本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于錨定-粘合機制的蛋白質(zhì)多層定向固定化方法。

背景技術(shù)：

天然酶是生產(chǎn)實踐中最高效的溫和催化劑，對人們的日常生活具有非常重要的意義。當天然酶被提取出來應用于生產(chǎn)實踐中時，它的穩(wěn)定性變差導致容易失活，而且不能夠再重復利用。因此人們將酶在載體表面進行固定化，這樣可以克服天然酶存在的不足，還保留天然酶的高效性、高選擇性等優(yōu)點，有利于工業(yè)生產(chǎn)中的連續(xù)操作。因此固定化酶技術(shù)成為酶工程研究領(lǐng)域中的熱點和重點對象。

目前傳統(tǒng)固定化酶技術(shù)已經(jīng)有了重大突破以及取得了很多的重要的成果，然而在傳統(tǒng)常見的固定化酶技術(shù)中酶分子一般是多個位點與載體進行結(jié)合，這樣很容易導致酶分子的催化活性中心被載體阻擋，同時固定化酶的數(shù)量少，這些最終導致酶催化活性效率下降。為了克服存在的這種問題，越來越多的人開始探索研究新的固定化方法和尋找新的固定化載體，盡可能保證固定化酶的催化活性中心不受破壞，同時提高固定酶的數(shù)量。

纖維素是自然界中最為豐富的、可再生的天然高分子聚合物，其中微晶纖維素由于具有高穩(wěn)定性、比表面積大、生物安全性好、價格便宜等特點成為了一種性能優(yōu)良的生物材料，因此對纖維素的高附加值利用已經(jīng)變成了一個研究熱點。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有固定化技術(shù)存在的固定化酶數(shù)量少和固定化酶蛋白分子活性中心被隱藏等不足，通過基因工程技術(shù)手段改造固定化蛋白質(zhì)使其按照同一方向固定在纖維素表面，保證該蛋白活性中心在固定化之后的完整性。在本發(fā)明中引入支架蛋白作為載體與固定化蛋白之間的橋梁，通過控制支架蛋白長度來間接調(diào)控固定蛋白質(zhì)的數(shù)量，最終實現(xiàn)蛋白質(zhì)多層定向固定化。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

1、一種基于錨定-粘合機制的蛋白質(zhì)多層定向固定化方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)設(shè)計、分子改造和生物制備，具體包括：

①支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能設(shè)計：支架蛋白由1-12個粘合域結(jié)構(gòu)組成而且沒有催化活性；固定化蛋白質(zhì)碳末端添加錨定域結(jié)構(gòu)，使得能夠親和識別粘合域。

②錨定域基因與粘合域基因的分子克隆。

③拼接1-12個不同數(shù)量的錨定域基因構(gòu)成了不同長度的支架蛋白，然后在支架蛋白碳末端插入纖維素結(jié)合域CBM基因和氮末端添加組氨酸標簽，最后是支架蛋白的微生物可溶性胞內(nèi)表達驗證以及支架蛋白的分離純化。

⑤固定化蛋白質(zhì)的基因修飾，即在該蛋白氮末端插入錨定域基因構(gòu)建新的融合蛋白，為了保證該融合蛋白的可溶性表達因此在固定化蛋白和錨定域中間插入GS-Linker短肽，最后是固定化蛋白質(zhì)的微生物胞外分泌表達以及其驗證該融合蛋白是否與支架蛋白發(fā)生特異性親和吸附作用。

(2)固定化前對載體進行表面封閉處理，目的是封閉載體表面微孔隙防止支架蛋白的非特異性吸附。具體操作是將載體分散在質(zhì)量濃度為1％牛血清蛋白溶液中，在20℃條件下振蕩1h，然后離心除去上清液，并用pH 8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

(3)支架蛋白與載體的親和吸附，形成載體-支架蛋白自組裝體。具體操作是將表達純化后不同長度的支架蛋白與封閉處理后的載體在20℃條件下進行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

(4)固定化蛋白與載體-支架蛋白的親和固定吸附，最終進行多蛋白的自組裝體系。具體操作是將載體-支架蛋白與表達純化后的固定化蛋白質(zhì)在4℃條件下進行振蕩混合12h，并且添加終濃度為10mM的氯化鈣促進固定化蛋白質(zhì)的吸附，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。

進一步，所述步驟(1)中支架蛋白由纖維素結(jié)合域CBM和粘合域組成，而且該支架蛋白長度范圍為1-12個粘合域。

進一步，所述步驟(1)中固定化蛋白質(zhì)基因后面連接錨定域，而且該蛋白基因與錨定域中間由基因長度為21pb的GS-linker短肽連接。

進一步，所述步驟(1)中支架蛋白與固定化蛋白均帶有組氨酸標簽，通過蛋白的組氨酸標簽與金屬鎳進行親和吸附作用除去雜蛋白。

進一步，所述步驟(2)中的載體材料為纖維素。

進一步，所述步驟(3)中支架蛋白與載體進行反應的固液質(zhì)量比為1:20，固定化溫度為20℃。

進一步，所述步驟(4)中固定化蛋白與載體的固液質(zhì)量比為1:40，固定化溫度為4℃，而且必須要添加終濃度10mM的氯化鈣促進固定化吸附作用。

在本發(fā)明的一方面，提供一種支架蛋白的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)種屬和類型特異性的錨定域基因與粘合域基因的分子克隆

(2)不同長度支架蛋白的粘合域基因之間柔性分子拼接

(3)碳端引入纖維素結(jié)合域，氮端添加組氨酸標簽

(4)支架蛋白的可溶性胞內(nèi)表達以及分離純化

步驟(1)具體為：粘合域與纖維結(jié)合域基因原始序列來源于熱纖梭菌，因此設(shè)計引物以該模板進行PCR擴增獲得粘合域與纖維素結(jié)合域構(gòu)基因。

步驟(2)具體為：通過雙酶切手段把擴增獲得的粘合域基因有序的進行不同長度的拼接，插入到pET22b質(zhì)粒中。

步驟(3)具體為：通過酶切手段在該支架蛋白的碳端插入纖維素結(jié)合域，同時在氮端添加了組氨酸標簽。

步驟(4)具體為：將構(gòu)建完畢的pET22b質(zhì)粒導入到BL21中進行蛋白的可溶性驗證，利用組氨酸標簽對該蛋白進行純化。

在本發(fā)明的另一方面，提供一種固定化蛋白的構(gòu)建方法，該方法包括如下步驟：

(1)種屬和類型特異性的錨定域基因的分子克隆

(2)固定化蛋白基因與特定錨定域基因的柔性分子對接

(3)固定化蛋白氮端引入基因長度為21pb的GS-Linker短肽

(4)固定化蛋白的可溶性表達以及分離純化

步驟(1)具體為：錨定域基因原始序列來源于熱纖梭菌，因此設(shè)計引物以該模板進行PCR擴增獲得錨定域基因。

步驟(2)具體為：將擴增的錨定域基因插入到PYD質(zhì)粒的GS-Linker短肽后面，然后接著在GS-Linker短肽前面插入固定化蛋白質(zhì)基因，最后將這構(gòu)建的所有基因進行PCR擴增，插入到PETDuet質(zhì)粒中。

步驟(3)具體為：將構(gòu)建完畢的PETDuet質(zhì)粒導入到BL21中進行蛋白的可溶性驗證，利用組氨酸標簽對該蛋白進行純化。

本發(fā)明的有益效果：

本課題借助基因重組技術(shù)手段，構(gòu)建了一套完整的多層定向自主裝固定化蛋白體系，體系中引入支架蛋白作為固定載體與固定目標蛋白之間的橋梁，這樣提高了固定化蛋白復合體系的生物相容性，一方面可以使得支架蛋白與固定化蛋白質(zhì)特異性定向結(jié)合，從而克服了傳統(tǒng)固定化蛋白中催化活性位點被隱藏的缺點，另一方面通過可控性調(diào)節(jié)支架蛋白的長短來間接控制固定目標蛋白的數(shù)量，這種方法固定的蛋白質(zhì)數(shù)量遠遠大于傳統(tǒng)單層固定化蛋白的數(shù)量。

附圖說明

圖1支架蛋白發(fā)酵液蛋白電泳圖

圖2支架蛋白發(fā)酵液純化后蛋白電泳圖

圖3綠色熒光蛋白GFP純化后蛋白電泳圖

圖4纖維素吸附支架蛋白及GFP復合體電泳圖

圖5固定化載體纖維素熒光顯微鏡圖片

具體實施方式

以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，分子克?。簩嶒炇也僮魇謨灾兴龅臈l件或者按照說明書所建議的條件。

實施例1支架蛋白的制備

一、支架蛋白質(zhì)粒材料：

用于克隆的大腸桿菌為E.coli TOP10，用于目的基因表達菌株為E.coli BL21(DE3)，均從天根生化科技(北京)有限公司購買。

二、支架蛋白表達質(zhì)粒的構(gòu)建：

根據(jù)已知粘合域基因序列，用合成方法得到兩種脫氧核糖核苷酸鏈olpb-1-NdeI-F和olpb-1-NcoI-R，以上引物委托生工生物工程(上海)有限公司合成，然后以這兩種脫氧核糖核苷酸鏈為引物，以熱纖梭菌基因組DNA為模板，PCR擴增得到一條522pb的DNA分子，用瓊脂糖凝膠電泳檢測并將目的基因條帶通過膠回收試劑盒進行純化回收，將該回收的目的基因DNA和質(zhì)粒pET22b由NdeI和NcoI限制性內(nèi)切酶進行雙酶切，再通過PCR回收試劑盒進行純化回收，將兩者的回收產(chǎn)物用T4連接酶于16℃過夜連接，得到重組質(zhì)粒pET22b-olpb-1，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入Top10感受態(tài)細胞中進行重組質(zhì)粒的擴增以及序列驗證。同理上述相同的實驗方法，使用olpb-2-NcoI-F和olpb-2-BamHI-R這對引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-2，使用olpb-3-BamHI-F和olpb-3-EcoRI-R這對引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-3，使用olpb-4-EcoRI-F和olpb-4-SalI-R這對引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-4，使用olpb-5-SalI-F和olpb-5-HindIII-R這對引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-5，使用olpb-6-HindIII-F和olpb-6-NotI-R這對引物構(gòu)建得到質(zhì)粒pET22b-olpb-6，最終構(gòu)建出六種不同長度的支架蛋白質(zhì)粒。此外使用CBM-NdeI-F和CBM-NdeI-R這對引物擴增纖維素結(jié)合域CBM基因，然后在這六個支架蛋白質(zhì)粒的NotI/XhoI的酶切位點插入纖維素結(jié)合域CBM基因，目的是使得支架蛋白能夠特異性的結(jié)合在纖維素表面，最后把這六種構(gòu)建完畢的支架蛋白質(zhì)粒導入到大腸桿菌BL21中進行表達，最后挑取測序正確的單菌落進行甘油管保存該菌種。本實驗實際一共構(gòu)建了1-12種不同長度的支架蛋白，最后發(fā)現(xiàn)隨著支架蛋白分子量的增加目標蛋白會越難以表達，此外支架長度過長容易導致固定化蛋白進行固定化時傳質(zhì)效果下降，經(jīng)過實驗探索發(fā)現(xiàn)1-6長度的支架蛋白固定化效率最高，因此選擇1-6長度的支架蛋白作為本發(fā)明實驗對象。

三、支架蛋白表達：

將保藏的支架蛋白甘油管進行活化，即在超凈臺中取菌液，以1/1000接種量接種至4ml LB液體培養(yǎng)基，并在培養(yǎng)基中加入抗性氨芐青霉素，加入量為培養(yǎng)基體積的1/1000，在37℃、180rpm搖床培養(yǎng)12h。用250mL搖瓶配50mL的液體LB培養(yǎng)基，并用高溫滅菌鍋滅菌。等待滅菌培養(yǎng)基滅菌冷卻后，然后從上述培養(yǎng)的4ml LB試管中取出菌液以1％的接種量接種到250ml搖瓶中，同理加入培養(yǎng)基體積1/1000的氨芐青霉素，放在37℃搖床培養(yǎng)，當培養(yǎng)OD600nm為0.6時大腸桿菌處于對數(shù)生長期，此時在無菌操作環(huán)境下加入培養(yǎng)基體積2/1000的誘導劑IPTG(終濃度為0.2mM)，繼續(xù)過夜20℃培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后，測定發(fā)酵液的OD值，然后將發(fā)酵的菌液在7000rpm、5min的條件下離心，用去離子水重懸離心得到的菌體后再次以相同的條件離心。然后計算濃縮OD為20時該加入的PH8.0tris-Hcl緩沖液的體積，加入緩沖液后將菌體重懸后進行4℃超聲破胞，條件為間隔3s、運行3s、工作次數(shù)90次，功率在120-160w之間，然后在13000rpm、4℃條件下離心該菌體破胞液10min，收集上清液，最后將該上清液跑SDS-PAGE蛋白電泳，驗證支架蛋白的表達效果(見圖1)，比對發(fā)現(xiàn)蛋白電泳圖中支架蛋白目標條帶位置與理論值大小相符合，其中olpb-1蛋白量分子大小為45.0kD，olpb-2蛋白量分子大小為64.6kD，olpb-3蛋白量分子大小為84.2kD，olpb-4蛋白量分子大小為103.8kD，olpb-5蛋白量分子大小為123.4kD，olpb-6蛋白量分子大小為143.0kD。

在支架蛋白進行發(fā)酵表達的時候，除了目的蛋白以外還會有少量的其它雜蛋白同時表達，為了除去雜蛋白，對上述破胞離心后的發(fā)酵液進行純化，利用支架蛋白上的組氨酸標簽與鎳金屬結(jié)合的原理進行過鎳柱純化，跑蛋白電泳SDS-PAGE驗證純化效果(見圖2)，通過與圖1比對可看出純化效果良好。

實施例2固定化蛋白質(zhì)的制備

一、固定化蛋白質(zhì)質(zhì)粒材料：

使用的PYD質(zhì)粒來源于實驗室保藏，用于克隆的大腸桿菌E.coli TOP10由天根生化科技(北京)有限公司提供，用于目的基因表達菌株為E.coli BL21(DE3)，從天根生化科技(北京)有限公司購買。

二、固定化蛋白質(zhì)表達質(zhì)粒的構(gòu)建

本發(fā)明使用了綠色熒光蛋白GFP作為固定化蛋白質(zhì)，利用設(shè)計的引物docCipA-NheI-F和docCipA-NheI-R從熱纖梭菌中擴增錨定域docCipA基因，對載體PYD與錨定域docCipA基因進行單酶切NheI處理，在16℃進行連接過夜然后導入到大腸桿菌Top10中進行質(zhì)粒的擴增，篩選陽性重組子并進行測序驗證，保藏正確的菌種進行下一步驗證。利用GFP-HindIII-F和GFP-HindIII-R這對引物擴增GFP基因，然后在上述構(gòu)建正確質(zhì)粒的HindIII酶切位點處插入GFP基因。最后設(shè)計引物GFP-GSlinker-docCipA-SacI-F和GFP-GSlinker-docCipA-SacI-R將GFP-GSlinker-docCipA這段基因擴增，對該擴增的基因與PETDuet載體進行SacI單酶切處理，同理在16℃進行連接過夜然后導入到大腸桿菌BL21中，篩選陽性重組子并進行測序驗證，保藏正確的菌種。

三、固定化蛋白質(zhì)的表達：

表達固定化蛋白質(zhì)GFP的方法與表達支架蛋白的方法相同，同理對GFP進行鎳柱純化處理，出去表達的雜蛋白，跑蛋白電泳SDS-PAGE驗證結(jié)果(圖3)，比對發(fā)現(xiàn)固定化蛋白質(zhì)條帶位置與理論GFP蛋白大小48.2kD大小相符。

實施例3蛋白質(zhì)復合體多層定向固定化實驗

一、蛋白質(zhì)多層定向固定化原理

本發(fā)明選取微晶纖維素作為固定化蛋白質(zhì)的載體，同時選取綠色熒光蛋白GFP作為固定化蛋白質(zhì)，這樣可以通過檢測GFP熒光來表征固定化情況。本發(fā)明中支架蛋白通過其末端的纖維素結(jié)合域CBM與載體微晶纖維素發(fā)生作用力很強的親和固定，然后綠色熒光蛋白GFP通過其末端的錨定域docCipA與支架蛋白上的粘合域olpb再進行親和吸附固定化，最終實現(xiàn)了纖維素載體、支架蛋白以及綠色熒光蛋白三者之間的多層定向自組裝。

二、蛋白質(zhì)復合體多層定向固定化實驗

實驗首先使用質(zhì)量濃度為1％牛血清蛋白BSA封閉處理微晶纖維素表面微孔，在20℃條件下振蕩1h，防止目標蛋白和微晶纖維素發(fā)生非特異性吸附，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。接著將表達純化后六種長度的支架蛋白與處理后的纖維素在20℃條件下進行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次。最后將吸附了支架的纖維素與表達純化后的固定化蛋白質(zhì)GFP在4℃條件下進行振蕩混合12h，然后離心除去上清液，并用pH8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次，取一部分固定化后的纖維素載體跑蛋白電泳SDS-PAGE(圖4)，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)纖維素能夠固定不同長度的支架蛋白，而且均能夠固定GFP，這說明蛋白質(zhì)復合體固定化效果良好。此外，設(shè)置對比實驗使纖維素與GFP進行混合反應，用ph 8.0Tris-Hcl緩沖液洗滌三次，然后使用熒光顯微鏡觀察該固定化后的纖維素載體(圖5)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無支架蛋白的對照組基本沒有熒光，有支架蛋白的實驗組都有熒光，而且隨著支架蛋白長度增加后固定的GFP越多熒光量也跟著越強。