本發(fā)明屬于藥物
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及從烏藥的干燥塊根中分離得到的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的高度氧化的倍半萜類化合物及其制備方法。
背景技術(shù)：
：烏藥為樟科(Lauraceae)山胡椒屬(Lindera)植物烏藥(Linderaaggregata(Sims)Kosterm.)的干燥塊根。全年均可采挖，除去細(xì)根，洗凈，趁鮮切片，曬干，或直接曬干。主產(chǎn)于浙江、安徽、湖南、廣東、廣西等地。烏藥作為中國傳統(tǒng)中藥具有行氣止痛，溫腎散寒的作用。主治胸脅滿悶、脘腹脹痛、頭痛、寒疝疼痛、痛經(jīng)及產(chǎn)后腹痛、尿頻、遺尿等證。烏藥的化學(xué)成分種類較多，目前報(bào)道的主要成分有揮發(fā)油、異喹啉生物堿、倍半萜及其內(nèi)酯、黃銅類等成分。烏藥的根、葉、果皮及種子中均含有揮發(fā)油，其主要成分多為常見的單萜和倍半萜類化合物。烏藥所含的生物堿以異喹啉型生物堿為主。烏藥中報(bào)道最多的成分是呋喃倍半萜及其內(nèi)酯，并且該類成分是烏藥的特征性成分，具有較強(qiáng)的專屬性，2010版中國藥典中規(guī)定以烏藥醚內(nèi)酯作為烏藥含量測(cè)定的指標(biāo)性成分。烏藥的化學(xué)成分復(fù)雜，藥理作用廣，具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗病毒、抑菌、抗氧化、抗疲勞、調(diào)節(jié)消化道、松弛內(nèi)臟平滑肌、改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能、調(diào)理婦科病癥等藥理作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種從烏藥的干燥塊根中分離得到的一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的高度氧化的倍半萜類化合物及其制備方法。本發(fā)明的上述目的是通過下面的技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)的：具有下述結(jié)構(gòu)式的化合物(Ⅰ)，所述的化合物(Ⅰ)的制備方法，包含以下操作步驟：(a)將烏藥的干燥塊根粉碎，用75～85％乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用75％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1、65:1、30:1、15:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1、15:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8～10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)。進(jìn)一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。進(jìn)一步地，所述用乙醇熱回流提取采用的乙醇濃度為80％。一種藥物組合物，其中含有治療有效量的所述的化合物(Ⅰ)和藥學(xué)上可接受的載體。所述的化合物(Ⅰ)在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的應(yīng)用。所述的藥物組合物在制備神經(jīng)保護(hù)藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明化合物用作藥物時(shí)，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。該藥物組合物含有治療有效量的本發(fā)明化合物(Ⅰ)，其余為藥物學(xué)上可接受的、對(duì)人和動(dòng)物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料以及藥物制品輔劑。將本發(fā)明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發(fā)明藥物可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時(shí)，可將其制成片劑、緩釋片、控釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等；用于注射時(shí)，可制成滅菌的水性或油性溶液、無菌粉針、脂質(zhì)體或乳劑等。附圖說明圖1為化合物(Ⅰ)結(jié)構(gòu)式；圖2為化合物(Ⅰ)理論ECD值與實(shí)驗(yàn)ECD值比較。具體實(shí)施方式下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明保護(hù)范圍。盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和范圍。實(shí)施例1：化合物(Ⅰ)分離制備及結(jié)構(gòu)確證試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學(xué)試劑有限公司。制備方法：(a)將烏藥的干燥塊根(8kg)粉碎，用80％乙醇熱回流提取(25L×3次)，合并提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水飽和的正丁醇(3L×3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(351g)和正丁醇萃取物；(b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用10％乙醇洗脫6個(gè)柱體積，再用75％乙醇洗脫8個(gè)柱體積，收集75％乙醇洗脫液，減壓濃縮得75％乙醇洗脫物浸膏(133g)；(c)步驟(b)中75％乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為90:1(8個(gè)柱體積)、65:1(8個(gè)柱體積)、30:1(6個(gè)柱體積)、15:1(8個(gè)柱體積)和1:1(5個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個(gè)組分；(d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進(jìn)一步分離，依次用體積比為25:1(8個(gè)柱體積)、15:1(10個(gè)柱體積)和5:1(6個(gè)柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個(gè)組分；(e)步驟(d)中組分2(17g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70％的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個(gè)柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(Ⅰ)(31mg)。結(jié)構(gòu)確證：無色油狀物；HR-ESIMS顯示[M+Na]+為m/z273.1526，結(jié)合核磁特征可得分子式為C15H22O3，不飽和度為5。核磁共振氫譜數(shù)據(jù)δH(ppm，DMSO-d6，500MHz)：H-1(5.86，s)，H-3(3.57，d，J＝11.6)，H-3(3.69，d，J＝11.6)，H-5(4.18，br，s)，H-6(1.83，ddd，J＝5.0，9.4，14.2)，H-6(2.01，m)，H-7(2.04，m)，H-8(1.39，m)，H-8(1.42，m)，H-9(2.05，m)，H-9(2.12，m)，H-12(3.99，br，s，2H)，H-13(4.90，br，s)，H-13(5.04，br，s)，H-14(1.58，s)，H-15(5.07，s)，H-15(5.25，s)；核磁共振碳譜數(shù)據(jù)δC(ppm，DMSO-d6，125MHz)：133.4(CH，1-C)，198.7(C，2-C)，50.1(CH2，3-C)，150.2(C，4-C)，75.6(CH，5-C)，32.1(CH2，6-C)，33.2(CH，7-C)，30.6(CH2，8-C)，35.5(CH2，9-C)，134.3(C，10-C)，155.5(C，11-C)，65.3(CH2，12-C)，111.4(CH2，13-C)，17.1(CH3，14-C)，114.4(CH2，15-C)；碳原子標(biāo)記參見圖1。1H-NMR譜數(shù)據(jù)顯示一個(gè)甲基信號(hào)[δH1.58(s，Me-14)]，一個(gè)含氧亞甲基信號(hào)[δH3.99(2H，br，s，H-12)]，兩個(gè)烯屬亞甲基信號(hào)[δH4.90(br，s，H-13)，5.04(br，s，H-13)，5.07(s，H-15)，5.25(s，H-15)]，一個(gè)烯屬次甲基質(zhì)子[δH5.86(s，H-1)]，以及一個(gè)含氧次甲基信號(hào)[δH4.18(br，s，H-5)]。13CNMR譜顯示了15個(gè)碳信號(hào)，包括一個(gè)甲基，七個(gè)亞甲基[一個(gè)含氧亞甲基δC65.3(C-12)，兩個(gè)烯屬亞甲基δC111.4(C-13)和114.4(C-15)]，三個(gè)次甲基[一個(gè)烯屬次甲基δC133.4(C-1)，一個(gè)含氧次甲基75.6(C-5)]，四個(gè)季碳[三個(gè)烯屬季碳δC150.2(C-4)，134.3(C-10)和155.5(C-11)，一個(gè)羰基碳δC198.7(C-2)]。根據(jù)核磁數(shù)據(jù)可知C-1和C-10，C-4和C-15，C-11和C-13之間含有雙鍵，C-5和C-12連有羥基，以及C-2為酮羰基。NOESY譜中H-5與H-3(δH3.57)的交叉峰，表明H-5為β構(gòu)型，則C-5-OH為α構(gòu)型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOESY譜，以及文獻(xiàn)關(guān)于相關(guān)類型核磁數(shù)據(jù)，可基本確定該化合物如圖1所示，立體構(gòu)型進(jìn)一步通過ECD試驗(yàn)確定，理論值與實(shí)驗(yàn)值基本一致(圖2)。實(shí)施例2：化合物(Ⅰ)藥理作用試驗(yàn)一、材料和儀器PC12細(xì)胞株，安徽中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心贈(zèng)與。Aβ1-40蛋白購于Sigma公司?；衔?Ⅰ)為自制，HPLC歸一化純度大于98％。DMEM/F12培養(yǎng)基(進(jìn)口分裝購于北京賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司。NewbomCalfSerum購于BeijingSolarbioScience&TechnologyCo.，Ltd。MTT購于美國Amresco公司。凱基AnnexinV-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購于南京凱基生物技術(shù)有限公司。多聚甲醛購于中國醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。Bcl-2多克隆抗體購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。Bax多克隆抗體購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。Cyt-c多克隆抗體購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。羊抗兔IgG/FITC購于北京博奧森生物技術(shù)有限公司。羊抗鼠IgG/(H+L)購于江蘇碧云天生物公司。正常山羊血清購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。SABC免疫組化試劑盒購于武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色試劑盒購于武漢博士德生物技術(shù)有限公司。電子分析天平(FA2004型，上海雷磁精密科學(xué)儀器公司)，水浴鍋(HH·SI1-4型，北京醫(yī)療器械廠)，酶標(biāo)儀(ELx-800型，美國Bio-Tek)，流式細(xì)胞儀(EPICXL-MCL型，美國BeckmanCouiter公司)，高速冷凍離心機(jī)(3K30型，美國Sigma公司，二氧化碳培養(yǎng)箱(CO-150型，美國NBS有限公司)，OLYMPUS熒光顯微鏡(BX41型，帶DP70攝像系統(tǒng)，日本Olympus公司產(chǎn)品)。二、試驗(yàn)方法1、Aβ1-40孵育Aβ1-40用去離子水配制成1000μmol/L儲(chǔ)存液并分裝，放置于冰箱-20℃儲(chǔ)存，臨用用前一周取出在37℃培養(yǎng)箱孵育7d，使之聚集老化。2、細(xì)胞的培養(yǎng)PC12細(xì)胞株用含10％胎牛血清、100U/而青霉素、100U/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基在玻璃培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為37℃，5％CO2濃度，飽和濕度，待細(xì)胞長至80％豐度后用0.25％的胰酶消化傳代1次(約2-3d)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長狀況，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。進(jìn)行MTT實(shí)驗(yàn)前將細(xì)胞接種到96孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)；流式細(xì)胞儀檢測(cè)前將細(xì)胞接種至6孔培養(yǎng)板用無血清培養(yǎng)既培養(yǎng)；免疫組化實(shí)驗(yàn)均用24孔培養(yǎng)板爬片法培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)基為無血清培養(yǎng)基。3、細(xì)胞給藥處理及分組細(xì)胞共分為五組，無血清培養(yǎng)基接種24h后進(jìn)行藥物干預(yù)：①正常對(duì)照組：正常PC12細(xì)胞；②模型組：25μmol/LAβ1-40；③化合物(Ⅰ)低劑量組：25μmol/LAβ1-40+50mg/L化合物(Ⅰ)；④化合物(Ⅰ)中劑量組：25μmol/LAβ1-40+100mg/L化合物(Ⅰ)；⑤化合物(Ⅰ)高劑量組：25μmol/LAβ1-40+200mg/L化合物(Ⅰ)。藥物處理24h后進(jìn)行檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。4、MTT檢測(cè)各組細(xì)胞活力取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，胰酶消化后以1×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度，每孔100μL接種于96孔板中無血清培養(yǎng)24h，然后按照上述分組方法進(jìn)行藥物干預(yù)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，24h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL繼續(xù)在CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4h，然后取出96孔培養(yǎng)板，棄去上清液，每孔加入150μL的DMSO，放在搖床上振蕩10min，待紫色結(jié)晶完全溶解后用酶標(biāo)儀在490nm波長處檢測(cè)各孔的吸光值。以只加培養(yǎng)液的孔為調(diào)零參照，細(xì)胞活力用百分比表達(dá)，視對(duì)照組的細(xì)胞活性為100％。結(jié)果計(jì)算：細(xì)胞存活率＝(實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值)/(對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值)×100％。5、統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0分析軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)結(jié)果進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，用均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間采用LSD比較，P<0.05為具有顯著性差異，P<0.01為極其顯著性差異，圖表由Excel2003繪制。三、結(jié)果及結(jié)論MTT測(cè)試結(jié)果顯示，與正常組細(xì)胞比較，模型組細(xì)胞活性明顯降低(P<0.01)，化合物(Ⅰ)干預(yù)后細(xì)胞活性有所提高，其中高、中劑量組細(xì)胞活性的升高具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，低劑量組細(xì)胞活性改變不大(P>0.05)。見表1(與模型組比較*P<0.05,**P<0.01)。結(jié)論，本研究證實(shí)Aβ1-40的毒性損害神經(jīng)細(xì)胞，引起PC12大量凋亡，細(xì)胞活性下降，化合物(Ⅰ)干預(yù)后凋亡情況得到改善。表1MTT法化合物(Ⅰ)對(duì)Aβ1-40誘導(dǎo)PC12細(xì)胞活性的影響(n＝6)組別處理方法細(xì)胞活性(％)正常對(duì)照組–100±0.0**模型組25μmol/LAβ1-4050.08±6.67化合物(Ⅰ)低劑量組25μmol/LAβ1-40+50mg/L化合物(Ⅰ)58.78±12.64化合物(Ⅰ)中劑量組25μmol/LAβ1-40+100mg/L化合物(Ⅰ)63.77±6.81*化合物(Ⅰ)高劑量組25μmol/LAβ1-40+200mg/L化合物(Ⅰ)83.95±10.58**實(shí)施例3片劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制粒壓片。實(shí)施例4口服液制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)口服液制法制成口服液。實(shí)施例5膠囊劑或顆粒劑的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。實(shí)施例6注射液的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規(guī)加注射用水，精濾，灌封滅菌制成注射液。實(shí)施例7無菌粉針的制備：按實(shí)施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有機(jī)酸如酒石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機(jī)酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封得粉針劑。上述實(shí)施例的作用在于說明本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性內(nèi)容，但并不以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì)和保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁1 2 3