本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種針對(duì)新疆出血熱病毒囊膜蛋白的抗病毒單域抗體。

背景技術(shù)：

治療性單克隆抗體(monoclonal antibody，單抗)由于可精確地攻擊靶分子，且因毒副作用較小而成為人們期望中的理想藥物。目前，國(guó)內(nèi)外的單抗藥物主要應(yīng)用于治療腫瘤、免疫性疾病和病毒感染等方面。例如用于治療呼吸道和包病毒RSV的帕利珠單抗(Palivizumab、Synagis)。

傳統(tǒng)的單克隆抗體的制備方法是雜交瘤技術(shù)。隨著基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，治療性單抗已從鼠源單抗，到嵌合抗體、人源化抗體，直至近年的全人抗體，逐步消除了異源性抗體的免疫原性問題。但隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)全長(zhǎng)抗體的分子量較大(～150kD)，使它們的組織滲透性較差，也難以結(jié)合一些空間上有位阻效應(yīng)的關(guān)鍵表位，從而影響活性。解決的策略之一是將全長(zhǎng)抗體進(jìn)行小型化，由此開發(fā)了一系列具有結(jié)合功能的抗體片段：如Fab(50-60kD)、單鏈抗體(scFv，20-30kD)、重鏈可變區(qū)抗體(VH，12-15kD)(單域抗體)等小型化抗體。這些抗體片段相對(duì)于全長(zhǎng)單抗，具有更好的組織滲透性和結(jié)合存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力。

新疆出血熱病毒(Xinjiang hemorrhagic fever virus，XHFV)是迄今為止傳染性最高、致命性最強(qiáng)的病毒之一，具有傳播途徑廣、感染種群復(fù)雜等特點(diǎn)，爆發(fā)區(qū)域呈擴(kuò)大趨勢(shì)。目前，尚沒有針對(duì)新疆出血熱的候選抗體藥物。

假病毒是由非病毒自身核酸被病毒衣殼蛋白或包膜蛋白包裹所形成的具有感染性的病毒樣顆粒。我們利用基因工程改造的水泡性口炎病毒(缺失囊膜蛋白基因，因此不能組裝出新的完整病毒顆粒，只能一次性感染細(xì)胞；帶有綠色熒光蛋白基因，感染細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)，使被感染的細(xì)胞呈綠色)和新疆出血熱病毒的囊膜蛋白基因一起，組裝出帶有新疆出血熱病毒囊膜蛋白的水泡性口炎病毒顆粒。該新疆出血熱假病毒可較好的替代野生的新疆出血熱病毒，應(yīng)用于抗體中和病毒的研究中。

近幾年噬菌體展示技術(shù)廣泛用于抗體研發(fā)。噬菌體展示技術(shù)是將被展示基因與噬菌體自身蛋白基因(gIII或gVIII)融合在一起而展示于噬菌體的表面?？梢詷?gòu)建大容量(10¹⁰～10¹¹)的展示庫(kù)進(jìn)行篩選，以其速度快、周期短等獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)而越來越被人們所重視。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種針對(duì)新疆出血熱病毒囊膜蛋白的抗病毒單域抗體XHF4RC8，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本發(fā)明的第二方面，提供一種DNA分子，它編碼選自下組的蛋白質(zhì)：本發(fā)明所述的針對(duì)新疆出血熱病毒囊膜蛋白的抗病毒單域抗體XHF4RC8。

優(yōu)選的，所述的DNA分子，其特征在于，它具有選自如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

本發(fā)明提供的單域抗體XHF4RC8，是一種針對(duì)新疆出血熱囊膜蛋白的抗病毒抗體，該單域抗體的互補(bǔ)決定簇分別為CDR1、CDR2和CDR3。編碼CDR1的基因序列為seq ID No.3，氨基酸序列為Seq ID No.4；編碼CDR2的基因序列為Seq ID No.5，氨基酸序列為seq ID No.,6；編碼CDR3的基因序列為Seq IDNo.7，氨基酸序列為Seq ID No.8。

本發(fā)明提供的上述針對(duì)新疆出血熱病毒囊膜蛋白的單域抗體，是通過以下方法得到：首先構(gòu)建以VH(m0)為骨架的噬菌體表面展示文庫(kù)(W Chen,et al.,Methods Mol Biol,2009:81-99)，然后以原核表達(dá)的新疆出血熱病毒囊膜蛋白Gc結(jié)構(gòu)域III為抗原(圖2)，經(jīng)過4輪篩選得到一個(gè)高親和力的特異性結(jié)合的克隆。表達(dá)純化該克隆(圖3)，進(jìn)行鑒定，即得到一種中和新疆出血熱病毒的抗體XHF4RC8，并對(duì)其進(jìn)行鑒定分析。

通過ELISA對(duì)XHF4RC8的結(jié)合性進(jìn)行了鑒定，用建庫(kù)骨架m0為對(duì)照。ELISA實(shí)驗(yàn)證明XHF4RC8能夠與篩選用抗原特異性結(jié)合(圖4)，病毒中和試驗(yàn)證明XHF4RC8能夠抑制新疆出血熱假病毒感染293T細(xì)胞(圖5)，因此，該抗體具有中和新疆出血熱病毒的作用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種載體，其包含SEQ ID NO：2。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種宿主細(xì)胞，其含有SEQ ID NO：2或含有SEQ ID NO：2的載體。

本發(fā)明提供上述單域抗體在制備預(yù)防或治療新疆出血熱病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的新疆出血熱病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含單域抗體XHF4RC8。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種偶聯(lián)抗體，其包含單域抗體XHF4RC8。該偶聯(lián)抗體是指單域抗體XHF4RC8和其它分子偶聯(lián)，包括但不僅限于放射性同位素、毒素，形成的偶聯(lián)抗體。

進(jìn)一步地，該偶聯(lián)抗體在制備預(yù)防或治療新疆出血熱病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的新疆出血熱病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含上述偶聯(lián)抗體。

在另一個(gè)方面，本發(fā)明提供一種融合抗體，其包含單域抗體XHF4RC8。該融合抗體是指單域抗體XHF4RC8和其它多肽，此處所指的多肽從數(shù)個(gè)氨基酸的肽段到蛋白質(zhì)，融合后的融合抗體。

進(jìn)一步地，該融合抗體在制備預(yù)防或治療新疆出血熱病毒感染的藥物中的應(yīng)用。

進(jìn)一步地，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)生物樣品中的新疆出血熱病毒囊膜蛋白的試劑盒，其包含上述融合抗體。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種藥物組合物，其至少包含XHF4RC8或上述偶聯(lián)抗體、融合抗體的任意一種。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，該藥物組合物進(jìn)一步包含藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和/或稀釋劑。

噬菌體展示技術(shù)目前廣泛應(yīng)用于抗體篩選及其它領(lǐng)域。它是將外源基因(即本發(fā)明中的基于VH的文庫(kù))同絲狀噬菌體的外殼蛋白P3基因(或P8)基因融合后導(dǎo)入噬菌體基因組，表達(dá)產(chǎn)生的外源肽與外殼蛋白P3(或P8)形成融合蛋白，展示在噬菌體的表面。導(dǎo)入了各種各樣外源基因的一群噬菌體，就構(gòu)成一個(gè)展示各種各樣外源蛋白的噬菌體展示庫(kù)。當(dāng)用一個(gè)抗原(即本發(fā)明中的新疆出血熱病毒囊膜蛋白Gc結(jié)構(gòu)域III)去篩查一個(gè)噬菌體展示庫(kù)時(shí)，就會(huì)選擇性地同與其有相互作用的某個(gè)外源蛋白相結(jié)合。經(jīng)過多輪篩選，那些能結(jié)合抗原的克隆(即本發(fā)明中的XHF4RC8)被富集，然后可以通過測(cè)序、表達(dá)進(jìn)行鑒定。

本發(fā)明使用的術(shù)語“單域抗體”，指基于人源抗體IgG1的VH結(jié)構(gòu)域的一類抗體，如圖1所示。相對(duì)于全長(zhǎng)單抗，單域抗體具有更好的組織滲透性和結(jié)合空間上存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下的主要突出效果和優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的創(chuàng)新在于從人IgG1的VH結(jié)構(gòu)域?yàn)楣羌艿氖删w表面展示文庫(kù)中，以原核表達(dá)的新疆出血熱病毒囊膜蛋白Gc結(jié)構(gòu)域III為抗原，篩選得到一種中和新疆出血熱病毒的單域抗體XHF4RC8。本發(fā)明提供的這種單域抗體，是一種病毒中和抗體，其優(yōu)點(diǎn)在于：首先，相對(duì)于全長(zhǎng)單抗(分子量～150kD)，XHF4RC8分子量較小(～14kD)，具有更好的組織滲透性和結(jié)合存在位阻效應(yīng)的抗原表位的能力，甚至能夠開發(fā)成口服藥；其次，XHF4RC8可在原核表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行表達(dá)，生產(chǎn)成本低、周期短。

附圖說明

圖1為VH的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖2為新疆出血熱病毒囊膜蛋白Gc結(jié)構(gòu)域III的表達(dá)純化；

泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，泳道1為目的蛋白。

圖3為純化的單域抗體XHF4RC8經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)；

泳道M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，其余泳道為咪唑濃度梯度洗脫的目的蛋白。

圖4為ELISA測(cè)定的XHF4RC8和新疆出血熱病毒囊膜蛋白的結(jié)合；

XHF4RC8(■)與抗原蛋白的結(jié)合濃度EC₅₀為450nM，骨架m0(●)為陰性對(duì)照。

圖5為XHF4RC8中和新疆出血熱假病毒實(shí)驗(yàn)；

(A)添加1000nM濃度XHF4RC8對(duì)假病毒抑制效果；(B)添加100nM濃度XHF4RC8對(duì)假病毒抑制效果；(C)重組水皰性口炎病毒VSVG作陰性對(duì)照；(D)空細(xì)胞培養(yǎng)板孔對(duì)照。

具體實(shí)施方式

通過以下詳細(xì)說明結(jié)合附圖可以進(jìn)一步理解本發(fā)明的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn)。所提供的實(shí)施例僅是對(duì)本發(fā)明方法的說明，而不以任何方式限制本發(fā)明揭示的其余內(nèi)容。

下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，如《分子克?。簩?shí)驗(yàn)室指南》(New York:Cold Spring Harborlaboratory Press,2001)中所述的條件進(jìn)行。

【實(shí)施例1】表達(dá)并純化新疆出血熱病毒囊膜蛋白

根據(jù)新疆出血熱病毒的基因序列(GenBank No.gi|16271971)，分析其氨基酸序列，合成其囊膜蛋白Gc的結(jié)構(gòu)域III(氨基酸406-521)，將基因與載體pET22b連接、轉(zhuǎn)化，構(gòu)建載體pET22b-Gc Domain III。將100ng質(zhì)粒(pET22b-Gc DomainIII)轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞。再接種菌種于含100μg/ml氨芐的LB培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基中含10g胰蛋白胨、5g酵母提取物和10g NaCl)中，待OD₆₀₀達(dá)到0.6～1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為0.1mmol/ml，于30℃、220rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)16～20h。4℃、6000rpm、15min離心收集菌體，棄培養(yǎng)基，沉淀重懸于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再經(jīng)多粘菌素B(polymyxin B)處理1小時(shí)后離心收集上清。用Ni-NTA填料純化，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度。隨后用截留分子量為3kD的超濾離心管超濾濃縮。所得到的是C-末端含6×His標(biāo)簽的新疆出血熱病毒囊膜蛋白Gc結(jié)構(gòu)域III蛋白。

用鼠源anti-His作為一抗(所用載體在所表達(dá)蛋白的C端提供6×His Tag標(biāo)簽用于檢測(cè))通過蛋白免疫印跡(Western Blot)檢測(cè)其囊膜蛋白Gc的結(jié)構(gòu)域III的表達(dá)，如圖2所示。

在檢測(cè)到其囊膜蛋白Gc的結(jié)構(gòu)域III表達(dá)后，擴(kuò)大培養(yǎng)與誘導(dǎo)規(guī)模，大量表達(dá)其囊膜蛋白Gc的結(jié)構(gòu)域III蛋白。Ni-NTA Resin純化目的蛋白，隨后用截留分子量為3kD的超濾離心管超濾置換緩沖液，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度。

【實(shí)施例2】噬菌體展示庫(kù)的構(gòu)建以及篩選

以m0為骨架，按照已有的文獻(xiàn)構(gòu)建噬菌體庫(kù)(W Chen,et al.,Methods MolBiol,2009:81-99)，以大腸桿菌表達(dá)的抗原進(jìn)行了篩選。將純化后的抗原在96孔板中4℃孵育過夜時(shí)后，用噬菌體庫(kù)中進(jìn)行淘選，特異性的噬菌體被抗原所捕獲，用PBS+0.05％Tween-20清洗，經(jīng)過4輪篩選，得到一個(gè)富集的克隆，命名為XHF4RC8。

【實(shí)施例3】XHF4RC8的表達(dá)純化

按照已有文獻(xiàn)(Gong R,et al.,Methods Mol Biol.,2012)對(duì)XHF4RC8進(jìn)行表達(dá)和純化。構(gòu)建原核XHF4RC8表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化入E.coli HB2151感受態(tài)細(xì)胞中。再接種菌種于含100μg/ml氨芐的SB培養(yǎng)基(1L培養(yǎng)基中含30g胰蛋白胨、20g酵母提取物和10g MOPS，pH值用NaOH調(diào)至7.0)中，待OD₆₀₀達(dá)到0.7～1.0時(shí)加入IPTG至終濃度為200μg/ml，于37℃、220rpm的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)14～16h。4℃、6000rpm、15min離心收集菌體，棄培養(yǎng)基，沉淀重懸于Buffer A(50mM Tris-HCL，450mM NaCL，pH 8.0)中，再經(jīng)多粘菌素B(polymyxin B)處理1小時(shí)后離心收集上清。用Ni-NTA填料純化，經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證其純度。隨后用截留分子量為3kD的超濾離心管超濾濃縮。所得到的XHF4RC8的C-末端含6×His標(biāo)簽和FLAG標(biāo)簽，如圖3所示。

【實(shí)施例4】ELISA測(cè)定XHF4RC8和囊膜蛋白的結(jié)合

將囊膜蛋白結(jié)構(gòu)域III蛋白(2μg/mL)包被在ELISA板上，4℃孵育過夜后用PBS+3％milk于37℃封閉1h。加入系列稀釋的XHF4RC8，37℃孵育2小時(shí)后用PBST(PBS+0.05％Tween 20)洗四次，再加辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的鼠抗FLAG單克隆抗體于37℃孵育1小時(shí)后，用PBST洗四次，再加入ABTS進(jìn)行檢測(cè)。骨架m0作為陰性對(duì)照。XHF4RC8和新疆出血熱病毒囊膜蛋白結(jié)合的EC₅₀為450nM，m0不能與囊膜蛋白結(jié)合，如圖4所示。

【實(shí)施例5】在293T細(xì)胞中XHF4RC8抗體中和新疆出血熱假病毒。

以新疆出血熱假病毒作為抗體中和的病毒目標(biāo)，以水泡性口炎重組病毒(VSVG)為陰性對(duì)照病毒，檢測(cè)候選抗體能否特異性的抑制新疆出血熱假病毒的感染，同時(shí)不能影響對(duì)照組病毒。將100μL的293T(1×10⁵個(gè)/ml)細(xì)胞接種96孔板，培養(yǎng)14～16h。將XHF4RC8抗體加入到新疆出血熱假病毒中，XHF4RC8終濃度最高為1000nM，依次10倍稀釋，最低濃度為100nM(稀釋10倍)37℃孵育30分鐘。棄96孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基，用病毒和抗體混合液感染細(xì)胞，37℃孵育2小時(shí)。棄病毒液后，用PBS清洗3次，加入含有2％胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃孵育。第二天在熒光顯微鏡下統(tǒng)計(jì)綠色細(xì)胞的個(gè)數(shù)，抗體100％中和效率即無綠色細(xì)胞。被病毒感染的細(xì)胞在熒光顯微鏡下觀察，能夠發(fā)射綠色熒光，沒有感染病毒的細(xì)胞不發(fā)光。隨著抗體濃度的增加，呈現(xiàn)綠色的293T細(xì)胞逐漸減少，表明被新疆出血熱假病毒感染的細(xì)胞數(shù)目減少，即表示XHF4RC8可以中和新疆出血熱假病毒。作為陰性對(duì)照，未檢測(cè)到抑制水泡性口炎的感染。