發(fā)明涉及農(nóng)業(yè)技術(shù)中的肥料，涉及一種新型的復(fù)合生物肥料及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：
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針對土壤微生物的生物制劑，從大發(fā)酵概念上看，地球可看做一個發(fā)酵罐，土壤微生物的生長，土壤有機質(zhì)的合理轉(zhuǎn)化，對植物生長的促進作用不可估量。我們認為利用工業(yè)微生物的代謝酶，促進并激活土壤微生物及植物的內(nèi)源酶活性，促進微生物及植物生長，對土壤改善與提高作物產(chǎn)量具有重大意義。由于化肥的長期使用,會損害土壤合適的菌群結(jié)構(gòu)及土壤的團粒結(jié)構(gòu)，所以保護生態(tài)及地力已成為目前農(nóng)業(yè)問題的重點。因為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大量使用化肥，植物對化肥的依賴度不斷加大，抑制了土壤轉(zhuǎn)化能力，有機肥作用難以充分發(fā)揮，土壤結(jié)構(gòu)不宜改善。

現(xiàn)有的生物肥料大多是單一性的生物肥料。如：固氮菌肥，主要由具有固氮作用的細菌和真菌組成；又如：磷細菌，其功能是分解土壤中的有機磷，使之變?yōu)橐子诒恢参镂盏牧姿兀辉偃纾衡浖毦?，其功能是分解土壤中的鉀化合物，使之成為能被植物吸收利用的速效鉀。這些肥料在單獨使用時均能發(fā)揮各自作用，部分滿足植物對氮，磷，鉀三要素的需要。它們不會產(chǎn)生長期使用化肥所造成的土壤板結(jié)現(xiàn)象。但其不足在于：單獨使用上述三類生物肥料只能解決植物所需營養(yǎng)的一個方面，且成本較高，用量大，同時，將三者配合使用，又因難于做到比例適當而造成施肥量的不足或浪費。長期使用單一的或復(fù)合的生物肥料的實踐證明，它們只能替代化肥的30% 以下。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的發(fā)明目的是提供一種能針對我國土壤肥力的基本情況，開發(fā)一種復(fù)合生物肥料及其生產(chǎn)方法。

本發(fā)明的技術(shù)解決方案是：

一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、植物乳桿菌劑和枯草芽孢桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物30-70 份、解磷巨大芽抱桿菌5-10 份、植物乳桿菌劑20-30 份，枯草芽孢桿菌菌劑10-40 份；一種生產(chǎn)復(fù)合生物肥料的方法，將特選的黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、植物乳桿菌和枯草芽孢桿菌分別進行培養(yǎng)、發(fā)酵，然后將發(fā)酵產(chǎn)物按比例組合為復(fù)合生物肥料。

解磷巨大芽抱桿菌是芽抱桿菌屬（Bacillus）中的一個種。運動，形成莢膜，好氧。

從葡萄糖產(chǎn)酸，也常從阿拉伯糖和甘露醇產(chǎn)酸。水解淀粉，不產(chǎn)生卵磷脂酶，VP 陰性。能分解土壤中的有機磷成為植物可利用的速效磷。

解磷巨大芽孢桿菌劑由滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所提供，地址：中國河北滄州市運

河區(qū)解放西路頤和國際商務(wù)中心A 座1 區(qū)807-812。

有益效果：

實驗表明，使用本品可提高糧食產(chǎn)量8-30%，提高蔬菜產(chǎn)量10-40%，還可改善蔬菜、糧食的品質(zhì)和風味。每畝土地使用本發(fā)明的肥料的量為50 一100 克，是目前國內(nèi)外使用量較少的復(fù)合生物肥料之一。

每畝使用量為100 克。在本發(fā)明復(fù)合生物肥料中加入120 倍的自來水和6 倍的尿素，在22℃以上45℃以下的水溫中活化28 小時，然后連同化肥（按照上年使用量的50%）灑入土壤中。最好作基肥，每年使用1-3 次。

具體實施方式：

下面的實施例可以使本專業(yè)技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。1、菌劑培養(yǎng)制備：

枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備：枯草芽孢桿菌菌劑制備：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的40-50%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.7:1，載體組成為：CaCO320-40 份，糊精10-20 份。流化床干燥，干燥溫度50℃。

植物乳桿菌劑的制備方法：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.5-0.7:1，載體組成為：CaCO320-40 份，糊精10-20 份。流化床干燥，干燥溫度50℃。

黑曲霉培養(yǎng)物制備：菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng)：孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，26-35℃培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床干燥，粉碎干燥物；本發(fā)明提供的產(chǎn)耐高溫α- 淀粉酶的菌株具體為枯草芽孢桿菌Li-2013-02。該菌株已于2013 年7 月15 日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心.

所述菌株特點如下：

所述菌株在固體平板上菌落顏色為乳白色，表面干燥不透明，邊緣整齊，為具有運動性的好氧菌。鏡檢為長桿狀，革蘭氏染色呈陽性。該菌可利用檸檬酸鹽，硝酸還原、V-P 實驗成陽性。

所述枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）Li-2013-02由一株保藏于本實驗室的產(chǎn)耐高溫α- 淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013 經(jīng)紫外線- 氯化鋰- 硫酸二乙酯復(fù)合誘變篩選獲得，具體篩選步驟如下：

（1）菌懸液的制備

將在平板劃線分離后長出的Li-2013 單菌落接入種子培養(yǎng)基中，100r/min，40℃培養(yǎng)12h 后，取1mL 培養(yǎng)液離心后用生理鹽水洗滌兩次，并重懸與9mL 生理鹽水中。

（2）紫外線- 氯化鋰- 硫酸二乙酯復(fù)合誘變將菌懸液置于無菌平板中，在距離為30cm，功率15w 的紫外燈下攪拌照射100s。將經(jīng)過照射的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板，并以未經(jīng)紫外照射的菌液稀釋涂平板做對照。將上述涂布均勻的平板，用黑色的布或報紙包好，置40℃培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上篩選出水解圈與菌落直徑比值最大者挑至斜面保存，純化后配制成菌懸液，經(jīng)梯度稀釋后與硫酸二乙酯原液充分混合，并于40℃震蕩處理40min，將處理過的菌液經(jīng)梯度稀釋后涂布于氯化鋰平板。

（3）高產(chǎn)菌種的初篩

將上述涂布均勻的平板，置40℃培養(yǎng)48h，在長出菌落的平板上初篩出水解圈與菌落直徑比值較大者挑至斜面保存，純化后獲得三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03

（4）搖瓶發(fā)酵復(fù)篩

將獲得的三株菌Li-2013-01，Li-2013-02,Li-2013-03 在含有30mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中進行搖瓶發(fā)酵，種子接種量10％ (V/V)，40℃、100r/min 培養(yǎng)72h，離心取發(fā)酵上清液制得粗酶液。

（5）酶活測定

酶活單位的定義：1mL 粗酶液，于105℃、pH4.2 條件下，1min 液化1mg 可溶性淀粉，即為1 個酶活力單位，以U/mL 表示。

經(jīng)測定，菌株Li-2013-02, 為穩(wěn)定的最高產(chǎn)菌株，且酶活達到30000U/mL，比原始

菌株酶活提高1.6 倍。

所述氯化鋰平板：淀粉1%，蛋白胨1%，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％，氯化鋰0.9%，瓊脂2%。

所述的種子培養(yǎng)基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl1％。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉5％～ 15％，豆餅粉4％～ 10％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％。

所述的搖瓶培養(yǎng)條件：該菌在含有30mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中，接種量10％

(V/V)，100r/min、40℃發(fā)酵培養(yǎng)72h。

由菌株Li-2013-02 發(fā)酵獲得了一種耐高溫的α- 淀粉酶，其酶學性質(zhì)如下：

(1) 該酶溫度適應(yīng)范圍較寬，最適作用溫度在105-115℃之間，且在110℃以下保存的溫度穩(wěn)定性較好，而115℃以上保存長時間溫度穩(wěn)定性較差。

(2) 該酶最適反應(yīng)pH 值為4.2。在pH 值3.0-7.0 之間均有較高酶活力，在pH 值為3.0 時酶活完全穩(wěn)定。

（3）酶活性：由本發(fā)明所提供的突變株Li-2013-02, 制備的耐高溫α- 淀粉酶酶活力為30000-35000U/ml。

1、本發(fā)明使用紫外線- 氯化鋰- 硫酸二乙酯復(fù)合誘變的方法獲得了一株高產(chǎn)耐高溫α- 淀粉酶的枯草芽孢桿菌Li-2013-02，該菌株具有強耐酸、耐熱性，產(chǎn)酶活力高的特點。

2、有該菌株生產(chǎn)所得的耐高溫α- 淀粉酶酶活力高達30000-35000u/ml, ；適用溫度范圍為25-115℃，最適反應(yīng)溫度110℃，在110℃酶活完全穩(wěn)定；適用反應(yīng)pH 值范圍為3.0-7.0，在pH 值為3.0 時酶活完全穩(wěn)定，最適反應(yīng)pH 值為4.2，比現(xiàn)有的耐高溫α- 淀粉酶酶活力高，酶作用最適pH 值范圍寬泛，耐溫度高，特別適合反應(yīng)溫度高、液化工藝與糖化工藝并存的工業(yè)化需求。

實施例1

一種復(fù)合生物肥料，由黑曲霉培養(yǎng)物、解磷巨大芽抱桿菌、植物乳桿菌劑和枯草芽孢桿菌菌劑組成，復(fù)合生物肥料的重量份數(shù)組成為黑曲霉培養(yǎng)物60 份、解磷巨大芽抱桿菌8 份、植物乳桿菌劑25 份，枯草芽孢桿菌菌劑30 份；

本發(fā)明產(chǎn)品的具體生產(chǎn)方法步驟如下：

枯草芽孢桿菌劑培養(yǎng)制備：枯草芽孢桿菌菌劑制備：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢離心分離獲得濕菌體和發(fā)酵液；發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的50%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.6:1，載體組成為：CaCO330 份，糊精15 份。流化床干燥，干燥溫度50℃。

植物乳桿菌劑的制備：從斜面轉(zhuǎn)接培養(yǎng)植物乳桿菌，逐級擴培后的種子液轉(zhuǎn)接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵完畢發(fā)酵液經(jīng)低溫負壓真空濃縮到原體積的45%，得到菌濃縮液。添加載體：向濃縮液中添加混合好的載體，混合均勻；濃縮液與載體的重量比為0.6:1，載體組成為：CaCO330 份，糊精16 份。流化床干燥，干燥溫度50℃。

黑曲霉培養(yǎng)物制備：菌種培養(yǎng)，固體發(fā)酵培養(yǎng)：孢子液接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)料中，

30℃培養(yǎng)至菌絲長滿培養(yǎng)料，低溫流化床45℃干燥，粉碎干燥物；

采用的菌種如下：

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis subsp）CGMCC7926

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）CGMCC1.124

黑曲霉（Aspergillus awamori）CGMCC3.6484

上述四種菌種的保藏單位是中國普通微生物菌種保藏管理中心。

黑曲霉菌劑的制備方法：

技術(shù)方案如下：

斜面菌種活化培養(yǎng)：將黑曲霉斜面菌種轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基上，27℃培養(yǎng)3 天。

固體一級種子培養(yǎng)：挑取黑曲霉斜面菌種接入裝有100 克培養(yǎng)基的500 毫升三角

瓶中進行種子培養(yǎng)，30℃培養(yǎng)3 天即可。

固體二級種子培養(yǎng)：將上述培養(yǎng)好的固體一級種子攪拌為碎塊后加入裝有1000，克培養(yǎng)基的5000 毫升三角瓶中進行種子培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：30℃培養(yǎng)3 天即可。

固體發(fā)酵培養(yǎng)：將二級搖瓶種子粉碎，加入裝有滅菌培養(yǎng)基的發(fā)酵池或托盤中混合均勻后培養(yǎng)，曲料培養(yǎng)溫度控制在26-35℃，濕度80-90%，每隔10 小時翻料一次，培養(yǎng)時間5-7 天；固體曲料的培養(yǎng)采用常用曲料培養(yǎng)技術(shù)；待培養(yǎng)料長滿菌絲即可結(jié)束培養(yǎng)，培養(yǎng)基預(yù)先經(jīng)高溫蒸煮滅菌處理，滅菌條件控制溫度121℃，時間1 小時。

干燥粉碎：發(fā)酵結(jié)束培養(yǎng)料在流化床或其他干燥設(shè)備上進行干燥，干燥溫度控制在60℃，干燥到水分含量在10% 以下，然后將固體培養(yǎng)料進行粉碎，物料粉碎孔徑在60 目以上。

培養(yǎng)基組成：固體原料: 麩皮70%, 粉碎的作物秸稈15%, 豆餅粉5%, 玉米淀粉10%，添加等量自來水；初始pH 自然。

枯草芽孢桿菌的制備方法：

1. 發(fā)酵液的獲得：采用斜面菌種逐級擴培獲得枯草芽孢桿菌發(fā)酵液；

（1）一級種子培養(yǎng)：將枯草芽孢桿菌斜面菌種接入500 毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床180 轉(zhuǎn)/ 分，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24 小時；

（2）二級種子培養(yǎng)：將一級種子按照10% 的接種量接入500 毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；

（3）三級種子培養(yǎng)：將二級種子以10% 接種量接入5000 毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000 毫升，旋轉(zhuǎn)式搖床100 轉(zhuǎn)/ 分，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24 小時；

（4）一級種子罐培養(yǎng)：將三級種子以10% 接種量接入總?cè)莘e為150L 的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100 轉(zhuǎn)/ 分，通風量（V/V）1:0.5, 罐壓0.05Mpa, 培養(yǎng)時間24 小時；

（5）發(fā)酵培養(yǎng)：將一級種子罐菌種以10% 接種量接入總?cè)莘e為1.5 噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量1 噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度28℃，攪拌速度100 轉(zhuǎn)/ 分，通風量（V/V）1:0.5,罐壓0.05Mpa, 培養(yǎng)時間24 小時。

培養(yǎng)基組成：葡萄糖6%, 酵母提取物1%, 蛋白胨0.2%，CaCO31%,pH6.8。

植物乳桿菌劑的制備方法：

（1）一級種子培養(yǎng)：將植物乳桿菌菌種接入500 毫升搖瓶中，培養(yǎng)基裝量100 毫升，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24 小時；

（2）二級種子培養(yǎng)：將一級種子按照10% 的接種量接入500 毫升二級種子搖瓶中，培養(yǎng)條件與一級種子相同；

（3）三級種子培養(yǎng)：將二級種子以10% 接種量接入5000 毫升三級種子搖瓶中，培養(yǎng)基裝量1000 毫升，培養(yǎng)溫度30℃，培養(yǎng)時間24 小時；

（4）一級種子罐培養(yǎng)：將三級種子以5% 接種量接入總?cè)莘e為150L 的一級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量100L，培養(yǎng)溫度30℃，罐壓0.05Mpa, 培養(yǎng)時間18 小時；

（5）發(fā)酵罐培養(yǎng)：將一級種子罐菌種以5% 接種量接入總?cè)莘e為3 噸二級種子罐，發(fā)酵培養(yǎng)基裝量2 噸，培養(yǎng)條件培養(yǎng)溫度30℃，罐壓0.05Mpa, 培養(yǎng)時間22 小時。

培養(yǎng)基組成為：酪蛋白胨1%, 牛肉提取物1%, 酵母提取物0.5%, 葡萄糖0.5%,乙酸鈉0.5%, 檸檬酸二胺0.2%,Tween800.1%,K2HPO40.2%,MgSO4.7H2O0.02%,MnSO4.CaCO32%, 瓊脂1.5%,pH6.8。

試驗地的選擇與試驗設(shè)計：試驗于2012 年4 月27 日—9 月30 日在寧夏鹽池縣花

馬池鎮(zhèn)八堡村進行。

試驗田達到田種植玉米10 畝，分別在種植時使用本發(fā)明產(chǎn)品每畝0.1 公斤，出苗1 個月左右通過鋤地松土方式使用發(fā)明產(chǎn)品0.5 公斤，對照組使用常規(guī)肥料。

發(fā)明產(chǎn)品使用玉米地玉米產(chǎn)量達到650 公斤，對照組達到500 公斤；發(fā)明產(chǎn)品的使

用使玉米畝產(chǎn)量提高了30%。該地塊在第2 年種植春小麥，春小麥產(chǎn)量達到了400 公斤，比對照組單產(chǎn)提高了20%。且試驗田土壤結(jié)構(gòu)良好，無大塊和板結(jié)。