本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用副產(chǎn)物二氧化碳自控ph的全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法。

背景技術(shù)：

1,5-戊二胺(1,5-pentanediamine)，又名尸胺(cadaverine)、1,5-二氨基戊烷(1,5-diaminopentane)，與二元酸可聚合成高分子聚酰胺材料(即尼龍)。全球每年生產(chǎn)約700萬(wàn)噸聚酰胺材料，消耗大量石化資源，因此生物法合成聚酰胺的重要組成單體—1,5-戊二胺具有重要的經(jīng)濟(jì)學(xué)和生態(tài)學(xué)意義。

全細(xì)胞催化法以賴氨酸為底物，利用菌體細(xì)胞中的賴氨酸脫羧酶催化產(chǎn)生1,5-戊二胺。目前，賴氨酸作為大宗氨基酸品種之一，其產(chǎn)能?chē)?yán)重過(guò)剩，利潤(rùn)率極低。因此，開(kāi)發(fā)高效的以賴氨酸為底物的1,5-戊二胺生物催化的生產(chǎn)方法，不但可以開(kāi)發(fā)新型生物基材料市場(chǎng)，還可以推進(jìn)氨基酸發(fā)酵產(chǎn)業(yè)的轉(zhuǎn)型升級(jí)。

在全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的現(xiàn)有技術(shù)中，通常在宿主菌中過(guò)表達(dá)源于大腸桿菌的賴氨酸脫羧酶基因cada，構(gòu)建得到能夠催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的菌體細(xì)胞。酶學(xué)活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)cada基因編碼的賴氨酸脫羧酶的最適催化ph為5.5，當(dāng)ph大于5.5時(shí)，賴氨酸脫羧酶的活性隨著ph升高而降低(biochemistry,1974,13:662-670；microbiology,1998,144:751-760；theembojournal,2011,30:931–944)。然而，在賴氨酸全細(xì)胞催化生成1,5-戊二胺的過(guò)程中，催化液ph持續(xù)上升，理論上會(huì)導(dǎo)致賴氨酸脫羧酶活性降低，從而降低催化合成1,5-戊二胺的效率。為了控制全細(xì)胞催化體系的ph維持在較低水平，通常使用高濃度緩沖液，或著在催化過(guò)程中實(shí)時(shí)補(bǔ)加酸性ph調(diào)節(jié)劑。酸性ph調(diào)節(jié)劑通常為無(wú)機(jī)酸(如鹽酸和硫酸)或有機(jī)酸(如丁二酸、己二酸和癸二酸等)，如此在催化液中形成相應(yīng)的戊二胺鹽，如戊二胺鹽酸鹽、戊二胺硫酸鹽、戊二胺丁二酸鹽、戊二胺己二酸鹽等。

在全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的現(xiàn)有技術(shù)中，日本味之素公司率先開(kāi) 發(fā)了使用過(guò)表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的大腸桿菌全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺的方法(美國(guó)專(zhuān)利us7189543、歐洲專(zhuān)利ep1482055)。該方法在50l發(fā)酵罐中，使用己二酸、丁二酸或癸二酸調(diào)節(jié)催化體系的ph維持在6.0或6.5，全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺。類(lèi)似的，日本三井化學(xué)株式會(huì)社使用鹽酸調(diào)節(jié)催化反應(yīng)液的ph維持在6.0(國(guó)際專(zhuān)利pct/jp2011/054388，中國(guó)專(zhuān)利cn102782146)，或使用己二酸調(diào)節(jié)催化反應(yīng)液的ph維持在6.5(國(guó)際專(zhuān)利pct/jp2008/050265，中國(guó)專(zhuān)利cn10158256)，使全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺的反應(yīng)順利進(jìn)行。國(guó)內(nèi)技術(shù)使用6mol/l的hcl在線調(diào)節(jié)戊二胺催化反應(yīng)液的ph維持在5.5，催化32小時(shí)可得到60.54g/l戊二胺(中國(guó)專(zhuān)利cn103725724)。pct/cn2015/082400專(zhuān)利技術(shù)則在催化過(guò)程中流加硫酸或磷酸調(diào)節(jié)戊二胺催化液的ph維持在6.5。

此外，賴氨酸通過(guò)賴氨酸脫羧酶催化生成1,5-戊二胺，并同時(shí)產(chǎn)生二氧化碳。在全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的過(guò)程中，通入空氣有利于二氧化碳排出全細(xì)胞催化體系，降低反應(yīng)液中二氧化碳的濃度，從而減少產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性抑制，有利于催化反應(yīng)向1,5-戊二胺生成的酶促方向進(jìn)行。例如，在調(diào)控1,5-戊二胺催化液ph的現(xiàn)有技術(shù)中，美國(guó)專(zhuān)利us7189543和歐洲專(zhuān)利ep1482055以0.1vvm的速率通入空氣，中國(guó)專(zhuān)利cn10158256則以0.5vvm的速率通入空氣，國(guó)際專(zhuān)利pct/cn2015/082400技術(shù)以1vvm通氣量通入空氣。

雖然ph調(diào)控和曝氣過(guò)程在理論上有利于酶促反應(yīng)向1,5-戊二胺生成的方向進(jìn)行，但是在實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用中，這兩項(xiàng)過(guò)程控制步驟將會(huì)限制1,5-戊二胺全細(xì)胞催化在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用：ph調(diào)控過(guò)程消耗大量的酸，將會(huì)增加輔料成本；鹽酸和硫酸等無(wú)機(jī)酸腐蝕性強(qiáng)，對(duì)設(shè)備材質(zhì)要求高，將會(huì)增加設(shè)備投資；己二酸和癸二酸等有機(jī)酸難溶于水，需要以干粉或配制成漿狀膏狀物的形式補(bǔ)料，將會(huì)增加補(bǔ)料管道的設(shè)計(jì)難度；曝氣過(guò)程導(dǎo)致ph上升速率快，將會(huì)增加ph調(diào)節(jié)劑的用量；曝氣過(guò)程導(dǎo)致部分1,5-戊二胺氧化，將會(huì)降低產(chǎn)物純度；曝氣過(guò)程的氣提作用，使排放的尾氣中含有二氧化碳和戊二胺，將會(huì)導(dǎo)致空氣污染、增加企業(yè)的環(huán)境治理費(fèi)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明提供的全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比，僅利用催化過(guò)程中的副產(chǎn)物co2調(diào)控ph且不需曝氣，突破了常規(guī)的應(yīng)用微生物生產(chǎn)化學(xué)品的過(guò)程中，需要在線調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的ph和曝氣提高菌體活性的過(guò)程控制思路，旨在解決戊二胺全細(xì)胞催化在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)應(yīng)用中的問(wèn)題。

本發(fā)明的一個(gè)方面，提供全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的方法，利用催化副產(chǎn)物co2自調(diào)節(jié)全細(xì)胞催化液的ph且采用非曝氣的方法控制全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺。

以上所述的方法中，所述催化副產(chǎn)物co2全部來(lái)自于賴氨酸在賴氨酸脫羧酶的催化作用下產(chǎn)生1,5-戊二胺的過(guò)程中生成的co2。

以上所述的方法中，所述全細(xì)胞催化液的ph通過(guò)自調(diào)節(jié)維持在5.5-8.5之間；優(yōu)選為7.0-8.0之間。

以上所述的方法中，所述非曝氣的方法是指在全細(xì)胞催化的過(guò)程中不向催化液通入任何氣體。

本發(fā)明的另一個(gè)方面，提供發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器中全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺的方法，利用發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器中的催化副產(chǎn)物co2自調(diào)節(jié)全細(xì)胞催化液的ph且采用非曝氣的方法控制全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺；

所述發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器中全細(xì)胞催化液的溫度控制在30-45℃，發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)定為0-1000rpm。

以上所述的方法中，所述全細(xì)胞催化液是指包含戊二胺工程菌的菌體細(xì)胞、賴氨酸、磷酸吡哆醛和戊二胺的混合物；

以上所述的方法中，所述全細(xì)胞催化液中菌體細(xì)胞干重為0.5-30.0g/l，所述賴氨酸的添加量為0.3-5.0mol/l，所述磷酸吡哆醛的添加量0.01-0.50mmol/l。

以上所述的方法中，所述戊二胺工程菌是指過(guò)表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的細(xì)菌；所述細(xì)菌優(yōu)選為大腸桿菌，更優(yōu)選為大腸桿菌b株或其衍生菌株。

所述過(guò)表達(dá)是指提高賴氨酸脫羧酶在細(xì)胞內(nèi)的量，具體方法可以是增加所述賴氨酸脫羧酶基因的拷貝數(shù)，例如使用多拷貝表達(dá)質(zhì)粒攜帶賴氨酸脫羧酶基因全部或部分核苷酸序列，或是在染色體中插入多拷貝賴氨酸脫羧酶基因全部或部分核苷酸序列；過(guò)表達(dá)的方法也可以是應(yīng)用高效的僅表 達(dá)元件調(diào)控基因的表達(dá)水平，所述元件可以是強(qiáng)啟動(dòng)子，增強(qiáng)子或rbs等；過(guò)表達(dá)的方法也可以是改造基因的編碼序列，如密碼子優(yōu)化，提高賴氨酸脫羧酶的翻譯效率。

所述賴氨酸脫羧酶為將賴氨酸轉(zhuǎn)化為1,5-戊二胺的酶，沒(méi)有特別限制，可舉出例如來(lái)自大腸桿菌(escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)、谷氨酸棒狀桿菌(corynebacteriumglutamicum)、嗜堿芽孢桿菌(bacillushalodurans)、反芻月形單胞菌(selenomonasruminantium)、蜂房哈夫尼菌(hafniaalvei)、霍亂弧菌(vibriocholerae)、天藍(lán)色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、毛鏈霉菌(streptomycespilosus)、嗜氨基酸真桿菌(eubacteriumacidaminophilum)、鼠傷寒沙門(mén)氏菌(salmonellatyphimurium)或深海熱球菌(pyrococcusabyssi)等微生物的酶。優(yōu)選來(lái)自大腸桿菌的酶。

用于全細(xì)胞催化生產(chǎn)1,5-戊二胺的工程菌還可以是在過(guò)表達(dá)賴氨酸脫羧酶基因的基礎(chǔ)上進(jìn)一步適量表達(dá)賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cadb。所述適量表達(dá)賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因cadb是指將包含或不包含rbs序列的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的全部或部分核苷酸序列置于外源表達(dá)質(zhì)粒中的賴氨酸脫羧酶基因的核苷酸序列之后進(jìn)行表達(dá)；或使用適用于大腸桿菌的能解除cadb轉(zhuǎn)錄阻遏的啟動(dòng)子替換大腸桿菌b株或其衍生菌株染色體上的賴氨酸-戊二胺逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因自身的啟動(dòng)子；所述適用于大腸桿菌的能解除cadb轉(zhuǎn)錄阻遏的啟動(dòng)子具體為l啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、t5啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子或t7啟動(dòng)子。

以上所述的方法中，所述賴氨酸脫羧酶用來(lái)催化的底物為含有賴氨酸生產(chǎn)菌的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體的賴氨酸發(fā)酵液、去除菌體并脫色的賴氨酸發(fā)酵液、賴氨酸發(fā)酵液的離子交換洗脫液、游離賴氨酸、賴氨酸鹽干粉或其溶液。

以上所述的方法中，所述戊二胺工程菌通過(guò)如下方法培養(yǎng)：將戊二胺工程菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，得到種子液；將所述種子液接入含有豐富培養(yǎng)基或合成培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中培養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后加入誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)；將培養(yǎng)結(jié)束后的培養(yǎng)液或收集培養(yǎng)液中的菌體細(xì)胞用于戊二胺全細(xì)胞催化。

以上所述的方法中，所述誘導(dǎo)劑具體為iptg或乳糖；

所述豐富培養(yǎng)基中含有10g/l酵母提取物,20g/l胰蛋白胨,0.9g/lk2hpo4·3h2o,1.14g/lkh2po4,10g/l(nh4)2so4,0.3g/lmgso4·7h2o,5ml/l微量元素儲(chǔ)液，50mg/l卡那霉素，余量為水；

所述微量元素儲(chǔ)液含有6g/lfeso4·7h2o,1.35g/lcacl2,0.8g/lznso4·7h2o，1.5g/lmnso4·4h2o,0.15g/lcuso4·5h2o,0.2g/l(nh4)6mo7o24·4h2o,0.1g/lh3bo3,0.25g/lcocl2·6h2o和10ml/l濃鹽酸，余量為水。

所述lb液體培養(yǎng)基中含卡那霉素的濃度為5-200mg/l，具體為50mg/l；

所述種子液的od600為2-25，優(yōu)選為3-5；

所述種子液接入豐富培養(yǎng)基的比例為0.5-30.0％，具體為5.0％；

所述發(fā)酵培養(yǎng)的溫度為25℃-45℃，具體為37℃；

所述發(fā)酵培養(yǎng)的do在50％以上；

所述發(fā)酵培養(yǎng)的ph為4.0-9.0；

所述iptg的終濃度為0.01-10.00mm，優(yōu)選為0.05-0.40mm；

所述iptg加入的時(shí)間為發(fā)酵培養(yǎng)后2-10h，優(yōu)選為2-6h；

所述賴氨酸鹽包括l-賴氨酸鹽酸鹽或賴氨酸硫酸鹽；

所述加入底物賴氨酸和磷酸吡哆醛開(kāi)始全細(xì)胞催化的時(shí)間為誘導(dǎo)開(kāi)始后的0.5-10.0h，優(yōu)選為1.0-5.0h；

當(dāng)所述合成培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基時(shí)：

其中，無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基含有2g/l(nh4)2hpo4,4g/lkh2po4,0.85g/l檸檬酸,0.7g/lmgso4·7h2o，10mg/lfeso4·7h2o,2.25mg/lznso4·7h2o,0.2mg/lcuso4·5h2o,0.5mg/lmnso4·5h2o,0.23mg/lnab4o7·10h2o,2.0mg/lcacl2·2h2o,0.1mg/lnh4mo7o24，0.15mg/lcocl2·6h2o，余量為水。

所述種子液接入無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的比例為0.5-30.0％，具體為2.0％；

所述iptg誘導(dǎo)時(shí)還包括以0.5-10.0g/l的速率補(bǔ)加葡萄糖的步驟，所述速率具體為3.0g/l；

所述發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)葡萄糖的濃度維持在5g/l以下，具體是通過(guò)流加補(bǔ)料液實(shí)現(xiàn)的，所述補(bǔ)料液含有700g/l葡萄糖和20g/lmgso4·7h2o，余量為水；

所述iptg加入的時(shí)間為發(fā)酵培養(yǎng)后3-20h，具體為4-12h；

所述加入底物賴氨酸和磷酸吡哆醛開(kāi)始全細(xì)胞催化的時(shí)間為誘導(dǎo)開(kāi)始后的0.5-24.0h，具體為1.0-5.0h；

本發(fā)明人大膽嘗試了催化液ph自控的方法，即在1,5-戊二胺催化過(guò)程中節(jié)省了生物反應(yīng)過(guò)程中常規(guī)的ph調(diào)控和曝氣工序，意外地發(fā)現(xiàn)，僅依賴賴氨酸脫羧催化產(chǎn)生的酸性氣體co2中和堿性戊二胺，不僅可使催化液的ph維持在菌體生理活性范圍內(nèi)，而且戊二胺的催化生產(chǎn)效率反而高于使用鹽酸或硫酸調(diào)控ph的催化批次。通過(guò)上述兩項(xiàng)相輔相成的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化控制過(guò)程的改進(jìn)，從而實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。

需要指出的是，與初步驗(yàn)證賴氨酸脫羧酶活性或工程菌催化性能所使用的常規(guī)化學(xué)容器(如離心管、試管、三角瓶或藍(lán)蓋瓶等)相比，發(fā)酵罐/生物反應(yīng)器可以實(shí)時(shí)在線調(diào)控多種發(fā)酵參數(shù)(如ph、通氣量和溶氧等)，與生物發(fā)酵行業(yè)中工業(yè)化生產(chǎn)使用的常規(guī)設(shè)備一致。例如，中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)(cn103725724)在5l發(fā)酵罐中使用6mol/l的鹽酸，在線調(diào)節(jié)戊二胺催化反應(yīng)液的ph維持在5.5，催化32小時(shí)可得到60.54g/l戊二胺。國(guó)際專(zhuān)利pct/cn2015/082400技術(shù)使用7.5l發(fā)酵罐，在催化過(guò)程中在線流加硫酸或磷酸調(diào)節(jié)戊二胺催化液的ph維持在6.5，并以1vvm通氣量通入空氣。日本味之素公司在50l發(fā)酵罐中進(jìn)行戊二胺全細(xì)胞催化，使用己二酸、丁二酸或癸二酸調(diào)節(jié)催化體系的ph維持在6.0或6.5，并以0.1vvm的速率通入空氣(美國(guó)專(zhuān)利us7189543、歐洲專(zhuān)利ep1482055)。類(lèi)似的，日本三井化學(xué)株式會(huì)社則在5m³容積的培養(yǎng)罐中，使用鹽酸調(diào)節(jié)催化反應(yīng)液的ph維持在6.0(國(guó)際專(zhuān)利pct/jp2011/054388，中國(guó)專(zhuān)利cn102782146)，或使用己二酸漿液調(diào)節(jié)催化反應(yīng)液的ph維持在6.5，并以0.5vvm的速率通入空氣(國(guó)際專(zhuān)利pct/jp2008/050265，中國(guó)專(zhuān)利cn10158256)。同樣地，本發(fā)明所提供的方法是在發(fā)酵罐和生物反應(yīng)器中進(jìn)行的全細(xì)胞催化方法，與試管/搖瓶等常規(guī)化學(xué)容器開(kāi)展的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化試驗(yàn)相比，具有工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用性。

通氣或曝氣速率的單位vvm是volumepervolumeperminute的縮寫(xiě)，表示每分鐘單位工作體積的通氣量。

賴氨酸在賴氨酸脫羧酶作用下的酶促反應(yīng)方程式如下：

理論上，酸性二氧化碳和堿性戊二胺在水溶液中容易形成戊二胺碳酸鹽。伴隨著溶液中戊二胺碳酸鹽濃度的升高，催化液的ph緩慢升高直至穩(wěn)定。底物賴氨酸鹽酸鹽的添加量為100g/l-500g/l時(shí)，穩(wěn)定時(shí)催化液的ph可以維持在7.3-8.5之間。

在催化液中加入強(qiáng)酸類(lèi)的ph調(diào)節(jié)劑，置換催化過(guò)程中形成的弱酸性碳酸根離子，導(dǎo)致大部分碳酸根離子以二氧化碳的形式逸出催化液。調(diào)節(jié)ph雖然可以在一定程度上提高1,5-戊二胺催化效率，然而需要消耗大量的酸，增加了生產(chǎn)輔料成本，并且不利于后續(xù)1,5-戊二胺的分離提取。

在發(fā)酵工程技術(shù)中，一般認(rèn)為在發(fā)酵罐中通入空氣或氧氣的有氧發(fā)酵與不通氣的厭氧發(fā)酵相比，菌體活性更高。此外，在全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺的過(guò)程中，通入空氣有利于二氧化碳排出全細(xì)胞催化體系，降低反應(yīng)液中二氧化碳的濃度，從而減少產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)性抑制，有利于催化反應(yīng)向戊二胺生成的酶促方向進(jìn)行。然而在本發(fā)明中，為了更好的實(shí)現(xiàn)利用副產(chǎn)物co2調(diào)控ph，在全細(xì)胞催化的過(guò)程中不向催化液通入任何氣體(即非曝氣)，避免部分二氧化碳逸出而無(wú)法中和戊二胺。

需要指出的是，根據(jù)cada基因編碼的賴氨酸脫羧酶的酶學(xué)活性測(cè)定數(shù)據(jù)，酶活性超過(guò)5.5時(shí)，酶活性隨著ph升高急劇降低(biochemistry,1974,13:662-670；microbiology,1998,144:751-760；theembojournal,2011,30:931–944)。進(jìn)一步需要指出的是，根據(jù)酶催化原理，底物co2在發(fā)酵液中的積累往往會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性抑制底物催化效率，不利于賴氨酸脫羧產(chǎn)生1,5-戊二胺的酶促反應(yīng)。然而本發(fā)明人在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，與理論推測(cè)相反的是，在ph逐步升高和二氧化碳逐步積累的催化體系中，仍可高效的完成1,5-戊二胺催化。

應(yīng)用本發(fā)明建立的ph自調(diào)控的催化方法，底物賴氨酸鹽酸鹽的添加量為100g/l～500g/l時(shí)，催化時(shí)間2-8h以后底物賴氨酸的消耗率為可以達(dá)到96.5～99.5％，1,5-戊二胺產(chǎn)量達(dá)到50～280g/l，底物賴氨酸與1,5-戊二胺的摩爾轉(zhuǎn)化率達(dá)到99％以上。與同類(lèi)技術(shù)相比，上述各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到領(lǐng)先水平。

本發(fā)明有益效果在于，應(yīng)用二氧化碳自調(diào)控催化液的ph，節(jié)省了酸性 ph調(diào)節(jié)劑的用量，節(jié)省了輔料成本。強(qiáng)腐蝕性無(wú)機(jī)酸(如鹽酸和硫酸等)對(duì)設(shè)備材質(zhì)要求高，己二酸和癸二酸等有機(jī)酸難溶于水，需要以干粉或配制成漿狀膏狀物的形式補(bǔ)料，本發(fā)明的技術(shù)減少了設(shè)備投資和設(shè)計(jì)難度；催化階段不添加外源的ph調(diào)節(jié)劑，有利于后續(xù)1,5-戊二胺的分離提??；本發(fā)明的技術(shù)節(jié)省了了曝氣過(guò)程，使1,5-戊二胺催化過(guò)程在密閉的發(fā)酵罐中進(jìn)行，節(jié)省了空氣壓縮和輸送所產(chǎn)生的成本，減少了1,5-戊二胺氧化，減少了廢氣排放對(duì)空氣污染，降低了企業(yè)廢氣處理成本；本發(fā)明的技術(shù)僅需要控制全細(xì)胞催化的溫度和攪拌參數(shù)，明顯簡(jiǎn)化了過(guò)程控制工序，提高了生產(chǎn)工藝的可操作性。綜上所述，本發(fā)明的技術(shù)在實(shí)踐上適用于1,5-戊二胺的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，具有很高的實(shí)用性和應(yīng)用性。

附圖說(shuō)明

圖1pet28a-cada質(zhì)粒圖譜。

圖2自控ph、硫酸和鹽酸調(diào)控ph條件下的賴氨酸消耗過(guò)程曲線。

圖3自控ph、硫酸和鹽酸調(diào)控ph條件下的1,5-戊二胺生產(chǎn)過(guò)程曲線。

圖4以100g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

圖5以200g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

圖6以300g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

圖7以400g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

圖8以450g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

圖9以500g/l賴氨酸鹽酸鹽為底物的1,5-戊二胺全細(xì)胞催化過(guò)程曲線。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行更加詳細(xì)的說(shuō)明，以便能夠更好地理解本發(fā)明的方案以及其各個(gè)方面的優(yōu)點(diǎn)。然而，以 下描述的具體實(shí)施方式和實(shí)施例僅是說(shuō)明的目的，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1hplc法檢測(cè)賴氨酸和1,5-戊二胺

取1ml全細(xì)胞催化液，8000g離心5min，收集上清液檢測(cè)賴氨酸含量；取10μl上清液于2ml離心管中，加入200μl0.5mnahco3水溶液和100μl1％(體積比)2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，于60℃水浴中暗處恒溫加熱60min，然后冷卻至室溫，加入700μl0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/lkoh水溶液調(diào)整ph)釋并搖勻，放置15min過(guò)濾后可進(jìn)樣，進(jìn)樣量為15μl；

所用色譜柱為c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm，agilent，usa)；柱溫：40℃；紫外檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm；流動(dòng)相a為0.04mol/lkh2po4水溶液(ph＝7.2±0.05,用40g/100mlkoh水溶液調(diào)整ph)，流動(dòng)相b為55％(體積比)乙腈水溶液，流動(dòng)相總流量為1ml/min，洗脫過(guò)程如下：

洗脫起始時(shí)刻(0min)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為86％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為14％；洗脫過(guò)程分為5個(gè)階段，每個(gè)階段中流動(dòng)相a和流動(dòng)相d占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)均為線性變化；第1階段(從起始時(shí)刻開(kāi)始共進(jìn)行2min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為88％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為12％，第2階段(從第1階段結(jié)束時(shí)刻開(kāi)始共進(jìn)行2min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為86％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為14％，第3階段(從第2階段結(jié)束時(shí)刻開(kāi)始共進(jìn)行6min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為70％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為30％，第4階段(從第3階段結(jié)束時(shí)刻開(kāi)始共進(jìn)行10min)結(jié)束時(shí)流動(dòng)相a占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為30％、流動(dòng)相b占流動(dòng)相總流量的體積份數(shù)為70％。以市售l-賴氨酸標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品的賴氨酸濃度。

檢測(cè)1,5-戊二胺時(shí)，取10μl樣品上清液加入含有100μl4.2g/100ml的碳酸氫鈉水溶液的2ml離心管，混勻后加入200μl含有體積百分含量為1％的2,4-二硝基氟苯的乙腈溶液，混勻；60℃衍生反應(yīng)60分鐘(嚴(yán)格計(jì)時(shí)， 30分鐘取出輕微震蕩混勻繼續(xù)衍生反應(yīng))。取出避光降溫至室溫，加入1600μl乙腈，漩渦震蕩混勻30秒，有機(jī)系濾膜過(guò)濾后取15μl進(jìn)樣。

流動(dòng)相a為ph7.2的5.4g/l磷酸二氫鉀水溶液，流動(dòng)相b為體積百分含量80％的乙腈水溶液，將a和b按照體積比5：95的比例，1ml/min的流速泵入流動(dòng)相，所用色譜柱為c18柱(zorbaxeclipsexdb-c18，4.6*150mm,agilent,usa)；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：360nm。

以1,5-戊二胺鹽酸鹽(購(gòu)自sigma公司)為標(biāo)準(zhǔn)品，1,5-戊二胺鹽酸鹽的濃度在1-5g/l之間線性關(guān)系良好。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品積分峰面積為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

以下實(shí)施例中的1,5-戊二胺濃度均由標(biāo)準(zhǔn)曲線公式計(jì)算得到的1,5-戊二胺鹽酸鹽的測(cè)定值換算成1,5-戊二胺濃度值。

實(shí)施例2全細(xì)胞催化生產(chǎn)戊二胺工程菌的構(gòu)建

(一)賴氨酸脫羧酶基因cada過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

在pet28a(+)表達(dá)載體的t7啟動(dòng)子和rbs之后插入優(yōu)化的賴氨酸脫羧酶基因cada的orf。以優(yōu)化設(shè)計(jì)的序列設(shè)計(jì)引物，以野生型大腸桿菌k12w3110菌株的基因組dna為模板，使用高保真聚合酶kapahifi^tmhotstar，以p1和p2為引物，pcr擴(kuò)增cada基因，該基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。pcr程序?yàn)椋?8℃變性30秒，65℃退火15秒，72℃延伸150秒，26個(gè)循環(huán)，通過(guò)引物p1引入突變位點(diǎn)，從而獲得改造的賴氨酸脫羧酶基因cada*的片段。

p1：5’-catgccatggcagttattgcaatattgaatcatatgggagt-3’(seqidno.5)

(下劃線所示序列為ncoi酶切識(shí)別位點(diǎn))

p2：5’-acgcgtcgacctccttatgagcaaaaaagggaagtg-3’(seqidno.6)

(下劃線所示序列為sali酶切識(shí)別位點(diǎn))

切膠回收上述pcr電泳條帶,使用限制性內(nèi)切酶ncoi和sali雙酶切賴氨酸脫羧酶基因cada*的dna片段和pet28a(+)質(zhì)粒，得到酶切后的賴氨酸脫羧酶基因cada*基因片段和載體大片段；將酶切后的賴氨酸脫羧酶基因cada*基因片段與載體大片段連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ec135(zhangetal, plosgenetics，2012,8(9):e1002987)的感受態(tài)細(xì)胞，在含有50mg/l卡那霉素的lb平板上篩選，獲得含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒并將其送測(cè)序，將結(jié)果正確的質(zhì)粒命名為pet28a-cada*質(zhì)粒示意圖見(jiàn)圖1。

(二)染色體cadb基因啟動(dòng)子的替換

以大腸桿菌bl21(de3)菌株基因組dna為模板，以引物p3和p4、p5和p6分別進(jìn)行pcr擴(kuò)增，獲得長(zhǎng)度分別為510bp和610bp的兩條dna片段,分別如seqidno.2和seqidno.3所示。其中，t7啟動(dòng)子序列和lac調(diào)控序列由引物p4和p5引入。pcr按如下方式進(jìn)行：94℃變性30s，52℃退火30s，以及72℃延伸30s(30個(gè)循環(huán))。其中，引物序列如下：

p3：5’-cgcggatcctgcgccattctcaacatcctt-3’(seqidno.7)

(下劃線所示序列為bamhi酶切識(shí)別位點(diǎn))

p4：5’-tccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattatgccgcaacatattataccaacag-3’(seqidno.8)

p5：5’-actcactataggggaattgtgagcggataacaattccgaaattaggagaagagcatgag-3’(seqidno.9)

p6：5’-attgcggccgctccgcagtattccagttagct-3’(seqidno.10)

(下劃線所示序列為noti酶切識(shí)別位點(diǎn))

將seqidno.2和seqidno.3所示的dna分子的混合物為模板，以p3和p6為引物，通過(guò)overlappcr擴(kuò)增到長(zhǎng)約1.1kb的overlap片段，如seqidno.4所示。其中pcr程序?yàn)椋?4℃變性30秒，52℃退火30秒，72℃延伸60秒，26個(gè)循環(huán)。

seqidno.4中自5’末端起第477位至第495位核苷酸所示的序列為t7啟動(dòng)子序列，seqidno.4中自5’末端起第496位至第520位核苷酸所示的序列為lac調(diào)控序列。

bamhi和noti雙酶切seqidno.3所示的dna分子，得到基因片段；bamhi和noti雙酶切pkov質(zhì)粒(購(gòu)自addgene，產(chǎn)品目錄號(hào)為25769)，得到載體大片段；將基因片段與載體大片段連接，得到重組質(zhì)粒，將其命 名為pkov-pt7-cadb，并將其送測(cè)序，驗(yàn)證其含有正確t7啟動(dòng)子和lac調(diào)控基因序列，保存?zhèn)溆谩?/p>

將構(gòu)建好的pkov-pt7-cadb質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入大腸桿菌bl21(de3)菌株，于30℃、150rpm，在lb培養(yǎng)基中復(fù)蘇2h后，根據(jù)addgene公司的pkov質(zhì)粒的商品指南，挑選出同源重組陽(yáng)性的單克隆，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)其染色體上的cadb基因的自身啟動(dòng)子被替換為t7啟動(dòng)子，將該菌株命名為e.colibl21pcadb::pt7。

(三)戊二胺工程菌的構(gòu)建

將質(zhì)粒pet28a-cada*轉(zhuǎn)化至e.colibl21pcadb::pt7的感受態(tài)細(xì)胞，在含有50mg/l卡那霉素的lb平板上篩選，獲得工程菌e.colibl21pcadb::pt7/pet28a-cada^*，用于1,5-戊二胺全細(xì)胞催化。

實(shí)施例3菌體培養(yǎng)和1,5-戊二胺催化的生產(chǎn)工藝

刮取工程菌e.colibl21(de3)pcadb::pt7/pet28a-cada^*菌苔接入含有50mllb(含50mg/l卡那霉素(5-200mg/l均可)培養(yǎng)基的500ml三角瓶中，在37℃220rpm搖床中培養(yǎng)4h，得到種子液，od600為4-5；培養(yǎng)所得的種子液按2％的接種量接入含有2l無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基的10l發(fā)酵罐中，培養(yǎng)溫度為37℃，do控制在30％以上，罐壓控制在0.02-0.10mpa。通過(guò)流加補(bǔ)料液使培養(yǎng)液中葡萄糖的濃度維持在5g/l以下。當(dāng)培養(yǎng)液中菌體od600達(dá)到30-40時(shí)加入0.1mm誘導(dǎo)劑iptg，2h后菌體培養(yǎng)液od600達(dá)到80左右，離心獲得濕菌體。

其中無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基成分和補(bǔ)料液成分如下：無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基：2g/l(nh4)2hpo4,4g/lkh2po4,0.85g/lcitricacid(檸檬酸),0.7g/lmgso4·7h2o，10mg/lfeso4·7h2o,2.25mg/lznso4·7h2o,0.2mg/lcuso4·5h2o,0.5mg/lmnso4·5h2o,0.23mg/lnab4o7·10h2o,2.0mg/lcacl2·2h2o,0.1mg/lnh4mo7o24，0.15mg/lcocl2·6h2o，余量為水。補(bǔ)料液包含700g/l葡萄糖和20g/lmgso4·7h2o，余量為水。

配制含有300g/l賴氨酸鹽酸鹽和0.2mmol/lplp的催化液體系，調(diào)控溫度至37℃以后，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速設(shè)置為500rpm，加入20g/l濕菌體(折合細(xì)胞干重4g/l)開(kāi)始全細(xì)胞催化，催化過(guò)程中ph持續(xù)上升。ph自控實(shí) 驗(yàn)不補(bǔ)加酸性物質(zhì)調(diào)節(jié)ph，并且不通空氣；而對(duì)照組實(shí)驗(yàn)分別補(bǔ)加濃鹽酸和稀釋一倍的濃硫酸，調(diào)節(jié)催化液的ph維持在6.0左右，并且通風(fēng)量調(diào)節(jié)為為0.5vvm。每隔0.5h從發(fā)酵罐中取出催化液，12000×g離心5分鐘，倒出上清液，檢測(cè)上清液中的1,5-戊二胺含量。按照實(shí)施例1的1,5-戊二胺檢測(cè)方法檢測(cè)全細(xì)胞催化過(guò)程中1,5-戊二胺產(chǎn)量，結(jié)果如圖2所示，ph自控的催化過(guò)程中，賴氨酸消耗速率略高于使用鹽酸調(diào)節(jié)ph的對(duì)照試驗(yàn)，但明顯高于硫酸對(duì)照試驗(yàn)；相應(yīng)地，1,5-戊二胺生產(chǎn)強(qiáng)度變化趨勢(shì)與底物消耗速率相同(圖3)。此外，由于補(bǔ)加硫酸和鹽酸稀釋了1,5-戊二胺催化體系，1,5-戊二胺濃度低于ph自控的催化試驗(yàn)(圖3)。根據(jù)硫酸或鹽酸調(diào)控ph試驗(yàn)計(jì)算，每催化生產(chǎn)1kg戊二胺，需要消耗0.77kg硫酸或0.58kg鹽酸。

實(shí)施例4底物添加量對(duì)催化效率的影響

菌體培養(yǎng)和收集過(guò)程同實(shí)施例3，分別配制含有100g/l、200g/l、300g/l、400g/l、450g/l和500g/l賴氨酸鹽酸鹽的全細(xì)胞催化水溶液，分別加入0.2mmol/lplp和20g/l濕菌體(折合細(xì)胞干重約4g/l)，溫度控制在37℃，攪拌槳轉(zhuǎn)速設(shè)置為500rpm，進(jìn)行催化生產(chǎn)1,5-戊二胺。催化過(guò)程中不補(bǔ)加酸性調(diào)節(jié)劑，利用副產(chǎn)物co2調(diào)節(jié)自調(diào)控催化體系的ph，在催化開(kāi)始的前20分鐘ph迅速上升至7.2左右，而在之后的幾個(gè)小時(shí)ph緩慢升高至7.6-7.8(圖4至圖9)。賴氨酸消耗和1,5-戊二胺生產(chǎn)過(guò)程變化趨勢(shì)與ph類(lèi)似，前0.5小時(shí)賴氨酸迅速消耗且1,5-戊二胺迅速積累，之后變化過(guò)程緩慢。底物賴氨酸鹽酸鹽的添加量不大于300g/l時(shí)，催化4h的底物催化消耗率達(dá)到99.6％以上，賴氨酸鹽酸鹽殘余量小于1g/l；底物賴氨酸鹽酸鹽的添加量為400g/l和450g/l時(shí)，需要催化8h時(shí)底物催化消耗率才能達(dá)到99.0％以上，底物賴氨酸鹽酸鹽的添加量為500g/l時(shí)，催化8h時(shí)底物催化消耗率達(dá)到96.5％，1,5-戊二胺產(chǎn)量達(dá)到277.0g/l。

最后應(yīng)說(shuō)明的是：顯然，上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非對(duì)實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)需也無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。而由此所引申出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之中。