本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種抗人pd-1的單克隆抗體制劑。
背景技術：
：人程序性細胞死亡受體-1(pd-1)是一種有288個氨基酸的i型膜蛋白，是已知的主要免疫檢查點(immunecheckpoint)之一(blanketal,2005,cancerimmunotherapy,54:307-314)。pd-1表達在已經激活的t淋巴細胞，它與配體pd-l1(程序性死亡受體-配體1，programmedcelldeath-ligand1)和pd-l2(程序性死亡受體-配體2，programmedcelldeath-ligand2)結合可以抑制t淋巴細胞的活性及相關的體內細胞免疫反應。pd-l2主要表達在巨噬細胞和樹突狀細胞，而pd-l1則廣泛表達于b、t淋巴細胞及外周細胞如微血管上皮細胞，肺、肝、心等組織細胞中。大量研究表明，pd-1和pd-l1的相互作用不但是維持體內免疫系統(tǒng)平衡所必須，也是導致pd-l1表達陽性腫瘤細胞規(guī)避免疫監(jiān)視的主要機制和原因。通過阻斷癌細胞對pd-1/pd-l1信號通路的負調控，激活免疫系統(tǒng)，能夠促進t細胞相關的腫瘤特異性細胞免疫反應，從而打開了一扇新的腫瘤治療方法的大門--腫瘤免疫療法。pd-1(由基因pdcd1編碼)為與cd28和ctla-4有關的免疫球蛋白超家族成員。研究成果顯示，當pd-1與其配體(pd-l1和/或pd-l2)結合時會負調節(jié)抗原受體信號轉導。目前已弄清鼠pd-1結構以及小鼠pd-1與人pd-l1的共結晶結構(zhang，x.等，immunity20：337-347(2004)；lin等，proc.natl.acad.sci.usa105：3011-6(2008))。pd-1及類似的家族成員為i型跨膜糖蛋白，其含有負責配體結合的ig可變型(v-型)結構域和負責結合信號轉導分子的胞質尾區(qū)。pd-1胞質尾區(qū)含有兩個基于酪氨酸的信號轉導模體itim(免疫受體酪氨酸抑制作用模體)和itsm(免疫受體酪氨酸轉換作用模體)。pd-1在腫瘤的免疫逃避機制中起到了重要的作用。腫瘤免疫療法，即利用人體自身的免疫系統(tǒng)抵御癌癥，是一種突破性的腫瘤治療方法，但是腫瘤微環(huán)境可保護腫瘤細胞免受有效的免疫破壞，因此如何打破腫瘤微環(huán)境成為抗腫瘤研究的重點?，F有研究成果已確定了pd-1在腫瘤微環(huán)境中的作用：pd-l1在許多小 鼠和人腫瘤中表達(并在大多數pd-l1陰性腫瘤細胞系中可由ifnγ誘導)，并被推定為介導腫瘤免疫逃避的重要靶點(iwaiy.等，proc.natl.acad.sci.u.s.a.99：12293-12297(2002)；stromes.e.等，cancerres.，63：6501-6505(2003)。通過免疫組織化學評估活組織檢查，已經在人的很多原發(fā)性腫瘤中發(fā)現pd-1(在腫瘤浸潤淋巴細胞上)和/或pd-l1在腫瘤細胞上的表達。這樣的組織包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌和胰腺癌以及頭頸腫瘤等。由此可見，阻斷pd-1/pd-l1的相互作用可以提高腫瘤特異性t細胞的免疫活性，有助于免疫系統(tǒng)清除腫瘤細胞，因此pd-1成為開發(fā)腫瘤免疫治療藥物的熱門靶點。通常，蛋白質具有非常短的半壽期，并且在暴露于各種因素(如不適宜溫度、水-氣界面、高壓、物理/機械應力、有機溶劑和微生物污染)之后經歷變性(如聚集、解離和吸附在容器表面)。因此，變性蛋白失去內在的理化性質和生理活性。蛋白質的變性通常是不可逆的，因此蛋白質一旦變性，它們的天然性質可能不會恢復到初始狀態(tài)。在生物制藥行業(yè)中，使用重組dna技術制備的蛋白質在水性制劑中的長期儲存通常是一項困難的任務。為了克服水性制劑中的蛋白質的穩(wěn)定性問題，通過凍干(冷凍干燥)制備了更加穩(wěn)定的治療性蛋白產品。凍干產品通常伴隨有用于復原的無菌水性介質。在復原之后，這些制劑典型地具有短的有效貯存壽命，即使在低溫(例如，5℃)下保存時也是如此。由于凍干制劑存在來自復原程序的不便和錯誤的可能性，液體藥物制劑是制備穩(wěn)定、安全、有效的治療用抗體藥物的主要選擇。然而，蛋白質治療液體制劑長期存在的問題是聚集問題，其中蛋白質分子以物理方式粘在一起，導致形成可溶性高分子量聚集體等，在施用后可能在患者中引起不期望的免疫反應。因此，有必要提供一種在冷藏下具有增強的穩(wěn)定性并且在正常室溫下具有至少中等的穩(wěn)定性的抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑以在制造、儲存和給藥期間保護抗體藥物免于降解反應，從而避免來自復原程序的不便和錯誤的可能性。技術實現要素：本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種穩(wěn)定抗人pd-1單克隆抗體的制劑， 其在制造、儲存和給藥期間是穩(wěn)定的，并且適合以高濃度(例如用于皮下施用)施用。因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種穩(wěn)定抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑。本發(fā)明的第二個目的在于提供所述抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑在制備藥物中的應用。為了實現上述目的，本發(fā)明采取了如下技術方案：本發(fā)明的第一個方面在于提供一種抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑，包括抗人pd-1單克隆抗體、雙緩沖劑、糖和氨基酸。其中，所述的緩沖劑選自緩沖劑可選自組氨酸、磷酸、檸檬酸、碳酸、醋酸、巴比妥酸、tris等或其鹽。優(yōu)選的，所述的緩沖劑為磷酸鹽緩沖劑和檸檬酸鹽緩沖劑緩沖劑。其中，所述的糖選自單糖、二糖、多糖、糖衍生物，優(yōu)選蔗糖、海藻糖、甘露醇或其組合。優(yōu)選的，所述的糖為甘露醇。其中，所述的氨基酸選自賴氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、精氨酸或其組合。優(yōu)選的，所述的氨基酸為精氨酸。進一步的，所述的抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑還包括表面活性劑，可選自：非離子表面活性劑(如聚氧乙烯、烷基酚聚氧乙烯醚、多元醇、失水山梨醇酯、蔗糖酯、烷基醇酰胺型等)、陰離子表面活性劑(如硬脂酸、十二烷基苯磺酸鈉等)、陽離子表面活性劑(如胺鹽、季銨鹽、雜環(huán)型等)、兩性離子表面活性劑(如卵磷脂、氨基酸、甜菜堿型等)，優(yōu)選吐溫20。進一步的，所述的抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑包括以下組分：(a)25-150mg/ml的抗人pd-1單克隆抗體，(b)10-50mm的磷酸鹽緩沖劑，(c)10-50mm的檸檬酸鹽緩沖劑，(d)50-300mm的甘露醇，(e)1-50mm精氨酸，(f)0.1-10mg/ml的吐溫20，和其中所述制劑的ph為5.0-6.0。更進一步的，所述的抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑包括以下組分：(a)100mg/ml的抗人pd-1單克隆抗體，(b)10mm的磷酸鹽緩沖劑，(c)10mm的檸檬酸鹽緩沖劑，(d)250mm的甘露糖醇，(e)20mm的精氨酸，(f)8mg/ml的吐溫20，和其中所述制劑的ph為5.5。進一步的，所述的抗人pd-1的單克隆抗體的重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno：2所示，其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如seqidno：4所示。進一步的，所述的抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑適合進行單次皮下注射。本發(fā)明的第二個方面在于所述的抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑的應用，用于制備治療腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥的藥物。本發(fā)明所述的液體制劑較佳地為抗腫瘤、治療自身免疫性疾病、治療感染性疾病和/或抗移植排斥反應的藥物，更佳地為抗腫瘤藥物、治療自身免疫性疾病藥物，優(yōu)選地為抗腫瘤藥物。本發(fā)明所述抗人pd-1的單克隆抗體的液體制劑可以單獨使用或與抗pd-l1單克隆抗體或其它抗腫瘤藥物的制劑聯合使用。其中所述抗腫瘤藥物所針對的腫瘤較佳地包括但不限于：肺癌、肝癌、卵巢癌、宮頸癌、皮膚癌、結腸癌、神經膠質瘤、膀胱癌、乳腺癌、腎癌、食道癌、胃癌、口腔鱗狀細胞癌、尿道上皮細胞癌、胰腺癌和/或頭頸腫瘤中的一種或多種。本發(fā)明所稱的抗腫瘤藥物，指具有抑制和/或治療腫瘤的藥物，可以包括伴隨腫瘤相關癥狀發(fā)展的延遲和/或這些癥狀嚴重程度的降低，進一步還包括已存在的腫瘤伴隨癥狀的減輕并防止其他癥狀的出現，還包括減少或防止腫瘤的轉移等。本發(fā)明中抗人pd-l1單克隆抗體的液體制劑在對包括人在內的動物給藥時，給藥劑量因病人的年齡和體重，疾病特性和嚴重性，以及給藥途徑而異，可以參考動物實驗的結果和種種情況，總給藥量不能超過一定范圍。具體講靜脈注射的劑量是1-1800mg/天。在符合本領域常識的基礎上，上述各優(yōu)選條件，可任意組合，即得本發(fā)明各 較佳實例。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過對緩沖劑、穩(wěn)定劑(例如糖和氨基酸)的優(yōu)化，提供了一種抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑，其在制造、儲存和給藥期間是穩(wěn)定的，在常溫下保持至少一年的穩(wěn)定，具有較低的聚集體及片段化，不需要經過凍干制劑的重新構建步驟，并且適合以高濃度(例如用于皮下施用)施用。本發(fā)明的穩(wěn)定的抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑能夠有效運用于治療腫瘤、感染性疾病、自身免疫性疾病以及抗免疫排斥等藥物的制備中。具體實施方式下面通過實施例的方式進一步說明本發(fā)明，但并不因此將本發(fā)明限制在所述的實施例范圍之中。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規(guī)方法和條件，或按照商品說明書選擇。實施例中所述的室溫為本領域常規(guī)的室溫，一般為10～30℃。根據cn201511027510.9所述方法制備并獲得包含seqidno：1和2限定的重鏈可變區(qū)和seqidno：3和4限定的輕鏈可變區(qū)的抗人pd-1單克隆抗體。以下實施例中，穩(wěn)定性試驗，相關生物學檢驗按照中國藥典的規(guī)范進行。sds-page【聚集(非還原)和片段化(還原)】sds-page被用作一種分析技術，可以根據分子量從天然蛋白質中分離出游離的和高分子量的種類。由于在高濃度的大分子蛋白的情況下具有高的聚集傾向，非還原sds-page被用來評定共價聚集體。由于抗體結構輕重鏈之間，包括鉸鏈區(qū)存在許多二硫鍵，在還原sds-page下檢查蛋白質的片段化。se-hplc(聚集和片段化)用尺寸排阻色譜法分離蛋白質及其有關雜質(基于它們的尺寸)，上述技術對于檢測單克隆抗體的聚集和片段化是有用的。差示掃描量熱法(dsc)dsc是一種用來測定蛋白質的熱力學穩(wěn)定性的技術。單克隆抗體具有三個過渡區(qū)，tm1相對于fab部分，tm2相對于fc部分的ch2結構域，tm3相對于fc部分的ch3結構域(較高的tm決定了較高的穩(wěn)定性)。除特別注明外，以下實施例中本發(fā)明所用試劑和原料均市售可得。任何本領域的普通技術人員將會理解的是，將被包括在組合物中的各種組分的組合可以以任何適當的順序來完成，即，可以首先添加、在中間添加或在最后添加緩沖劑，并且也以可首先添加、在中間添加或在最后添加表面活性劑等。同樣，本領域的普通技術人員將會理解的是，在某些組合中這些化學物質中的一些是不相容的，并且因此，它們可以容易地被具有相似性質但在有關混合物中是相容的不同的化學物質取代。實施例1糖對液體制劑穩(wěn)定性的影響研究50℃下含有不同糖的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑的穩(wěn)定性。所述液體制劑除糖外還含有其它的按照在表1中所給出的賦形劑。表1、含不同糖的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑上述樣品液體制劑在50℃下孵育3天，然后通過sds-page和se-hplc進行分析。結果如表2所示。表2、含不同糖的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑的se-hplc結果由表2的結果可見，與蔗糖和甘露醇相比，海藻糖的添加導致聚集體的增加。更優(yōu)選的是甘露醇。實施例2聚集抑制劑對液體制劑穩(wěn)定性的影響研究具有不同的聚集抑制劑(賴氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和精氨酸)對抗人pd-1單克隆抗體液體制劑的聚集體和片段化的影響。所述液體制劑還含有其他的按照在表3中所給出的賦形劑。表3、含不同聚集抑制劑的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑上述樣品液體制劑在50℃下帶電孵育3天，然后通過sds-page和se-hplc進行分析。結果如表4所示。表4、含不同聚集抑制劑的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑的se-hplc結果由表4的結果可見，在添加甘露醇的液體制劑的基礎上，與進一步添加甘氨酸(f7)和精氨酸(f8)相比，在測試溫度下就聚集而言顯示出更低的降解，而添加賴氨酸(f5)和天冬氨酸(f6)未顯示顯著變化。進一步的，更優(yōu)選的添加的聚集抑制劑是精氨酸。實施例3雙緩沖劑對液體制劑穩(wěn)定性的影響研究具有不同的緩沖劑(組氨酸緩沖劑、磷酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑、磷酸鹽和檸檬酸鹽雙緩沖劑)對抗人pd-1單克隆抗體液體制劑的聚集體和片段化的影響。所述液體制劑還含有其他的按照在表5中所給出的賦形劑。表5、含不同緩沖劑的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑上述樣品液體制劑在50℃下帶電孵育3天，然后通過sds-page和se-hplc進行分析。結果如表6所示。表6、含不同緩沖劑的抗人pd-1單克隆抗體液體制劑由表6的結果可見，與含有組氨酸、磷酸鹽和檸檬酸鹽單緩沖劑的制劑相比，具有作為緩沖劑的磷酸鹽和檸檬酸鹽雙緩沖劑的組合物具有較少的聚集體。因此，磷酸鹽和檸檬酸鹽雙緩沖劑被優(yōu)選地作為適合的緩沖系統(tǒng)。實施例4液體制劑的長期穩(wěn)定性試驗按照表7的配方制備抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑，然后在-20℃、5±3℃和25±2℃下儲存1個月、3個月、6個月及12個月之后，通過se-hplc和sds-page進行分析。結果如表8所示。表7、抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑序號成分濃度1抗人pd-1單克隆抗體100mg/ml2磷酸鹽緩沖劑10mm3檸檬酸鹽緩沖劑10mm4甘露醇250mm5精氨酸20mm6吐溫208mg/ml7ph5.5表8、抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑的se-hplc結果由表8的結果可見，本發(fā)明的抗人pd-1單克隆抗體的液體制劑穩(wěn)定性較好，即使在常溫下仍具有至少一年較好的穩(wěn)定性，能夠滿足儲存、運輸、給藥時的穩(wěn)定性要求。另外，本發(fā)明的研究人員還對商品化的keytruda(pembrolizumab，默沙東)以及opdivo(nivolumab，百時美施貴寶)抗人pd-1單克隆抗體進行上述實驗，實驗結果與上述結果類似，均取得了很好的穩(wěn)定效果。當前第1頁12