本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)及其功能研究領(lǐng)域，具體涉及一種多功能化學(xué)交聯(lián)劑。

背景技術(shù)：

蛋白質(zhì)作為生命的物質(zhì)基礎(chǔ)和生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，研究蛋白質(zhì)的功能對(duì)理解生命活動(dòng)有重要意義。隨著人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成，過(guò)去十幾年鑒定到的蛋白質(zhì)數(shù)量急劇增加。然而，許多新發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)的生理功能仍然不清楚，與研究蛋白質(zhì)功能密切相關(guān)的是蛋白的三維結(jié)構(gòu)以及蛋白-蛋白相互作用。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析方法x射線(xiàn)晶體學(xué)和核磁共振光譜學(xué)的分辨率可以達(dá)到原子水平。但是這兩種方法都需要大量的蛋白質(zhì)，而且對(duì)x射線(xiàn)晶體學(xué)而言獲取質(zhì)量很高的大分子量蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體的晶體是非常困難的，核磁共振光譜學(xué)則要求蛋白質(zhì)有較好的水溶性，且分子量一般低于30kda。近年來(lái)興起的一個(gè)完全不同的途徑是化學(xué)交聯(lián)－質(zhì)譜鑒定技術(shù)。它在大約二十年前就已開(kāi)辟，但近幾年才發(fā)展成熟。該技術(shù)利用化學(xué)交聯(lián)劑(chemicalcrosslinker)在相互作用的蛋白之間形成依賴(lài)于某些類(lèi)型的氨基酸殘基及它們之間的空間距離的共價(jià)鍵，再通過(guò)質(zhì)譜鑒定交聯(lián)位點(diǎn)；所述整個(gè)流程包括(如圖1所示)：1)蛋白質(zhì)與交聯(lián)劑發(fā)生特異性的交聯(lián)反應(yīng)；2)將蛋白酶切成肽段；3)質(zhì)譜分析鑒定交聯(lián)的肽段。新興的單分子冷凍電鏡－三維重構(gòu)技術(shù)常常不能確定大分子量蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復(fù)合體的局部構(gòu)象，所以也往往與化學(xué)交聯(lián)－質(zhì)譜鑒定技術(shù)結(jié)合。

質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展極大地推動(dòng)了化學(xué)交聯(lián)劑的應(yīng)用，這使得它廣泛應(yīng)用于研究蛋白與蛋白的相互作用。這歸功于質(zhì)譜技術(shù)與化學(xué)交聯(lián)劑的結(jié)合在研究蛋白與蛋白相互作用領(lǐng)域具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，具體包括：1)化學(xué)交聯(lián)劑與相互作用的蛋白質(zhì)之間是通過(guò)不可逆的共價(jià)鍵連接的，理論上可以檢測(cè)到其它方法很難捕獲的瞬時(shí)相互作用；2)由于質(zhì)譜直接分析的是蛋白質(zhì)水解后的多肽，因此蛋白質(zhì)或蛋白復(fù)合物的大小是不受限制的；3)分析速度快，對(duì)樣品純度要求低，而且需要的蛋白在微克級(jí)別，具有很高的靈敏度；4)可供選擇的化學(xué)交聯(lián)劑種類(lèi)很多，根據(jù)兩個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)的差別可分為：氨基—氨基，氨基—巰基，巰基—巰基，巰基—羧基；同時(shí)兩個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)之間的臂長(zhǎng)也可以改變。

盡管已經(jīng)有很多商業(yè)化的化學(xué)交聯(lián)劑，但是由于酶切產(chǎn)物大部分都是普通肽段，而交聯(lián)肽段所占比例很低，因此在如此復(fù)雜的體系中去鑒定交聯(lián)肽段是一項(xiàng)非常困難的任務(wù)。目前大部分交聯(lián)劑僅僅停留在簡(jiǎn)單、純化的蛋白樣品分析，對(duì)復(fù)雜的生物樣品并沒(méi)能顯現(xiàn)出太大的解決能力。通過(guò)使用生物素對(duì)樣品進(jìn)行純化富集可以實(shí)現(xiàn)交聯(lián)肽段與普通肽段的分離，這將大大減低樣品的復(fù)雜程度，因此可富集型交聯(lián)劑是當(dāng)前發(fā)展的重點(diǎn)。同時(shí)，在交聯(lián)劑中引入可切割位點(diǎn)有利于交聯(lián)肽段在富集中從固相系統(tǒng)上釋放，而同位素的引入不僅能幫助交聯(lián)肽段的鑒定，更使得交聯(lián)肽段的定量成為可能。然而，簡(jiǎn)單機(jī)械地將這些官能團(tuán)拼湊在一起有時(shí)并不能實(shí)現(xiàn)它們自身的價(jià)值，不當(dāng)?shù)睦奂臃炊鴰?lái)負(fù)面效果，導(dǎo)致交聯(lián)劑水溶性降低、交聯(lián)效率不高、穩(wěn)定性不好等問(wèn)題。因此，如何將這些官能團(tuán)有機(jī)地融合在一起，使它們發(fā)揮出自身的功能，成為能解決復(fù)雜生物樣品分析的化學(xué)交聯(lián)劑仍是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種能解決復(fù)雜生物樣品分析的多功能化學(xué)交聯(lián)劑。本發(fā)明提供的多功能化學(xué)交聯(lián)劑是由兩條反應(yīng)官能團(tuán)臂和一條包含親和官能團(tuán)和切割位點(diǎn)的臂組成的三臂式結(jié)構(gòu)，其交聯(lián)效率高，水溶性以及穩(wěn)定性均十分優(yōu)異，尤其對(duì)于復(fù)雜生物樣品進(jìn)行分析時(shí)可以充分發(fā)揮其優(yōu)異的交聯(lián)效果。

具體而言，本發(fā)明提供的多功能化學(xué)交聯(lián)劑具有如下通式的結(jié)構(gòu)：

所述r1、r2基團(tuán)可與氨基快速高效反應(yīng)，各自獨(dú)立地代表酚、α,β-不飽和醛、α-羰基醛、酮、酯、聯(lián)烯取代酯、酰胺、聯(lián)烯取代酰胺或活潑酯；所述活潑酯具體為n-羥基丁二酰亞胺或磺酸基取代的n-羥基丁二酰亞胺

本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與其它基團(tuán)相比，磺酸基取代的n-羥基丁二酰亞胺(本發(fā)明簡(jiǎn)稱(chēng)為sulfo-nhs)可以顯著提高交聯(lián)劑的水溶性，同時(shí)確保其具有較高的交聯(lián)效率；因此，本發(fā)明優(yōu)選所述r1、r2基團(tuán)為sulfo-nhs。

所述r3代表可切斷基團(tuán)，在所述交聯(lián)劑上形成可切割位點(diǎn)，從而在溫和的條件下實(shí)現(xiàn)高效地?cái)嗔?。所述r3可選自或光切斷基團(tuán)，如優(yōu)選為本發(fā)明通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該化學(xué)切斷基團(tuán)的反應(yīng)效率是其他切斷基團(tuán)如：光敏基團(tuán)的6倍以上，因此作為優(yōu)選結(jié)構(gòu)；其中，所述代表與r4基團(tuán)的連接位置。

所述r4代表富集官能團(tuán)，可選自炔基、疊氮基、烯基硫醚、生物素或其衍生物。對(duì)于所述富集官能團(tuán)而言(如圖2所示)，可以直接在相應(yīng)位置連接生物素或其衍生物從而獲得一體式交聯(lián)劑，也可以在相應(yīng)位置連接炔基、疊氮基等基團(tuán)從而獲得分體式交聯(lián)劑，所述分體式交聯(lián)劑可通過(guò)特異性結(jié)合將生物素單體連接在交聯(lián)劑上，最后通過(guò)鏈霉親和素磁珠等將交聯(lián)肽段純化提取出來(lái)達(dá)到富集的目的。

所述r5代表氫或其同位素，如氘。當(dāng)使用r5代表氘的交聯(lián)劑或?qū)5代表氘的交聯(lián)劑與r5代表氫的交聯(lián)劑合用時(shí)，可以在質(zhì)譜圖中觀察到有特色的同位素離子模式，有助于對(duì)低豐度交聯(lián)的肽段的檢測(cè)，同時(shí)也為交聯(lián)劑在準(zhǔn)確定量領(lǐng)域成為可能。

作為本發(fā)明的優(yōu)選方案，當(dāng)所述r1、r2基團(tuán)為sulfo-nhs，且r3為時(shí)，可以獲得高效率的賴(lài)氨酸靶向的可富集交聯(lián)劑(lysine-targetedenrichablecross-linker)，本發(fā)明將其命名為leiker。

在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選出分體式交聯(lián)劑leiker1，以及一體式交聯(lián)劑leiker2、leiker3和d6-leiker3，所述d6-leiker3是指leiker3中的6個(gè)氫原子被氘取代。上述各交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)如下所示：

所述leiker(包括leiker1、leiker2、leiker3以及d6-leiker3)的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是：1)含有兩個(gè)與氨基快速高效反應(yīng)的sulfo-nhs活性酯官能團(tuán)；2)包含可用于富集的生物素功能團(tuán)；3)在溫和條件下可以快速高效切斷的偶氮苯切割位點(diǎn)；4)還可以在間隔臂上實(shí)現(xiàn)同位素標(biāo)記。與傳統(tǒng)的只含有兩個(gè)反應(yīng)官能團(tuán)的交聯(lián)劑相比，leiker是可富集、可切割、可同位素標(biāo)記的新穎多功能交聯(lián)劑。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了多功能化學(xué)交聯(lián)劑的合成方法。

本發(fā)明通過(guò)大量篩選和實(shí)驗(yàn)，非常巧妙的選擇了三羧酸化合物作為基本骨架，與可與氨基快速高效反應(yīng)的基團(tuán)生成同型三功能團(tuán)交聯(lián)劑，在此基礎(chǔ)上，把所述同型三功能團(tuán)交聯(lián)劑中的一個(gè)與氨基快速高效反應(yīng)的基團(tuán)替換為含有切割位點(diǎn)并且能實(shí)現(xiàn)富集的官能團(tuán)，從而得到多功能化學(xué)交聯(lián)劑；

以上過(guò)程中，所述三羧酸化合物可選用

所述可與氨基快速高效反應(yīng)的基團(tuán)生成同型三功能團(tuán)交聯(lián)劑可選自酚、α,β-不飽和醛、α-羰基醛、酮、酯、聯(lián)烯取代酯、酰胺、聯(lián)烯取代酰胺或活潑酯，優(yōu)選為

所述含有切割位點(diǎn)并且能實(shí)現(xiàn)富集的官能團(tuán)可選自選自優(yōu)選為其中，所述r4選自炔基、疊氮基、烯基硫醚、生物素或其衍生物。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明以為原料，按照以下路線(xiàn)進(jìn)行合成：

包括以下具體步驟：將三羧酸化合物1、sulfo-nhs和edci溶于dmso，在室溫下攪拌反應(yīng)，得化合物2；所述化合物2與含有切割位點(diǎn)的富集官能團(tuán)在dmso中進(jìn)行反應(yīng)，即得多功能化學(xué)交聯(lián)劑leiker；

所述含有切割位點(diǎn)的富集官能團(tuán)化合物優(yōu)選為：

上述歷程的逆合成分析圖如圖3所示。

作為一種優(yōu)選方案，本發(fā)明以為原料，按照以下路線(xiàn)進(jìn)行合成：

包括以下具體步驟：將三羧酸化合物28、sulfo-nhs和edci溶于dmso，在室溫下攪拌反應(yīng)，得化合物29；所述化合物29與含有切割位點(diǎn)的富集官能團(tuán)在dmso中進(jìn)行反應(yīng)，即得多功能化學(xué)交聯(lián)劑d6-leiker；

所述含有切割位點(diǎn)的富集官能團(tuán)化合物優(yōu)選為：

本發(fā)明所述優(yōu)選多功能化學(xué)交聯(lián)劑leiker1的合成路線(xiàn)如下所示：

所述leiker1的合成具體步驟為：以對(duì)硝基苯酚3為原料，在碳酸鉀無(wú)機(jī)堿的作用下，3-溴丙炔與酚羥基反應(yīng)以定量的收率得到端炔化合物4，隨后將硝基還原為氨基。苯胺在亞硝酸(通過(guò)濃鹽酸和亞硝酸鈉原位生成)的作用下，控制在低溫0～5℃，發(fā)生標(biāo)準(zhǔn)的重氮化反應(yīng)(diazo-reaction)生成重氮化物，之后在堿性條件下再與苯酚化物6發(fā)生親電反應(yīng)可以高效的構(gòu)建偶氮苯結(jié)構(gòu)7。三氟乙酸的作用下脫除boc保護(hù)基團(tuán)得到游離的氨基化合物8，最后化合物8的氨基與同型三功能團(tuán)交聯(lián)劑2反應(yīng)得到9，即leiker1。所述leiker1中不僅含有兩個(gè)與氨基反應(yīng)的sulfo-nhs活性酯，還有可富集的端炔以及可用連二亞硫酸鈉還原切斷的偶氮苯官能團(tuán)。

由于上述過(guò)程需要反復(fù)置換緩沖液將疊氮生物素和tbta除去，會(huì)導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)的損失。為了防止蛋白質(zhì)的大量損失，簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)操作步驟，本發(fā)明還提供了直接將生物素連在交聯(lián)劑上的方案。直接將生物素連在交聯(lián)劑上的確是會(huì)增加它的體積，對(duì)交聯(lián)效率可能會(huì)有些影響，雖然可能存在一些不足，但這樣的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，減少了蛋白質(zhì)的損失，有利于提高該技術(shù)的靈敏度。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了最直接高效的將生物素連在交聯(lián)劑上的方法，即：用端炔化合物7與疊氮生物素10在有機(jī)合成的層面上，通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)構(gòu)建三唑五元雜環(huán)進(jìn)行連接，隨后通過(guò)之前采用的類(lèi)似的方法得到了直接含有富集官能團(tuán)生物素的一體式交聯(lián)劑leiker2。具體而言，所述leiker2的合成路線(xiàn)如下所示：

由于leiker2中生物素是由一個(gè)五元雜環(huán)結(jié)構(gòu)連在交聯(lián)劑上的，而一般認(rèn)為這種結(jié)構(gòu)相對(duì)來(lái)說(shuō)比較“硬”，柔韌度不高，這可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的交聯(lián)。因此本發(fā)明還提供了直接用碳鏈的方式將生物素連接在交聯(lián)劑上的方案，保證它具有更好的柔韌性，獲得一體式交聯(lián)劑leiker3。所述leiker3的合成路線(xiàn)如下所示：

所述leiker3的合成具體步驟為：以硝基苯酚14為原料，在dead和三苯基膦作用下，與羥基化合物15發(fā)生mitsunobu反應(yīng)得到化合物16。硝基在fe作為還原劑的條件下轉(zhuǎn)化為氨基，隨后通過(guò)重氮化反應(yīng)及親電反應(yīng)生成偶氮苯化合物18。tbaf選擇性的脫除fmoc保護(hù)基得到游離氨基而保持boc保護(hù)基不變。19可以很順利的與五氟苯酚生物素活性酯20反應(yīng)得到化合物21，最后通過(guò)脫保護(hù)、與化合物2反應(yīng)得到含鏈?zhǔn)缴锼匾惑w式交聯(lián)劑leiker3。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有6個(gè)氘原子的交聯(lián)劑d6-leiker3的合成方法。

所述d6-leiker3的合成路線(xiàn)如下所示：

所述d6-leiker3的合成具體步驟為：以d3-丙烯腈24為氘源，d3-丙烯腈與硝基甲烷在堿性條件下發(fā)生三次michael加成，得到三氰基化合物25。由于硝基可能會(huì)對(duì)后續(xù)蛋白質(zhì)的交聯(lián)產(chǎn)生干擾，我們打算將硝基脫除，同時(shí)硝基的脫除可以增加三條臂的柔韌性。以aibn作為引發(fā)劑，三正丁基氫化硒提供氫自由基與化合物25反應(yīng)，得到脫硝基三氰基化合物26，在濃鹽酸高溫加熱的條件下，氰基水解為羧基得到三羧酸化合物27。理論上應(yīng)該可以得到含有9個(gè)氘代的27，但是高分辨結(jié)果顯示并不是純的含9個(gè)氘代化合物，有部分氘丟失的情況，這可能是在第一步d3-丙烯腈與硝基甲烷反應(yīng)時(shí)，在堿性條件下氰基α位的碳-氫鍵表現(xiàn)出一定的酸性，因而該位置的氘可能會(huì)被氫置換下來(lái)。用第一步的反應(yīng)產(chǎn)物去做高分辨，與我們分析一致，該化合物就已經(jīng)不是純的9個(gè)氘代了。定量分析必須保證氘代數(shù)目確定，混合物是不適合的，因此我們只能退一步，將化合物27羧基α位的3個(gè)氘原子全部替換為氫。在飽和氫氧化鉀溶液中高溫加熱2天，我們可以得到純的6個(gè)氘代的三羧酸28，之后與sulfo-nhs反應(yīng)得到氘代的sulfo-nhs活性酯29，最后與22反應(yīng)得到6個(gè)氘代的交聯(lián)劑d6-leiker3。

本發(fā)明進(jìn)一步保護(hù)所述多功能化學(xué)交聯(lián)劑在蛋白質(zhì)分析中的應(yīng)用。所述用于分析的蛋白質(zhì)可以為簡(jiǎn)單體系，如bsa等，也可以為復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)樣品。 所述復(fù)雜的混合蛋白質(zhì)樣品包括人工制備的復(fù)雜樣品，如標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物，也包括真實(shí)的復(fù)雜樣品，如酶處理的細(xì)胞器或全細(xì)胞裂解液(大腸桿菌70s核糖體、大腸桿菌全細(xì)胞裂解液以及秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)全細(xì)胞裂解液等)。

本發(fā)明提供的多功能交聯(lián)劑水溶性以及穩(wěn)定性均十分優(yōu)異，且交聯(lián)效率高；將其應(yīng)用于蛋白質(zhì)分析時(shí)，不僅在簡(jiǎn)單體系如bsa、十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物的樣品中展現(xiàn)出較好的交聯(lián)肽段鑒定能力，而且在復(fù)雜生物樣品中，例如大腸桿菌70s核糖體、大腸桿菌全細(xì)胞裂解液以及秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)全細(xì)胞裂解液都可以鑒定到可觀的交聯(lián)位點(diǎn)，展現(xiàn)出很好的應(yīng)用價(jià)值，為今后研究復(fù)雜生物體系蛋白相互作用提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。

附圖說(shuō)明

圖1為化學(xué)交聯(lián)劑在研究蛋白相互作用流程示意圖；

圖2為分體式交聯(lián)劑與一體式交聯(lián)劑結(jié)構(gòu)示意圖；

圖3為多功能交聯(lián)劑的逆合成分析圖；

圖4為偶氮苯切割效率的評(píng)估結(jié)果；

圖5為rna聚合酶ⅱ免疫共沉淀蛋白在點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)中損失結(jié)果示意圖；

圖6為點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)所用試劑疊氮生物素和tbta在質(zhì)譜中的信號(hào)示意圖；

圖7為leiker1與leiker2交聯(lián)效率的比較結(jié)果示意圖；

圖8為leiker2與leiker1鑒定到交聯(lián)肽段數(shù)目的比較結(jié)果示意圖；

圖9為leiker2的富集功能效果示意圖；

圖10為leiker2和leiker3對(duì)用大腸桿菌肽段稀釋的十個(gè)蛋白混合物的交聯(lián)樣品分析能力的比較結(jié)果示意圖；

圖11為leiker2和leiker3對(duì)大腸桿菌70s核糖體樣品分析能力的比較結(jié)果示意圖；

圖12為leiker在真實(shí)復(fù)雜樣品中的應(yīng)用效果示意圖；

圖13為leiker用于定量分析流程示意圖；

圖14為k42交聯(lián)肽段質(zhì)譜圖；

圖15為l7ae-rna復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例1：leiker1的合成

(1)化合物2的合成

取化合物1(23.2mg,0.1mmol)、sulfo-nhs(71.6mg,0.33mmol)和edci(67.1mg,0.35mmol)溶解在無(wú)水dmso(5ml)中，反應(yīng)混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。之后再加入40ml無(wú)水thf，溶液變得渾濁，溶液靜置12小時(shí)后粘稠的固體沉在圓底燒瓶底部而溶劑變得清澈。小心將上清液倒掉，再用5ml無(wú)水thf清洗粘稠的固體二次，最后得到白色粘稠的粗產(chǎn)品2，不需要進(jìn)一步的純化直接用于下一步反應(yīng)；

(2)化合物4的合成

取化合物3(500mg,3.6mmol)溶解在無(wú)水dmf(7.5ml)中，然后加入無(wú)水碳酸鉀(745mg,5.4mmol)，30℃下攪拌30分鐘，之后再慢慢加入3-溴丙炔(462μl,5.4mmol)，反應(yīng)混合液在80℃下攪拌8小時(shí)。加水(15ml)淬滅反應(yīng)，用乙酸乙酯萃取三次(30ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水(10ml)洗滌，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用硅膠柱層析法進(jìn)行純化，得淡黃色固體4(636mg,quant.)；

(3)化合物5的合成

往硝基化合物4(636mg,3.59mmol)的乙醇/水溶液(20ml/6ml)中加入feso4·5h2o(200mg,0.72mmol)和鐵粉(1.77g,31.6mmol)，反應(yīng)混合液在80℃攪拌18小時(shí)。用一小段硅膠過(guò)濾除掉固體雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗脫，濾液在減壓下濃縮。殘?jiān)靡宜嵋阴?60ml)溶解，用水(10ml)清洗，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(40％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得蠟狀固體5(462mg,87％)；

(4)化合物6的合成

將3-氨甲基苯酚(100mg,0.81mmol)溶解在thf(5ml)中，在0℃下加入(boc)2o(213mg,0.98mmol)，反應(yīng)在室溫下攪拌1小時(shí)。反應(yīng)完后加水(5ml)淬滅，用二氯甲烷萃取三次(10ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(5ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(40％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得到白色固體6(181mg,quant.)；

(5)化合物7的合成

在0～5℃溫度下，往苯胺化合物5(131mg,0.89mmol)的水溶液(4ml)中加入濃鹽酸(220μl,2.64mmol)，反應(yīng)液攪拌20min。隨后nano2(86mg,1.24mmol)的水溶液(3ml)，反應(yīng)混合液在0～5℃攪拌1小時(shí)。之后將以上制得的溶液控制溫度在0～5℃慢慢滴加到苯酚化合物6(207mg,0.89mmol)的naoh水溶液(0.6m,4ml)中，反應(yīng)液保持在0～5℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完后用0.25m的稀鹽酸中和，用二氯甲烷萃取三次(20ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(10ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得亮黃色固體7(298mg,88％)；

所得化合物7的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzcdcl3):δ1.45(s,9h),2.57(t,j＝2.4hz,1h),4.77(m,4h),5.22(br,1h),6.84(dd,j＝8.8hz,2.8hz,1h),7.01(s,1h),7.08(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h),7.72(d,j＝8.8hz,1h),7.86(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h)；

¹³cnmr(100mhzcdcl3):δ28.4,41.4,56.0,76.0,78.0,80.2,115.1,115.67,115.72,118.0,124.3,139.6,143.7,147.7,156.4,159.3,159.5；

ir(neat)νmax3283,2974,1680,1598,1584,1500,1229,1162,1024,837,669cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c21h24n3o4的理論值為:382.1761,實(shí)際檢測(cè)值為: 382.1768；

性狀：亮黃色固體，mp＝133-135℃；

(6)化合物8的合成

室溫下，往7(20.2mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)中慢慢加入三氟乙酸(0.5ml)。反應(yīng)液攪拌2.5小時(shí)后，減壓下除去溶劑得到粗產(chǎn)品8，不需純化直接用于下一步反應(yīng)；

(7)leiker1的合成

往粗產(chǎn)品2(用23.2mg的化合物1新鮮制備)的dmso溶液(2ml)中加入粗產(chǎn)品8(用20.2mg的化合物7新鮮制備)dmso溶液(0.5ml)。隨后往反應(yīng)液中加入三乙胺(50μl,0.36mmol)，混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。使用genevacht-4x蒸發(fā)儀將dmso除去，得到的粗產(chǎn)品再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化分離(20-40％ch3cn水溶液，18分鐘以上)；產(chǎn)物中的乙腈在減壓下除去，而水使用凍干機(jī)除去，最終得到黃色固體leiker1(16.3mg,兩步反應(yīng)收率為35％)；

所得leiker1的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.62(m,7h),2.17(m,2h),2.65(m,6h),2.86(m,2h),3.61(s,1h),3.94(s,2h),4.76(d,j＝4.8hz,2h),4.90(s,2h),6.74(d,j＝8.4hz,1h),6.85(s,1h),7.15(d,j＝8.8hz,2h),7.58(d,j＝9.2hz,1h),7.85(d,j＝8.8hz,2.0hz,2h),8.35(br,1h),10.17(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ27.2,27.6,28.1,30.9,32.4,35.4,37.9,55.8,56.3,78.6,78.9,114.5,114.7,115.4,116.6,124.1,141.0,142.1,147.2,159.0,160.5,165.4,168.8,172.2；

ir(neat)νmax3323,2947,1737,1618,1594,1217,1036,845,672cm^-1；

hrms(esi):[m-na]^-c34h33n5nao17s2的理論值為:870.1216,實(shí)際檢測(cè)值為:870.1197；

性狀：黃色固體，mp＝148-150℃。

實(shí)施例2：leiker2的合成

(1)化合物11的合成

取實(shí)施例1所得的化合物7(69.2mg,0.181mmol)溶解在dmf/dcm/h2o(2ml/2ml/2ml)中，隨后依次加入疊氮生物素10(77mg,0.236mmol)、cuso4·5h2o(2.3mg,0.009mmol)和抗壞血酸鈉(5.4mg,0.027mmol)，反應(yīng)混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。反應(yīng)完后加入4ml水，用乙酸乙酯萃取三次(12ml×3)。合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(5ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(6％～10％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黃色固體11(117mg,91％)；

所得化合物11的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzmethanol-d4):δ1.44(m,2h),1.48(s,9h),1.64(m,4h),2.13(m,2h),2.21(t,j＝7.6hz,2h),2.69(d,j＝12.4hz,1h),2.90(dd,j＝12.8hz,5.2hz,1h),3.18(m,1h),3.23(t,j＝6.8hz,2h),4.28(m,1h),4.47(m,3h),4.78(s,2h),5.26(s,2h),6.76(dd,j＝8.8hz,2.8hz,1h),6.91(d,j＝2.8hz,1h),7.14(d,j＝9.2hz,2h),7.66(d,j＝8.8hz,1h),7.87(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h),8.13(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzmethanol-d4):δ26.7,28.9,29.4,29.8,31.1,36.7,41.0,41.2,49.2,57.0,61.6,62.6,63.3,80.3,115.3,115.8,116.2,118.1,125.4,125.6,142.1,144.2,144.6,149.0,158.4,161.6,161.8,166.0,176.2；

ir(neat)νmax3299,2930,1694,1582,1597,1500,1243,1147,838cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c34h46n9o6s的理論值為:708.3286,實(shí)際檢測(cè)值為:708.3277；

性狀：亮黃色固體，mp＝120-122℃。

(2)化合物12的合成

室溫下，往11(37.5mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)中慢慢加入三氟乙酸(0.5ml)。反應(yīng)液攪拌2.5小時(shí)后，減壓下除去溶劑得到粗產(chǎn)品12，不需純化直接用于下一步反應(yīng)；

(3)leiker2的合成

往粗產(chǎn)品2(采用實(shí)施例1所述化合物2的合成方法，用23.2mg的化合物1新鮮制備)的dmso溶液(2ml)中加入粗產(chǎn)品12(用37.5mg的化合物11新鮮制備)dmso溶液(0.5ml)。隨后往反應(yīng)液中加入三乙胺(50μl,0.36mmol)，混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。使用genevacht-4x蒸發(fā)儀將dmso除 去，得到的粗產(chǎn)品再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化分離(20-40％ch3cn水溶液，18分鐘以上)。產(chǎn)物中的乙腈在減壓下除去，而水使用凍干機(jī)除去，最終得到黃色固體leiker2(23.8mg,兩步反應(yīng)的收率為37％)；

所得leiker2的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.30(m,2h),1.57(m,11h),1.96(m,2h),2.21(t,j＝7.6hz,2h),2.17(m,2h),2.57(d,j＝12.4hz,1h),2.65(m,4h),2.74(s,2h),2.81(m,3h),3.00(m,3h),3.95(d,j＝6.4hz,2h),4.12(m,1h),4.30(m,1h),4.38(t,j＝7.2hz,2h),4.76(d,j＝5.6hz,2h),5.24(s,2h),6.35(s,1h),6.42(s,1h),6.74(dd,j＝8.8hz,2.4hz,1h),6.85(d,j＝2.4hz,1h),7.20(d,j＝8.8hz,2h),7.58(d,j＝8.8hz,1h),7.84(d,j＝8.8hz,2h),7.90(t,j＝5.6hz,1h),8.29(s,1h),8.36(t,j＝5.6hz,1h),10.16(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ15.6,25.3,25.5,27.2,27.6,28.0,28.2,30.0,30.9,32.4,34.2,35.2,35.4,35.7,36.1,37.9,42.3,47.3,54.7,55.4,56.2,56.3,59.2,61.0,61.5,114.5,114.7,115.2,116.6,124.2,124.8,140.9,142.1,142.3,146.9,158.5,160.0,160.5,162.7,165.3,168.8,172.18,172.25；

ir(neat)νmax3321,2939,1717,1685,1601,1524,1257,1174,1142,840cm^-1；

hrms(esi):[m-2na]^2-c47h55n11o19s3的理論值為:586.6424,實(shí)際檢測(cè)值為:586.6413；

性狀：亮黃色固體，mp＝158-161℃。

實(shí)施例3：leiker3的合成

(1)化合物15的合成

3-氨基-1-丙醇(300mg,4mmol)溶解在無(wú)水二氯甲烷(15ml)中，將反應(yīng)液置于冰浴，fmoccl(528mg,2mmol)的二氯甲烷溶液(12ml)滴加至反應(yīng)液，持續(xù)30分鐘。將溫度升至室溫，繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)。用0.5m的hcl溶液洗滌三次(5ml×3)，有機(jī)相合再用飽和食鹽水洗滌(5ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(50％的乙酸乙酯石油醚溶液)，得白色固體15(585mg,98％)；

(2)化合物16的合成

對(duì)硝基苯酚(211mg,1.52mmol)溶解在無(wú)水thf(37ml)中，隨后在0℃ 下加入化合物15(519mg,1.75mmol)、pph3(344mg,1.97mmol)和dead(518mg,1.97mmol)，反應(yīng)混合液在0℃下繼續(xù)攪拌1.5小時(shí)。用飽和氯化銨溶液(10ml)淬滅反應(yīng)，再用二氯甲烷萃取三次(15ml×3)。合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(10ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得白色固體16(615mg,97％)；

所得化合物16的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzcdcl3):δ2.04(m,2h),3.41(m,2h),4.09(t,j＝6.0hz,2h),4.21(t,j＝6.4hz,1h),4.44(d,j＝6.8hz,2h),4.94(br,1h),6.93(m,2h),7.31(m,2h),7.40(m,2h),7.58(m,2h),7.77(m,2h),8.19(m,2h)；

¹³cnmr(100mhzcdcl3):δ29.3,38.1,47.2,66.3,66.5,114.4,120.0,124.9,125.9,127.0,127.7,141.3,141.6,143.8,156.4,163.7；

ir(neat)νmax3325,2951,1702,1592,1509,1448,1335,1256,1109,844,741cm^-1；

hrms(esi):[m+na]⁺c24h22n2nao5的理論值為:441.1421,實(shí)際檢測(cè)值為:441.1424；

性狀：白色固體，mp＝128-130℃；

(3)化合物17的合成

往硝基化合物16(598mg,1.43mmol)的乙醇/水溶液(15ml/4.5ml)中加入feso4·5h2o(80mg,0.286mmol)和鐵粉(705mg,12.6mmol)，反應(yīng)混合液在80℃攪拌18小時(shí)。用一小段硅膠過(guò)濾除掉固體雜質(zhì)，并用乙酸乙酯洗脫，濾液在減壓下濃縮。殘?jiān)靡宜嵋阴?50ml)溶解，用水(10ml)清洗，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得蠟狀固體17(471mg,85％)；

所得化合物17的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzcdcl3):δ1.96(m,2h),3.40(m,4h),3.96(t,j＝6.0hz,2h),4.22(t,j＝7.2hz,1h),4.40(d,j＝6.8hz,2h),5.14(br,1h),6.64(m,2h),6.70(m,2h),7.31(m,2h),7.40(m,2h),7.60(m,2h),7.76(m,2h)；

¹³cnmr(100mhzcdcl3):δ29.3,38.8,47.3,66.5,66.6,115.6,116.4,119.9,125.0,127.0,127.6,140.2,141.3,144.0,151.8,156.4；

ir(neat)νmax3348,2950,1704,1510,1449,1233,1044,825,741cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c24h25n2o3的理論值為:389.1860,實(shí)際檢測(cè)值為:389.1866；

性狀：蠟狀固體；

(4)化合物18的合成

在0～5℃溫度下，往苯胺化合物17(345mg,0.89mmol)的水溶液(4ml)中加入濃鹽酸(220μl,2.64mmol)，反應(yīng)液攪拌20min。隨后nano2(86mg,1.24mmol)的水溶液(3ml)，反應(yīng)混合液在0～5℃攪拌1小時(shí)。之后將以上制得的溶液控制溫度在0～5℃慢慢滴加到苯酚化合物6(207mg,0.89mmol)的naoh水溶液(0.6m,4ml)中，反應(yīng)液保持在0～5℃反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)完后用0.25m的稀鹽酸中和，用二氯甲烷萃取三次(20ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(10ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(乙酸乙酯:石油醚＝3:7)，得亮黃色固體18(520mg,94％)；

所得化合物18的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzcdcl3):δ1.44(s,9h),2.05(m,2h),3.44(m,2h),4.10(m,2h),4.22(t,j＝6.8hz,1h),4.44(d,j＝6.8hz,2h),4.76(d,j＝6.4hz,2h),5.03(br,1h),5.17(br,1h),6.83(dd,j＝8.8hz,2.8hz,1h),6.70(m,3h),7.31(m,2h),7.40(m,2h),7.60(m,2h),7.72(d,j＝8.8hz,1h),7.77(d,j＝7.2hz,2h),7.84(d,j＝8.8hz,2h)；

¹³cnmr(100mhzcdcl3):δ28.4,29.3,38.4,41.3,47.2,65.9,66.6,79.9,114.6,115.6,115.7,117.8,119.9,124.4,124.9,127.0,127.7,139.6,141.3,143.8,147.3,156.3,156.6,159.3,160.6；

ir(neat)νmax3298,2928,1686,1597,1501,1467,1240,1144,837,741cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c36h39n4o6的理論值為:623.2864,實(shí)際檢測(cè)值為:623.2855；

性狀：亮黃色固體，mp＝79-81℃；

(5)化合物19的合成

往化合物18(494mg,0.79mmol)的iproh/dmf溶液(1.5ml/15ml)中慢慢滴加tbaf的dmf溶液(0.04m,30ml,1.2mmol)，反應(yīng)液在常溫下攪拌2小時(shí)。反應(yīng)完后用飽和氯化銨溶液(15ml)淬滅，用乙酸乙酯萃取三次(40ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(20ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮。殘余物用快速硅膠色譜柱純化(6％～10％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黃色固體19(317mg,95％)；

所述化合物19的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.41(s,9h),1.93(t,j＝6.4hz,2h),2.85(t,j＝6.4hz,2h),3.33(br,2h),4.14(t,j＝6.4hz,2h),4.65(d,j＝6.0hz,2h),6.73(dd,j＝8.8hz,2.8hz,1h),6.85(d,j＝2.4hz,1h),7.09(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h),7.37(t,j＝6.0hz,1h),7.57(d,j＝8.8hz,1h),7.83(dd,j＝6.8hz,2.0hz,2h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ28.3,29.6,37.2,65.5,77.8,114.0,114.6,114.9,116.4,124.1,141.3,141.8,146.7,155.8,160.4,160.7；

ir(neat)νmax3468,2975,1682,1598,1583,1502,1248,1165,836cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c21h29n4o4的理論值為:401.2183,實(shí)際檢測(cè)值為:401.2187；

性狀：亮黃色固體，mp＝182-184℃；

(6)化合物21的合成

往五氟苯酚生物素酯(46mg,0.11mmol)的無(wú)水dmf溶液(1ml)中滴加化合物19(37mg,0.093mmol)的無(wú)水dmf溶液(1.5ml)，隨后再滴加三乙胺(26μl,0.187mmol)，反應(yīng)液在室溫下攪拌2.5小時(shí)。溶劑減壓下濃縮，殘余物用快速硅膠色譜柱純化(3％～9％甲醇二氯甲烷溶液)，得亮黃色固體21(52mg,90％)；

所述化合物21的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.30(m,2h),1.41(s,9h),1.54(m,4h),1.88(t,j＝6.4hz,2h),2.08(t,j＝7.6hz,2h),2.59(d,j＝12.4hz,1h),2.79(dd,j＝ 12.4hz,4.8hz,1h),3.07(m,1h),3.23(m,2h),4.09(m,3h),4.28(m,1h),4.66(d,j＝5.6hz,2h),6.37(s,1h),6.44(s,1h),6.74(dd,j＝8.8hz,2.4hz,1h),6.86(d,j＝2.0hz,1h),7.07(d,j＝8.8hz,2h),7.34(t,j＝6.0hz,1h),7.58(d,j＝8.8hz,1h),7.83(d,j＝8.8hz,2h),7.90(t,j＝5.6hz,1h),10.13(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ25.3,28.0,28.2,28.3,28.9,35.2,35.3,39.9,55.4,59.2,61.0,65.7,77.8,114.0,114.5,114.9,116.5,124.2,141.3,141.9,146.7,155.8,160.4,160.5,162.7,172.1；

ir(neat)νmax3287,2930,1692,1596,1581,1501,1243,1163,838cm^-1；

hrms(esi):[m+h]⁺c31h43n6o6s的理論值為:627.2959,實(shí)際檢測(cè)值為:627.2951；

性狀：亮黃色固體，mp＝124-126℃；

(7)化合物22的合成

室溫下，往21(33.3mg,0.053mmol)的二氯甲烷溶液(2ml)中慢慢加入三氟乙酸(0.5ml)。反應(yīng)液攪拌2.5小時(shí)后，減壓下除去溶劑得到粗產(chǎn)品22，不需純化直接用于下一步反應(yīng)；

(8)leiker3的合成

往粗產(chǎn)品2(采用實(shí)施例1所述化合物2的合成方法，用23.2mg的化合物1新鮮制備)的dmso溶液(2ml)中加入粗產(chǎn)品22(用33.3mg的化合物21新鮮制備)dmso溶液(0.5ml)。隨后往反應(yīng)液中加入三乙胺(50μl,0.36mmol)，混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。使用genevacht-4x蒸發(fā)儀將dmso除 去，得到的粗產(chǎn)品再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化分離(20-40％ch3cn水溶液，18分鐘以上)。產(chǎn)物中的乙腈在減壓下除去，而水使用凍干機(jī)除去，最終得到黃色固體leiker3(26.5mg,兩步反應(yīng)的收率為44％)；

所得leiker3的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.31(m,2h),1.57(m,11h),1.88(m,2h),2.07(t,j＝7.2hz,2h),2.18(m,2h),2.56(d,j＝12.8hz,1h),2.65(m,4h),2.76(s,2h),2.83(m,3h),3.00(m,1h),3.20(m,2h),3.95(d,j＝7.2hz,2h),4.09(m,3h),4.28(m,1h),4.76(d,j＝5.6hz,2h),6.34(s,1h),6.41(s,1h),6.74(dd,j＝8.8hz,2.4hz,1h),6.85(d,j＝2.4hz,1h),7.08(d,j＝8.8hz,2h),7.58(d,j＝8.8hz,1h),7.83(d,j＝8.8hz,2h),7.89(t,j＝5.6hz,1h),8.36(t,j＝5.6hz,1h),10.14(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ15.6,25.3,25.5,27.2,27.6,28.0,28.2,28.9,30.9,32.4,34.2,35.2,35.3,36.0,37.9,42.3,54.6,55.4,56.3,59.2,61.0,65.7,114.4,114.7,114.9,124.2,140.8,142.1,146.7,158.5,160.4,160.6,162.7,165.3,168.8,172.1,172.2；

ir(neat)νmax3328,2937,1737,1714,1650,1597,1234,1040,631cm^-1；

hrms(esi):[m-2na]^2-c44h52n8o19s3的理論值為:546.1261,實(shí)際檢測(cè)值為:546.1265；

性狀：黃色固體，mp＝152-154℃。

實(shí)施例4：d6-leiker3的合成

(1)化合物28的合成

27(102mg,0.42mmol)溶解在飽和koh溶液(2ml)中，反應(yīng)加熱到105℃攪拌2天。反應(yīng)完后冷卻到室溫，用濃鹽酸對(duì)溶液進(jìn)行酸化，用二氯甲烷萃取三次(100ml×3)，合并有機(jī)相并用飽和食鹽水洗滌(5ml)，最后用無(wú)水na2so4干燥，過(guò)濾，濾液在減壓下濃縮得到白色目標(biāo)產(chǎn)物28(85mg,84％)；

所得化合物28的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.28(s,1h),2.16(s,6h),12.02(s,3h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ30.7,35.0,174.6；

ir(neat)νmax2925,1696,1413,1283,1217,911cm^-1；

hrms(esi):[m+k]⁺c10h10d6ko6的理論值為:277.0955,實(shí)際檢測(cè)值為: 277.0956；

性狀：黃色固體，mp＝107-109℃；

(2)d6-leiker3的合成

往粗產(chǎn)品29(用23.8mg的化合物28新鮮制備)的dmso溶液(2ml)中加入粗產(chǎn)品22(采用實(shí)施例3所述化合物22的合成方法，用33.3mg的化合物21新鮮制備)dmso溶液(0.5ml)。隨后往反應(yīng)液中加入三乙胺(50μl,0.36mmol)，混合液在室溫下攪拌24小時(shí)。使用genevacht-4x蒸發(fā)儀將dmso除去，得到的粗產(chǎn)品再用高效液相色譜儀進(jìn)行純化分離(20-40％ch3cn水溶液，18分鐘以上)。產(chǎn)物中的乙腈在減壓下除去，而水使用凍干機(jī)除去，最終得到黃色固體d6-leiker3(18.8mg,兩步反應(yīng)收率31％)；

所得d6-leiker3的表征數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhzdmso):δ1.30(m,2h),1.50(m,5h),1.88(m,2h),2.07(t,j＝7.2hz,2h),2.16(m,2h),2.56(d,j＝12.4hz,1h),2.63(m,4h),2.69(s,2h),2.81(m,3h),3.05(m,1h),3.21(m,2h),3.95(d,j＝6.8hz,2h),4.09(m,3h),4.28(m,1h),4.76(d,j＝5.6hz,2h),6.34(s,1h),6.41(s,1h),6.74(dd,j＝8.8hz,2.4hz,1h),6.85(d,j＝2.4hz,1h),7.08(d,j＝9.2hz,2h),7.58(d,j＝8.8hz,1h),7.83(d,j＝8.8hz,2h),7.90(t,j＝5.6hz,1h),8.36(t,j＝5.6hz,1h),10.16(s,1h)；

¹³cnmr(100mhzdmso):δ25.3,27.4,28.1,28.2,28.9,30.9,34.9,35.2,35.4,37.9,54.9,55.4,56.2,56.3,59.2,61.1,65.7,114.5,114.7,114.9,116.6,124.2,140.8,142.1,146.7,160.4,160.6,162.7,165.4,168.8,172.1,172.3；

ir(neat)νmax3325,2932,1738,1712,1647,1587,1236,1042,636cm^-1；

hrms(esi):[m-2na]^2-c44h46d6n8o19s3的理論值為:549.1449,實(shí)際檢測(cè) 值為:549.1449；

性狀：黃色固體，mp＝154-156℃。

實(shí)驗(yàn)例1：leiker切割效率的檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)例評(píng)估實(shí)施例1所得leiker1中偶氮苯切割的效率，以bsa作為實(shí)驗(yàn)樣品，結(jié)果如圖4所示，采用連二亞硫酸鈉條件進(jìn)行切割鑒定到的交聯(lián)肽段都要比用傳統(tǒng)的乙腈洗脫鑒定到的交聯(lián)肽段要多。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)未切割前，體系呈現(xiàn)的是黃色狀態(tài)，當(dāng)使用連二亞硫酸鈉完成切割后，黃色會(huì)褪去變?yōu)闊o(wú)色，這在一定程度上有利于對(duì)切割過(guò)程的檢測(cè)。綜上可以看到，偶氮苯是一個(gè)非常好的切割位點(diǎn)，它能在短時(shí)間內(nèi)(30min)快速完成高效切割，并且通過(guò)與傳統(tǒng)的乙腈洗脫方法相比，展示了切割位點(diǎn)的設(shè)計(jì)對(duì)鑒定到更多交聯(lián)肽段是非常具有意義的。

實(shí)驗(yàn)例2：leiker在檢測(cè)人工制備的復(fù)雜生物樣品中的應(yīng)用

本實(shí)驗(yàn)例將leiker1用于復(fù)雜生物樣品rna聚合酶的免疫共沉淀復(fù)合物的研究時(shí)，鑒定到的交聯(lián)肽段很少。通過(guò)比較點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)前、后體系里面普通肽段的數(shù)目來(lái)反應(yīng)蛋白質(zhì)的含量，結(jié)果如圖5所示，可見(jiàn)，點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)后的普通肽段較之前有非常嚴(yán)重的損失。由于置換緩沖液，導(dǎo)致與端炔反應(yīng)的疊氮生物素bio-azide及其反應(yīng)中使用的穩(wěn)定一價(jià)銅離子的化學(xué)試劑tbta在質(zhì)譜中有很強(qiáng)的信號(hào)(如圖6所示)，它們的存在會(huì)大大影響交聯(lián)豐度較低的肽段的鑒定，因此點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)之后我們需要反復(fù)置換緩沖液將疊氮生物素和tbta除去，這過(guò)程就會(huì)導(dǎo)致大量蛋白質(zhì)的損失。

本實(shí)驗(yàn)例應(yīng)用十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物(如表1所示)，通過(guò)比較鑒定到的交聯(lián)肽段的數(shù)目來(lái)正面研究實(shí)施例1提供的分體式交聯(lián)劑leiker1和實(shí)施例2提供的一體式交聯(lián)劑leiker2的實(shí)用價(jià)值。由圖7可知，無(wú)論是leiker1還是leiker2，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)與交聯(lián)劑的質(zhì)量比是2:1時(shí)，單個(gè)蛋白質(zhì)的條帶都基本消失，這說(shuō)明它們兩者之間的交聯(lián)效率差別不大，并且與陽(yáng)性對(duì)照交聯(lián)劑bs3相當(dāng)。

表1：十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白及其大小

本實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步將分體式交聯(lián)劑leiker1和一體式交聯(lián)劑leiker2按照各自的富集方式進(jìn)行富集操作：leiker1需要先與疊氮生物素反應(yīng)，再通過(guò)置換緩沖液除去過(guò)量的交聯(lián)劑、疊氮生物素和tbta。而leiker2只需要用丙酮沉淀除去過(guò)量的交聯(lián)劑。結(jié)果如圖8所示，leiker2鑒定到的交聯(lián)肽段比leiker1要多，特別是inter交聯(lián)的肽段數(shù)目是分體式的兩倍多。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分體式交聯(lián)劑的使用效果并沒(méi)有一體式交聯(lián)劑好，這與分體式交聯(lián)劑涉及到的操作步驟多，導(dǎo)致樣品損失有關(guān)。生物體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量本身就很低，如果再有大量蛋白質(zhì)的損失，對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)的鑒定是非常不利的。

本實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步將leiker2與表1所述十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物交聯(lián)并酶切后，與大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物按照質(zhì)量比1:0、1:1、1:10和1:100進(jìn)行混合，這在一定程度上可以達(dá)到模擬復(fù)雜生物樣品的目的。富集后鑒定交聯(lián)肽段數(shù)目，同時(shí)用商業(yè)化氨基交聯(lián)劑bs3作為陽(yáng)性對(duì)照。結(jié)果如圖9所示，在沒(méi)有混入大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物的樣品(1:0)中，bs3可以鑒定到109對(duì)inter交聯(lián)的肽段，而leiker2可以鑒定到164對(duì)inter交聯(lián)的肽段。隨著大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物的增加，bs3鑒定到的交聯(lián)肽段的數(shù)目急劇下降，這說(shuō)明了它對(duì)復(fù)雜生物樣品表現(xiàn)出很弱的鑒定能力，不適合復(fù)雜生物樣品的分析。而leiker2具有非常強(qiáng)的富集功能，鑒定到的inter交聯(lián)的肽段幾乎不受樣品復(fù)雜程度的影響，即使加入100倍的大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物，依然可以鑒定到167對(duì)inter交聯(lián)的肽段，這與不加大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物的效果相當(dāng)，而相同條件下bs3幾乎沒(méi)有展現(xiàn)出能力，僅能鑒定到1對(duì)inter交聯(lián)的肽段。通過(guò)這個(gè)實(shí)驗(yàn)的直接比較，我們可以看到bs3對(duì)復(fù)雜生物樣品表現(xiàn)出無(wú)能為力的狀態(tài)，而leiker2由于它的超強(qiáng)富集功能，對(duì)復(fù)雜程度很高的樣品仍表現(xiàn)出很強(qiáng)的應(yīng)用性。

本實(shí)驗(yàn)例進(jìn)一步將實(shí)施例2提供的一體式交聯(lián)劑leiker2和實(shí)施例3提供的一體式交聯(lián)劑leiker3進(jìn)行比較，考察它們對(duì)復(fù)雜樣品的分析能力。選取兩個(gè)復(fù)雜生物樣品進(jìn)行交聯(lián)肽段的鑒定：一個(gè)是十個(gè)標(biāo)準(zhǔn)蛋白混合物交聯(lián)后與大腸桿菌裂解液酶切產(chǎn)物按照質(zhì)量比1:10混合得到的樣品；另外一個(gè)是大腸桿菌全細(xì)胞裂解液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10所示，可以看出leiker2和leiker3都有很強(qiáng)的富集效果，鑒定到交聯(lián)肽段(inter+mono+loop)數(shù)目超過(guò)總肽段數(shù)目的95％。 同時(shí)它們二者在這兩個(gè)復(fù)雜的生物樣品中都鑒定到了相近的交聯(lián)肽段數(shù)目，說(shuō)明了它們兩者對(duì)復(fù)雜樣品的分析能力相當(dāng)。

實(shí)驗(yàn)例3：leiker在檢測(cè)真實(shí)的復(fù)雜生物樣品中的應(yīng)用

對(duì)復(fù)雜生物樣品的鑒定能力決定leiker成為強(qiáng)有力工具的硬性指標(biāo)。將leiker2和leiker3應(yīng)用于大腸桿菌70s核糖體的研究，它是一個(gè)2.7mda包含超過(guò)50個(gè)蛋白的核糖核蛋白。運(yùn)用leiker，鑒定到222對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)，這是之前報(bào)道的鑒定數(shù)目的三倍(結(jié)果如圖11所示)。

同時(shí)leiker在更為復(fù)雜的大腸桿菌全細(xì)胞裂解液(e.colilysates)中鑒定到3656對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)。目前這個(gè)樣品中最成功的是2012年meng-qiudong課題組運(yùn)用bs3鑒定到394對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)；2013年，jamesbruce實(shí)驗(yàn)室運(yùn)用他們自己開(kāi)發(fā)的proteininteractionreporter(pir)交聯(lián)劑在活體大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行交聯(lián)，鑒定到708對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)，這兩個(gè)是目前大腸桿菌細(xì)胞裂解液和體內(nèi)鑒定交聯(lián)位點(diǎn)的最高記錄。而運(yùn)用leiker鑒定到的交聯(lián)位點(diǎn)是pir交聯(lián)劑的5倍多，bs3交聯(lián)劑的9倍多。

秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)全細(xì)胞裂解液(c.eleganlysates)比大腸桿菌全細(xì)胞裂解液要復(fù)雜得多，運(yùn)用leiker鑒定到898對(duì)交聯(lián)位點(diǎn)，這是之間報(bào)道最高記錄20倍。

以上結(jié)果如圖12所示。由以上結(jié)果可以看出，由于leiker具有超強(qiáng)的富集功能，并且包含高效切割位點(diǎn)，對(duì)復(fù)雜的生物樣品展現(xiàn)出很高的實(shí)用價(jià)值。

基于交聯(lián)肽段的相對(duì)定量可以反映蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化或者是蛋白質(zhì)與其他分子(如核酸、蛋白質(zhì)等)的結(jié)合。結(jié)合實(shí)施例3所得的leiker3(又稱(chēng)d0-leiker3)以及實(shí)施例4所得的d6-leiker3，我們希望leiker在定量分析中也具有使用價(jià)值。為此，我們使用leiker檢測(cè)了pyrococcusfuriosus核糖核蛋白中l(wèi)7ae和它的伴侶rna(h/acarna)的自主裝。我們用d0-leiker3去處理l7ae蛋白，同時(shí)用d6-leiker3去處理l7ae-rna復(fù)合物作為正向標(biāo)記。另一方面改變同位素標(biāo)記方式，用d6-leiker3去處理l7ae蛋白，再用d0-leiker3去處理l7ae-rna復(fù)合物作為反向向標(biāo)記(如圖13所示)。

將兩份樣品1:1混合，在非l7ae與rna的結(jié)合區(qū)域內(nèi)的賴(lài)氨酸交聯(lián)肽段在質(zhì)譜圖中會(huì)呈現(xiàn)相同的豐度，而結(jié)合區(qū)域內(nèi)的賴(lài)氨酸交聯(lián)肽段在質(zhì)譜圖中會(huì)呈現(xiàn)豐度差異，通過(guò)質(zhì)譜豐度的差異來(lái)揭示l7ae與rna的結(jié)合位點(diǎn)。l7ae本身是有15個(gè)賴(lài)氨酸反應(yīng)位點(diǎn)和一個(gè)氮端的氨基，我們?cè)谡驑?biāo)記和反向標(biāo)記中都鑒定到了這16個(gè)交聯(lián)位點(diǎn)，并且發(fā)現(xiàn)有三個(gè)位置的賴(lài)氨酸k35,k42和k84在l7ae樣品中的豐度要強(qiáng)于l7ae-rna復(fù)合物，圖14為k42交聯(lián)肽段質(zhì)譜圖。這說(shuō)明這三個(gè)賴(lài)氨酸是處于l7ae-rna的結(jié)合位點(diǎn)處。這與l7ae-rna復(fù) 合物晶體結(jié)構(gòu)是完美匹配的，晶體結(jié)構(gòu)顯示k35,k42和k84都位于l7ae與rna結(jié)合區(qū)域內(nèi)(如圖15所示)。這些結(jié)果證明了結(jié)合d0-leiker3和d6-leiker3，可以用來(lái)定量分析。

綜上可知，最終我們開(kāi)發(fā)了分體式交聯(lián)劑leiker1和一體式交聯(lián)劑leiker2、leiker3以及d6-leiker3。leiker在復(fù)雜生物樣品中，例如大腸桿菌70s核糖體、大腸桿菌全細(xì)胞裂解液以及秀麗隱桿線(xiàn)蟲(chóng)全細(xì)胞裂解液都可以鑒定到可觀的交聯(lián)位點(diǎn)，展現(xiàn)出很好的應(yīng)用價(jià)值，為今后研究復(fù)雜生物體系蛋白相互作用提供一個(gè)強(qiáng)有力的工具。同時(shí)，我們很容易的將同位素引入到leiker3中，得到了d6-leiker3，使leiker用于定量分析成為可能。

雖然，上文中已經(jīng)用一般性說(shuō)明、具體實(shí)施方式及試驗(yàn)，對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。