本發(fā)明涉及細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種提高NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法。

背景技術(shù)：

轉(zhuǎn)染是將外源核酸導(dǎo)入真核細(xì)胞中并發(fā)揮其生物學(xué)作用的一種技術(shù)，導(dǎo)入的核酸包括DNA(質(zhì)粒和線性雙鏈DNA)，反義寡核苷酸及RNAi(RNA interference)。目前，基因轉(zhuǎn)染技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因組功能研究(基因表達(dá)調(diào)控，基因功能，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和藥物篩選研究)和基因治療研究。

NB4細(xì)胞是一種人急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞株，急性早幼粒細(xì)胞性白血病(APL)是急性白血病中的一種特殊類型，約占髓細(xì)胞性白血病的10％。NB4是一種轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，為懸浮細(xì)胞。目前轉(zhuǎn)染最好的是用Lonza的電轉(zhuǎn)儀及其轉(zhuǎn)染試劑。但是該設(shè)備價(jià)格昂貴，為普通電轉(zhuǎn)儀價(jià)格的數(shù)倍，所需要的專用配套試劑也不便宜。而且，國內(nèi)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道的大部分轉(zhuǎn)染方式的轉(zhuǎn)染效率大多只有30％左右。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的上述問題，本發(fā)明的主要目的在于提供一種提高NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法，使用普通的電轉(zhuǎn)染設(shè)備和條件即可大幅度提高轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50％。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種提高NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法，包括如下步驟：

1)將NB4懸浮細(xì)胞進(jìn)行半貼壁培養(yǎng)；

2)收集半貼壁培養(yǎng)的NB4懸浮細(xì)胞；

3)采用緩沖液吹打所述半貼壁培養(yǎng)的NB4懸浮細(xì)胞；

4)將含待表達(dá)基因的表達(dá)載體質(zhì)粒與所述吹打后的NB4懸浮細(xì)胞混合；

5)電穿孔轉(zhuǎn)染所述混合后的NB4懸浮細(xì)胞。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟1)中，在所述半貼壁培養(yǎng)時(shí)采用的培養(yǎng)基中加入血清。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述血清占培養(yǎng)基溶液體積的15-25％。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述血清為牛血清FBS，所述牛血清FBS占培養(yǎng)基溶液體積的20％。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟1)中，所述培養(yǎng)基中還加入雙抗，所述雙抗包括青霉素和鏈霉素。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述青霉素的濃度為80-120U/ml，鏈霉素的濃度為0.05-0.15mg/ml。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述培養(yǎng)基為RPMI 1640或IMDM培養(yǎng)基。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟1)中，培養(yǎng)溫度為35-37℃。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，將NB4懸浮細(xì)胞的一部分采用加入血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)，另一半采用加入血清和抗體的培養(yǎng)基培養(yǎng)。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟3)中，所述緩沖液為Hepes緩沖液或PBS緩沖液，所述Hepes緩沖液包括10mM 4-羥乙基哌嗪乙磺酸Hepes，40mM NaCl，pH 7.3；所述PBS緩沖液包括137mM Nacl，2.7mM Kcl，9.5mM磷酸鹽，pH 7.3。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟4)中，細(xì)胞濃度∶質(zhì)粒線性長度∶質(zhì)粒重量比為10⁶∶1kb∶5μg。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟5)中，所述電穿孔轉(zhuǎn)染采用電轉(zhuǎn)儀，所述電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)染條件為350V，400us，脈沖1次。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述電轉(zhuǎn)儀為Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀。

本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明在轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞前，先將其培養(yǎng)成半貼壁細(xì)胞；一般情況下，NB4細(xì)胞本身的生長情況是懸浮狀態(tài)，并且容易聚團(tuán)，因此容易引起細(xì)胞營養(yǎng)不良、狀態(tài)不好，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。而本發(fā)明中將其變成半貼壁細(xì)胞后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比懸浮狀態(tài)時(shí)好很多，有利于轉(zhuǎn)染。

(2)本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入血清有利于半貼壁細(xì)胞的形成，加入雙抗以抗病菌、真菌，避免污染，提高轉(zhuǎn)染的效率。

(3)本發(fā)明采用普通電轉(zhuǎn)儀即可轉(zhuǎn)染懸浮狀態(tài)的NB4細(xì)胞，在合適的電轉(zhuǎn)染條件下獲得了約為50％轉(zhuǎn)染效率。

附圖說明

圖1a、1b為使用本發(fā)明實(shí)施例2所述方法在NB4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，24h后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，圖1a為白光下細(xì)胞圖，圖1b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

圖2a、2b為使用本發(fā)明實(shí)施例5所述方法在NB4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，24h后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，圖2a為白光下細(xì)胞圖，圖2b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

圖3a、3b為現(xiàn)有技術(shù)方法在NB4細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒，24h后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，圖3a為白光下細(xì)胞圖，圖3b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過提供一種提高NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法，在普通的電轉(zhuǎn)染設(shè)備以及轉(zhuǎn)染條件下，轉(zhuǎn)染效率可達(dá)50％。

本發(fā)明實(shí)施例提高NB4細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的方法，包括如下步驟：

1)將NB4懸浮細(xì)胞進(jìn)行半貼壁培養(yǎng)；

2)收集半貼壁培養(yǎng)的NB4懸浮細(xì)胞；

3)采用緩沖液吹打所述半貼壁培養(yǎng)的NB4懸浮細(xì)胞；

4)將含待表達(dá)基因的表達(dá)載體質(zhì)粒與所述吹打后的NB4懸浮細(xì)胞混合；

5)電穿孔轉(zhuǎn)染所述混合后的NB4懸浮細(xì)胞。

在靜置培養(yǎng)的條件下培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，容易出現(xiàn)細(xì)胞成團(tuán)，而且細(xì)胞長得很快，細(xì)胞團(tuán)越變?cè)酱螅诶锩娴募?xì)胞接觸培養(yǎng)基的機(jī)會(huì)越來越小，容易營養(yǎng)不良，加速衰亡。半貼壁即細(xì)胞形態(tài)仍然為圓形，不像貼壁細(xì)胞那樣形態(tài)舒展，并且貼壁程度也不牢，可以用移液器輕松吹落，也不像傳統(tǒng)的貼壁細(xì)胞需要胰酶消化，如靜置培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞都是半貼壁的。因此若讓細(xì)胞成為半貼壁，由于細(xì)胞間有接觸抑制，細(xì)胞只要長滿表面積就不會(huì)有太多的增殖。這樣培養(yǎng)基的營養(yǎng)不會(huì)消耗的那么快，細(xì)胞的狀態(tài)也更加均衡，不會(huì)出現(xiàn)有的狀態(tài)很好，有的很差的情況。這樣就為轉(zhuǎn)染的成功提供了保障。因?yàn)檗D(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞的要求很高，狀態(tài)不佳的細(xì)胞 根本轉(zhuǎn)不進(jìn)去，對(duì)于本身不好轉(zhuǎn)染的細(xì)胞更是難上加難。當(dāng)然只有把握細(xì)胞增殖的規(guī)律，即使是半貼壁的細(xì)胞也不能讓它長過了。

為了更好的理解上述技術(shù)方案，下面將結(jié)合說明書附圖以及具體的實(shí)施方式對(duì)上述技術(shù)方案做詳細(xì)的說明。

實(shí)施例1

1、細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入15％胎牛血清FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后，細(xì)胞呈半貼壁狀(即雖然貼壁但細(xì)胞仍然是圓形的且貼壁不牢容易吹下，跟昆蟲細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的情況有點(diǎn)像，不像293系列的細(xì)胞懸浮和貼壁是兩種細(xì)胞狀態(tài))。

2、選擇一皿處于對(duì)數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染的頭一天按照1傳2傳代，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)85％的時(shí)候可以用于轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染時(shí)先把皿中的培養(yǎng)基棄上清，把殘液吸干凈，再采用加入15％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基1.5ml將皿中的細(xì)胞輕輕吹散。

4、將一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管(細(xì)胞計(jì)數(shù)用)，另一半細(xì)胞加入9.25ml含15％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。

5、從EP管中吸取10ul的細(xì)胞稀釋50倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用Hepes緩沖液將細(xì)胞稀釋到2X10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。

6、取400ul稀釋并混合均勻的細(xì)胞液于1.5ml EP管中，800rpm，5min。

7、棄上清，用200ul量程的槍頭吸取部分殘液，不要吸動(dòng)細(xì)胞。

8、用Hepes緩沖液將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(冰上預(yù)冷)的電轉(zhuǎn)杯中，加入5ug pEGFP-N1質(zhì)粒(申請(qǐng)人單位提供，通用質(zhì)粒)混合均勻。

9、采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀，將電轉(zhuǎn)儀條件設(shè)置為350V，400us，脈沖1次(n＝1),放入電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊操作。

10、電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加入了2ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基的6孔板中，再放入35℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

11、24h后可以觀察到發(fā)光情況，轉(zhuǎn)化率為40％。

實(shí)施例2

1、細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入25％胎牛血清FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后，細(xì)胞呈半貼壁狀(即雖然貼壁但細(xì)胞仍然是圓形的且貼壁不牢容易吹下， 跟昆蟲細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的情況有點(diǎn)像，不像293系列的細(xì)胞懸浮和貼壁是兩種細(xì)胞狀態(tài))

2、選擇一皿處于對(duì)數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染的頭一天按照1傳2傳代，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)85％的時(shí)候可以用于轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染時(shí)先把皿中的培養(yǎng)基棄上清，把殘液吸干凈，再用1.5ml不含雙抗的25％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將皿中的細(xì)胞輕輕吹散。

4、將一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管(細(xì)胞計(jì)數(shù)用)，另一半細(xì)胞加入9.25ml含雙抗的25％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加入牛血清是為了使NB4細(xì)胞從懸浮培養(yǎng)變成半貼壁培養(yǎng)，加入雙抗是為了抗菌以及抗真菌，避免污染。所述雙抗包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素的濃度為80U/ml，鏈霉素的濃度為0.05mg/ml。

5、從EP管中吸取10ul的細(xì)胞稀釋50倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用Hepes緩沖液將細(xì)胞稀釋到2X10⁶個(gè)細(xì)胞/ml.

6、取400ul稀釋并混合均勻的細(xì)胞液于1.5ml EP管中，800rpm,5min。

7、棄上清，用200ul量程的槍頭吸取部分殘液，不要吸動(dòng)細(xì)胞。

8、用Hepes緩沖將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(冰上預(yù)冷)的電轉(zhuǎn)杯中，加入5ug pEGFP-N1質(zhì)粒(申請(qǐng)人單位提供，通用質(zhì)粒)混合均勻。

9、采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀，將電轉(zhuǎn)儀條件設(shè)置為350V，400us，脈沖1次(n＝1)，放入電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊操作。

10、電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加入了2ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基的6孔板中，再放入36℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

11、24h后可以觀察到發(fā)光情況，見圖1a、1b，轉(zhuǎn)化率為45％，圖1a為白光下細(xì)胞圖，圖1b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

實(shí)施例3

1、細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，加入20％胎牛血清FBS的IMDM培養(yǎng)基后，細(xì)胞呈半貼壁狀(即雖然貼壁但細(xì)胞仍然是圓形的且貼壁不牢容易吹下，跟昆蟲細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的情況有點(diǎn)像，不像293系列的細(xì)胞懸浮和貼壁是兩種細(xì)胞狀態(tài))

2、選擇一皿處于對(duì)數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染的頭一天按照1傳2傳代， 第二天細(xì)胞匯合度達(dá)85％的時(shí)候可以用于轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染時(shí)先把皿中的培養(yǎng)基棄上清，把殘液吸干凈，再用1.5ml不含雙抗的20％FBS的IMDM培養(yǎng)基將皿中的細(xì)胞輕輕吹散。

4、將一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，另一半細(xì)胞加入9.25ml含雙抗的20％FBS的IMDM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。所述雙抗包括青霉素和鏈霉素。所述青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃度為0.1mg/ml。

5、從EP管中吸取10ul的細(xì)胞稀釋50倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用Hepes緩沖液將細(xì)胞稀釋到2X10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。

6、取400ul稀釋并混合均勻的細(xì)胞液于1.5ml EP管中，800rpm,5min。

7、棄上清，用200ul量程的槍頭吸取部分殘液，不要吸動(dòng)細(xì)胞。

8、用Hepes緩沖將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(冰上預(yù)冷)的電轉(zhuǎn)杯中，加入5ug pEGFP-N1質(zhì)粒(申請(qǐng)人單位提供，通用質(zhì)粒)混合均勻。

9、采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀,將電轉(zhuǎn)儀條件設(shè)置為350V，400us,脈沖1次(n＝1),放入電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊操作。

10、電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加入了2ml IMDM完全培養(yǎng)基的6孔板中，再放入37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

11、24h后可以觀察到發(fā)光情況，轉(zhuǎn)化率為42％。

實(shí)施例4

1、細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿培養(yǎng)，加入20％胎牛血清FBS的IMDM培養(yǎng)基后，細(xì)胞呈半貼壁狀(即雖然貼壁但細(xì)胞仍然是圓形的且貼壁不牢容易吹下，跟昆蟲細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的情況有點(diǎn)像，不像293系列的細(xì)胞懸浮和貼壁是兩種細(xì)胞狀態(tài))

2、選擇一皿處于對(duì)數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染的頭一天按照1傳2傳代，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)85％的時(shí)候可以用于轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染時(shí)先把皿中的培養(yǎng)基棄上清，把殘液吸干凈，再用1.5ml不含雙抗的20％FBS的IMDM培養(yǎng)基將皿中的細(xì)胞輕輕吹散。

4、將一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，另一半細(xì)胞加入9.25ml含雙抗的20％FBS的IMDM培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。所述雙抗包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素的濃度為80U/ml，鏈霉素的濃度為0.15mg/ml。

5、從EP管中吸取10ul的細(xì)胞稀釋50倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用Hepes 緩沖液將細(xì)胞稀釋到2X10⁶個(gè)細(xì)胞/ml。

6、取400ul稀釋并混合均勻的細(xì)胞液于1.5ml EP管中，800rpm，5min。

7、棄上清，用200ul量程的槍頭吸取部分殘液，不要吸動(dòng)細(xì)胞。

8、用PBS緩沖液將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(冰上預(yù)冷)的電轉(zhuǎn)杯中，加入5ug pEGFP-N1質(zhì)粒(申請(qǐng)人單位提供，通用質(zhì)粒)混合均勻。

9、采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀,將電轉(zhuǎn)儀條件設(shè)置為350V，400us,脈沖1次(n＝1),放入電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊操作。

10、電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加入了2ml IMDM完全培養(yǎng)基的6孔板中，再放入37℃、5％CO₂恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

11、24h后可以觀察到發(fā)光情況，轉(zhuǎn)化率為45％。

實(shí)施例5

1、細(xì)胞于10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，加入20％胎牛血清FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后，細(xì)胞呈半貼壁狀(即雖然貼壁但細(xì)胞仍然是圓形的且貼壁不牢容易吹下，跟昆蟲細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的情況有點(diǎn)像，不像293系列的細(xì)胞懸浮和貼壁是兩種細(xì)胞狀態(tài))

2、選擇一皿處于對(duì)數(shù)生長期的NB4細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染的頭一天按照1傳2傳代，第二天細(xì)胞匯合度達(dá)85％的時(shí)候可以用于轉(zhuǎn)染。

3、轉(zhuǎn)染時(shí)先把皿中的培養(yǎng)基棄上清，把殘液吸干凈，再用1.5ml不含雙抗的20％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基將皿中的細(xì)胞輕輕吹散。

4、將一半的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5ml EP管，另一半細(xì)胞加入9.25ml含雙抗的20％FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。所述雙抗包括青霉素和鏈霉素，所述青霉素的濃度為120U/ml，鏈霉素的濃度為0.15mg/ml。

5、從EP管中吸取10ul的細(xì)胞稀釋50倍后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，計(jì)數(shù)后用Hepes緩沖液將細(xì)胞稀釋到2X10⁶個(gè)細(xì)胞/ml.

6、取400ul稀釋并混合均勻的細(xì)胞液于1.5ml EP管中，800rpm,5min。

7、棄上清，用200ul量程的槍頭吸取部分殘液，不要吸動(dòng)細(xì)胞。

8、用Hepes緩沖將細(xì)胞重懸并轉(zhuǎn)移至預(yù)冷(冰上預(yù)冷)的電轉(zhuǎn)杯中，加入5ug pEGFP-N1質(zhì)粒(申請(qǐng)人單位提供，通用質(zhì)粒)混合均勻。

9、采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀,將電轉(zhuǎn)儀條件設(shè)置為350V，400us, 脈沖1次(n＝1),放入電轉(zhuǎn)杯進(jìn)行電擊操作。

10、電擊完成后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至加入了2ml RPMI 1640完全培養(yǎng)基的6孔板中，再放入37℃、5％CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

11、24h后可以觀察到發(fā)光情況，見圖2a、2b，可見轉(zhuǎn)化率為50％，圖2a為白光下細(xì)胞圖，圖2b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

對(duì)比實(shí)施例

1、將對(duì)數(shù)生長期NB4細(xì)胞2×10⁶個(gè)細(xì)胞/ml與5μg已線性化的質(zhì)粒(pEGFP-N1)DNA混合均勻。

2.采用Eppendorf Multiporator電轉(zhuǎn)儀，在350V，400us，脈沖1次條件下電擊細(xì)胞。

3.電穿孔轉(zhuǎn)染后馬上用RPMI-1640完全培養(yǎng)基調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至5×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml，置37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

4.24h后可以觀察到發(fā)光情況，見圖3a、3b，可見轉(zhuǎn)化率為15％，其中，圖3a為白光下細(xì)胞圖，圖3b為轉(zhuǎn)染后的GFP熒光圖。

上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

(1)本發(fā)明在轉(zhuǎn)染NB4細(xì)胞前，先將其培養(yǎng)成半貼壁細(xì)胞；一般情況下，NB4細(xì)胞本身的生長情況是懸浮狀態(tài)，并且容易聚團(tuán)，因此容易引起細(xì)胞營養(yǎng)不良、狀態(tài)不好，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率低下。而本發(fā)明中將其變成半貼壁細(xì)胞后，細(xì)胞狀態(tài)會(huì)比懸浮狀態(tài)時(shí)好很多，有利于轉(zhuǎn)染。

(2)本發(fā)明在培養(yǎng)基中加入血清有利于半貼壁細(xì)胞的形成，加入雙抗以抗病菌、真菌，避免污染，提高轉(zhuǎn)染的效率。

(3)本發(fā)明采用普通電轉(zhuǎn)儀即可轉(zhuǎn)染懸浮狀態(tài)的NB4細(xì)胞，在合適的電轉(zhuǎn)染條件下獲得了約為50％轉(zhuǎn)染效率。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。

顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。