本發(fā)明屬于功能基因改造技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型魚源抗菌肽moronecidin突變體及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：
抗菌肽是生物體內(nèi)存在的一種分子量較小的多肽，具有廣譜抗菌活性，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的殺傷作用，尤其是其對(duì)某些耐藥性的病原菌，其殺傷作用更為顯著。除此之外，某些抗菌肽對(duì)部分病毒、真菌、原生動(dòng)物等也有殺滅作用，甚至具有提高動(dòng)物體的免疫活性、加速傷口愈合過(guò)程等作用。同時(shí)，它還具有穩(wěn)定性好、水溶性好等特點(diǎn)。這些特性使抗菌肽成為醫(yī)藥學(xué)，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科的研究熱點(diǎn)?？咕淖鳛樗锏姆翘禺愋悦庖咭蜃又唬诜烙Ｋ约?xì)菌和病毒入侵方面起著重要作用，近年來(lái)有關(guān)魚、蝦、貝等水產(chǎn)品中抗菌肽的研究日漸增多。盡管抗菌肽的功能顯著，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用前景誘人，但抗菌肽在動(dòng)物體內(nèi)含量極微。從動(dòng)物體內(nèi)提取抗菌肽產(chǎn)量低、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)、工藝復(fù)雜、費(fèi)用昂貴，無(wú)法實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，從而制約了抗菌肽的實(shí)際應(yīng)用。因此，開展對(duì)抗菌肽進(jìn)行基因工程改造的研究具有重要意義。魚源抗菌肽moronecidin是由22個(gè)氨基酸殘基組成的多肽，是從雜交斑紋鱸魚中分離得到的。該多肽C端被酰胺化，高鹽條件下仍保持活力，成熟肽含4個(gè)組氨酸，帶正電荷，能夠廣譜高效的抵抗魚類致病菌，是一種具有開發(fā)潛力的抗菌肽。本發(fā)明通過(guò)堿基替換的方法對(duì)魚源抗菌肽moronecidin進(jìn)行改造，獲得一種新型魚源抗菌肽moronecidin突變體，大大提高了其抑菌活性，極具市場(chǎng)開發(fā)價(jià)值。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供一種新型魚源抗菌肽突變體，即通過(guò)生物軟件對(duì)魚源抗菌肽moronecidin(GenBank登錄號(hào)：AAV65044)的氨基酸序列進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析，分別將魚源抗菌肽moronecidin的22個(gè)氨基酸中的2處氨基酸進(jìn)行突變(K7R和V20K)，獲得一種新型魚源抗菌肽突變體。同時(shí)為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力獲得顯著提高。本發(fā)明首先提供一種新型魚源抗菌肽moronecidin突變體，其氨基酸序列為SEQIDNO:1；編碼上述突變體的一種核苷酸序列為SEQIDNO:2；本發(fā)明還提供一種新型魚源抗菌肽moronecidin突變體的重組畢赤酵母的制備方法，其制備步驟如下：1)根據(jù)新型魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，連入重組酵母表達(dá)載體中，構(gòu)建成表達(dá)重組質(zhì)粒；2)將構(gòu)建的表達(dá)重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化宿主酵母菌，構(gòu)建能表達(dá)魚源抗菌肽突變體的重組基因工程酵母菌；用該重組基因工程菌高密度發(fā)酵表達(dá)出魚源抗菌肽突變體；3)對(duì)重組表達(dá)的魚源抗菌肽突變體進(jìn)一步濃縮、純化后，測(cè)定效價(jià)達(dá)9000U/ml。稀釋分裝，即為抗菌肽制劑。本發(fā)明利用基因工程技術(shù)構(gòu)建了能表達(dá)一種新型魚源抗菌肽突變體的重組酵母菌株。將重組魚源抗菌肽突變體制備成抗菌肽制劑，其抑菌效價(jià)高、抑菌譜廣，具有廣闊的市場(chǎng)前景和開發(fā)價(jià)值。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施方式來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的技術(shù)方案的情況下可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，這些修改和替換均落入本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例1新型魚源抗菌肽突變體及其基因的獲得1、魚源抗菌肽moronecidin(GenBank登錄號(hào)：AAV65044)是由22個(gè)氨基酸殘基組成的抗菌肽，對(duì)細(xì)菌有很強(qiáng)的抑菌活性。為了進(jìn)一步提高其抑菌活性，通過(guò)生物軟件對(duì)魚源抗菌肽moronecidin的氨基酸序列進(jìn)行空間結(jié)構(gòu)分析，分別將魚源抗菌肽moronecidin的22個(gè)氨基酸中的2處氨基酸進(jìn)行突變(K7R和V20K)，同時(shí)為了保證抗菌肽C末端的酰胺化，在C末端添加了天冬酰胺N，使其抗菌效力獲得顯著提高，獲得一種新型魚源抗菌肽突變體，其氨基酸序列為SEQIDNO:1。2、根據(jù)獲得的新型魚源抗菌肽突變體的氨基酸序列SEQIDNO:1，按照畢赤酵母基因密碼子偏好性進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，獲得編碼新型魚源抗菌肽突變體的核苷酸序列SEQIDNO:2。并在其N端引入Kex2酶切位點(diǎn)。兩端引入XhoI和XbaI酶切位點(diǎn)，以便于克隆入畢赤酵母表達(dá)載體中。實(shí)施例2基因工程魚源抗菌肽突變體表達(dá)載體的構(gòu)建與工程菌的獲得1、將含抗菌肽基因的載體和酵母表達(dá)載體均用XhoI和XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收并連接，進(jìn)行PCR鑒定、測(cè)序。2、陽(yáng)性質(zhì)粒經(jīng)SacI單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞懸液中。電轉(zhuǎn)化后均勻涂布于含100μg/mLZeocin的YPDS選擇平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)較大，將各轉(zhuǎn)化子依次點(diǎn)種至含Zeocin200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS選擇平板，以在高濃度Zeocin平板上正常生長(zhǎng)的菌落為可能高拷貝重組菌株。3、將篩選到的陽(yáng)性重組菌單菌落接種于含100μg/mLZeocin的YPD培養(yǎng)液中，28℃振搖培養(yǎng)18個(gè)小時(shí)。取此菌液按4％體積比轉(zhuǎn)接于5mLBMGY培養(yǎng)基中，28℃搖振培養(yǎng)18-24h左右，OD600值約為5-6。培養(yǎng)物直接轉(zhuǎn)接于25mLBMMY培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖振培養(yǎng)。為了維持誘導(dǎo)表達(dá)，每隔24h補(bǔ)加100％甲醇使終濃度達(dá)1％。48h后，4℃5000r/min離心10min，收集上清，進(jìn)行抑菌活性測(cè)定。能產(chǎn)生抑菌活性的重組酵母菌株即為能產(chǎn)生新型魚源抗菌肽突變體的陽(yáng)性菌株，命名為MA株。實(shí)施例3新型魚源抗菌肽突變體的發(fā)酵、純化制備1、發(fā)酵工藝1)將篩選得到的陽(yáng)性重組子活化后按1％-10％接種量接種于三角瓶，28-30℃，200r/min搖床培養(yǎng)16-24h后以5％-20％接種量接入10L發(fā)酵罐(實(shí)裝培養(yǎng)基7L)，溫度28-30℃，轉(zhuǎn)速500-1500r/min，培養(yǎng)基pH值5.0-6.0，通氣量0.1-1.0VVM(1L發(fā)酵液1min通入的氧氣量)，溶氧>20％情況下進(jìn)行發(fā)酵，在培養(yǎng)18-24h后流加50％甘油5h，待溶氧突然升至100％時(shí)流加甲醇至發(fā)酵結(jié)束，整個(gè)發(fā)酵持續(xù)48-72h。2)發(fā)酵結(jié)束后原罐蒸汽100℃滅菌10-20min，放料，5000r/min離心10min，收集發(fā)酵上清即為抗菌肽半成品。3)新型抗菌肽制劑抗菌肽半成品經(jīng)微濾、超濾、噴霧干燥、凍干等生產(chǎn)的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑。上述基因工程抗菌肽可做成水產(chǎn)動(dòng)物飼料添加劑或水產(chǎn)動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療制劑。實(shí)施例4新型魚源抗菌肽突變體的最小抑菌濃度測(cè)定(MIC)1、試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌(CowanI)、鰻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌。2、菌株處理：將菌種復(fù)蘇，在固體培養(yǎng)基中劃線，在28℃培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。將過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌挑單菌落于含有25mL液體培養(yǎng)基的三角瓶中，將三角瓶放于搖床28℃培養(yǎng)12-18h。將培養(yǎng)后的菌液測(cè)OD600值，用培養(yǎng)基調(diào)節(jié)菌液濃度，使其處于0.6-0.8之間。之后將菌液稀釋成濃度為5×105CFU/mL，依次取90μL加入到96孔板的各孔內(nèi)。3、抗菌肽定量后用培養(yǎng)基依次做倍比稀釋。將稀釋好的抗菌肽各取10μL依次加入到96孔板的各個(gè)孔中，此時(shí)每個(gè)孔的反應(yīng)體系為100μL。96孔板蓋蓋后，28℃振蕩培養(yǎng)24h后，觀察并用酶標(biāo)儀測(cè)量OD600值并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。抗菌肽樣品經(jīng)過(guò)二倍稀釋后，成一系列濃度，以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的最小濃度來(lái)定義最小抑菌濃度(MIC)。菌液和培養(yǎng)基分別用來(lái)做陰性和陽(yáng)性對(duì)照，各自代表抑菌率為0和100％。同時(shí)設(shè)立魚源抗菌肽moronecidin標(biāo)準(zhǔn)品試驗(yàn)組作為對(duì)照，用于觀察抗菌肽改造前后的抑菌活性變化。4、用微量稀釋法測(cè)定重組新型魚源抗菌肽moronecidin突變體對(duì)多種細(xì)菌的最低抑菌濃度，結(jié)果表明其對(duì)水產(chǎn)常見病害菌均有顯著的抑制效果，特別是改造的新型魚源抗菌肽突變體與魚源抗菌肽moronecidin標(biāo)準(zhǔn)品相比，對(duì)鰻弧菌、副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌的抑菌能力均得到廣泛提高，顯示了本發(fā)明對(duì)魚源抗菌肽moronecidin的氨基酸突變效果顯著。表1抗菌肽對(duì)多種水產(chǎn)病害菌的最低抑菌濃度