、5制備的CTX前藥各100mg，加入DSPE-PEG₂₀₀₀(10mg)溶于728μl二甲基亞砜(DMSO)中，再緩慢注入水中，即可形成納米粒。

ICR小鼠(4-5周齡)，每組10只，注射由實(shí)施例1、3、4、5制備的CTX藥物前體形成的納米粒，考察尾靜脈注射CTX與CTX前藥納米粒(注射三次，每隔兩天注射一次)后對小鼠體重的影響，評價藥物的體內(nèi)毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10-15所示，小鼠注射CTX前藥納米藥物后，體重與空白對照組(未用任何藥物組)小鼠體重基本一致，呈上升趨勢，即使是高劑量(70mg/kg)用藥組小鼠的體重也基本保持穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)明顯的藥物毒性。但注射低劑量的CTX藥物時，小鼠的體重呈明顯下降趨勢；其中劑量為20mg/kg時，小鼠6天后開始死亡。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，制備的CTX藥物前體能夠顯著降低CTX藥物的毒性，因此有望大幅提高CTX藥物的臨床應(yīng)用范圍，具有非常大的臨床應(yīng)用前景。