本發(fā)明涉及藥物化學(xué)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及新型的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮衍生物，其合成方法及其作為egfr抑制劑在制備腫瘤相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

癌癥亦稱噁性腫瘤，是以細(xì)胞異常增殖及轉(zhuǎn)移為特點的一大類疾病，具有發(fā)病率高和死亡率高的特點，是威脅人類健康，導(dǎo)致死亡的噁性疾病之一。研究數(shù)據(jù)表明，2008年全球有1270萬癌癥患者，其中死亡人數(shù)高達(dá)700余萬。而全世界20％的新發(fā)腫瘤病人在中國，24％的腫瘤死亡病人在中國。如果不采取有效措施預(yù)防，或拿出更優(yōu)的治療方案，預(yù)計到2030年，世界范圍內(nèi)每年將出現(xiàn)2600萬新增癌癥病例，癌癥死亡人數(shù)將達(dá)到1700萬。在現(xiàn)有的癌癥中，肺癌是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和死亡率最高的噁性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(nsclc)占肺癌患者的80％以上。據(jù)世界衛(wèi)生組織(who)預(yù)測，到2025年，我國每年新增肺癌病例將超過100萬。一旦被確診為肺癌，患者便只有渺茫的生存前景，5年生存率不到15％。

從20世紀(jì)80年代開始，隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的深入，腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制日益清晰。在諸多誘發(fā)癌癥的因素中，癌細(xì)胞中由基因突變引起的高表達(dá)的某些蛋白激酶是導(dǎo)致其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常的主要因素之一。蛋白質(zhì)酪氨酸激酶是信號傳遞過程中的重要因子，參與一系列細(xì)胞活動，與細(xì)胞生長、分化、增殖密切相關(guān)。它催化atp的γ磷酸基轉(zhuǎn)移到許多重要蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上，使酚羥基磷酸化，從而傳遞信號。因此，發(fā)展選擇性的蛋白激酶抑制劑來阻斷或者調(diào)控由于這些信號通路異常產(chǎn)生的疾病已經(jīng)被視為抗腫瘤藥物開發(fā)的一個有效的研究策略。在眾多的酪氨酸激酶中，表皮生長因子受體酪氨酸激酶(epidermalgrowthfactorreceptortyrosinekinase,egfr)是不可或缺的重要組成部分。egfr由1186個氨基酸組成，編碼一個分子量為170-kda的跨膜糖蛋白。egfr能夠介導(dǎo)多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，將胞外信號傳遞到胞內(nèi)，對正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的增殖、分化和凋亡均發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用(cell,2000,100,113-127)。egfr是許多正常上皮組織(如皮膚和毛囊)的組成性表達(dá)成分，而在大部分實體瘤中，egfr存在過表達(dá)或者高表達(dá)。例如，在肺癌中，egfr的表達(dá)率達(dá)到40～80％。因此選擇性地抑制egfr，干擾其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，可以達(dá)到治療肺癌的目的，為靶向治療肺癌開辟了一條可行之路。

臨床治療上，結(jié)合傳統(tǒng)的放療、化療，以egfr靶向藥物如吉非替尼(iressa)、厄洛替尼(tarceva)等進(jìn)行一線藥物在肺癌治療中被證明是非常有效的。然而，臨床實踐表明：大部分非小細(xì)胞肺癌患者在使用吉非替尼或厄洛替尼治療之后，會在6-12月內(nèi)出現(xiàn)獲得性耐藥。其中大約60％病例的耐藥性與egfr激酶結(jié)構(gòu)域中一個氨基酸殘基的突變(790位蘇氨酸殘基突變?yōu)榧琢虬彼?，t790m)有關(guān)(thenewenglandjournalofmedicine,2005,352,786-792)。t790m突變導(dǎo)致抑制劑與egfr結(jié)合時產(chǎn)生空間位阻或者增加egfr與atp的親和力，使得這類可逆性結(jié)合的競爭性抑制劑的抗癌效果大大減弱。耐藥性的產(chǎn)生不但降低了病人對藥物的敏感性，也大大降低了腫瘤患者的生存質(zhì)量。為了克服t790m突變引起的耐藥性，一系列不可逆atp競爭性抑制劑(如ci-1033、hki-272、pf00299804等)已進(jìn)入臨床研究階段。不可逆抑制劑含有一個邁克爾受體片段，能與egfr的atp結(jié)合位點的一個保守氨基酸殘基(cys797)形成共價鍵，從而獲得了比可逆性抑制劑更強(qiáng)的egfr結(jié)合親和力。盡管如此，由于此類藥物對野生型和突變型egfr選擇性較差，因此其最大耐受量(mtd)較低，臨床實驗效果并不明顯。

因此，研究開發(fā)選擇性抑制t790m突變，克服臨床耐藥的第三代egfr靶向藥物具有重大的臨床意義和應(yīng)用前景。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種結(jié)構(gòu)全新的、能夠選擇性抑制t790m突變并克服臨床耐藥性的第三代egfr抑制劑。

在第一方面，本發(fā)明提供通式i所示的化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽：

式中，a為苯環(huán)、五元或六元雜環(huán)、c3-c8環(huán)烷基；

r¹各自獨(dú)立選自氫、鹵素、c1-c3烷氧基、c1-c3烷基、c1-c4烷基酰胺基、取代哌嗪基、取代高哌嗪基、取代嗎啉基、取代硫代嗎啉基、4-n-甲基哌嗪基、4-n-乙?；哙夯?、4-n,n-二甲基哌啶基、取代哌啶基、n,n,n'-三甲基乙二胺基、n,n-二甲基乙醇胺基、1-甲基-4-(哌啶)哌嗪基、-nrarb，其中，ra和rb可選自烷基和含氮烷基；

r²各自獨(dú)立選自以下基團(tuán)：

r³、r⁴各自獨(dú)立選自下組：氫、c1-c10烷基，取代的c1-c10烷基、任選取代的c3-c8環(huán)烷基、任選取代的芐基、任選取代的雜環(huán)基；

b選自下組：

m為0-7的整數(shù)。

在具體的實施方式中，所述化合物如通式ii所示：

式中，b、r¹、r²、r³、r⁴如權(quán)利要求1所限定；

m為0-5的整數(shù)。

在進(jìn)一步的具體實施方式中，所述化合物如通式iii所示：

式中，

r²選自

r³、r⁴各自獨(dú)立選自h或c1-c6烷基，優(yōu)選甲基或乙基；

r⁵、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹獨(dú)立選自下組：

在進(jìn)一步的具體實施方式中，r⁶、r⁸和r⁹為h。

在第二方面，本發(fā)明提供選自下組的化合物或其光學(xué)異構(gòu)體或藥學(xué)上可接受的鹽：

在具體的實施方式中，本發(fā)明提供選自下組的化合物：

在第三方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物含有本發(fā)明第一方面所述的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

在優(yōu)選的實施方式中，所述藥物組合物是適于口服的劑型，包括但不限于片劑、溶液劑、混懸液、膠囊劑、顆粒劑、粉劑。

在第四方面，本發(fā)明提供本發(fā)明第一方面所述的化合物在制備治療或預(yù)防egfr介導(dǎo)的疾病，或抑制egfr的藥物中的用途。

在具體的實施方式中，所述egfr介導(dǎo)的疾病為癌癥。

在進(jìn)一步的具體實施方式中，所述癌癥選自下組：非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、食管癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓癌和實體瘤。

在第五方面，本發(fā)明提供利用本發(fā)明第一方面所述的化合物治療或預(yù)防egfr介導(dǎo)的疾病方法。

在優(yōu)選的實施方式中，所述egfr介導(dǎo)的疾病為癌癥；優(yōu)選地，所述癌癥選自下組：非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、食管癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓癌和實體瘤。

應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具體實施方式

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，出乎意料地發(fā)現(xiàn)一批結(jié)構(gòu)全新的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮衍生物，這些衍生物能夠選擇性抑制egfrt790m突變，對egfr^t790m/l858r激酶抑制活性的ic50值達(dá)到nm級別；對癌細(xì)胞(egfr^l858r/t790m突變)增殖的抑制活性ic50值也達(dá)到nm級別。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。

本發(fā)明人合成了具有egfr抑制活性的候選化合物。對得到的候選化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化，設(shè)計并合成了一系列未見文獻(xiàn)報道的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮類化合物，并進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。對此系列化合物進(jìn)行了分子水平和細(xì)胞水平的活性測試，得到一批具有選擇性抑制egfrt790m突變的化合物。其中化合物006對egfr^t790m/l858激酶抑制活性ic50為4.5nm，h1975(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，egfr^l858r/t790m)細(xì)胞增殖抑制活性ic50為100nm；此外，本發(fā)明的化合物對于egfr野生型的細(xì)胞與egfr突變型的細(xì)胞顯示不同的抑制活性，其中化合物002對于egfr野生型的細(xì)胞與egfr突變型的細(xì)胞的ic50值之比大于20，化合物006的上述ic50值之比接近10，意味著該化合物在體內(nèi)可能具備非常優(yōu)異的差異毒性。

術(shù)語定義

本文中涉及到的一些基團(tuán)定義如下：

本文中，“烷基”指碳鏈長度為1-10個碳原子的飽和的支鏈或直鏈烷基，優(yōu)選的烷基包括長2-8個、1-6個、1-4個、3-8個、1-3個碳原子不等的烷基。烷基的例子包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、庚基等。烷基可以被1個或多個取代基取代，例如被鹵素或鹵代烷基取代。例如，烷基可以是被1-4個氟原子取代的烷基，或者烷基可以是被氟代烷基取代的烷基。

本文中，“環(huán)烷基”是指以碳原子作為環(huán)原子的飽和的環(huán)狀烷基。在優(yōu)選的實施方式中，所述環(huán)烷基包括具有3-8個碳原子作為環(huán)原子的環(huán)烷基，例如(但不限于)環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基。

本文中，“烷氧基”指被烷基取代的氧基。優(yōu)選的烷氧基是長1-6個碳原子的烷氧基，更優(yōu)選為長1-4個碳原子的烷氧基。烷氧基的例子包括但不限于：甲氧基、乙氧基、丙氧基等。

本文中，“鹵素”指氟、氯、溴和碘。

本文所用“雜環(huán)基”包括但不限于含有1-3個選自o、s或n的雜原子的5元或6元雜環(huán)基團(tuán)，包括但不限于呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡咯烷基、吡唑基、咪唑基、三唑基、噁唑基、吡喃基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哌啶基、嗎啉基等。

本文中，“酰氨基”指結(jié)構(gòu)式為“-r’-nh-c(o)-r”的基團(tuán)，其中，r’可選自氫或烷基，r可選自烷基、鏈烯基、炔基、被nrcrd取代的烷基、被nrcrd取代的鏈烯基和nrcrd取代的炔基、被鹵素取代的烷基、被氰基取代的鏈烯基，其中，rc和rd可選自烷基和鏈烯基。

本文中，“任選取代的”指其所修飾的取代基可任選地被1-5個(例如，1、2、3、4或5個)選自以下的取代基取代：鹵素、c1-4醛基、c1-6直鏈或支鏈烷基、氰基、硝基、氨基、羥基、羥甲基、鹵素取代的烷基(例如三氟甲基)、鹵素取代的烷氧基(例如三氟甲氧基)、羧基、c1-4烷氧基、乙氧甲?；?、n(ch3)和c1-4酰基。

本發(fā)明的化合物

本發(fā)明的化合物是以下通式i所示的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

式中，a為苯環(huán)、五元或六元雜環(huán)、c3-c8環(huán)烷基；

r¹各自獨(dú)立選自氫、鹵素、c1-c3烷氧基、c1-c3烷基、c1-c4烷基酰胺基、取代哌嗪基、取代高哌嗪基、取代嗎啉基、取代硫代嗎啉基、4-n-甲基哌嗪基、4-n-乙?；哙夯?-n,n-二甲基哌啶基、取代哌啶基、n,n,n'-三甲基乙二胺基、n,n-二甲基乙醇胺基、1-甲基-4-(哌啶)哌嗪基、-nrarb，其中，ra和rb可選自烷基和含氮烷基；

r²各自獨(dú)立選自以下基團(tuán)：

r³、r⁴各自獨(dú)立選自下組：氫、c1-c10烷基，取代的c1-c10烷基、任選取代的c3-c8環(huán)烷基、任選取代的芐基、任選取代的雜環(huán)基；

b選自下組：

m為0-7的整數(shù)。

在具體的實施方式中，a環(huán)為苯環(huán)，從而本發(fā)明的化合物如以下通式ii所示：

式中，b、r¹、r²、r³、r⁴如上所述；和m為0-5的整數(shù)。

在優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的化合物中的上述苯環(huán)可以是取代或未取代的，例如，本發(fā)明的化合物可以如以下通式iii所示：

式中，

r²選自

r³、r⁴各自獨(dú)立選自h或c1-c6烷基，優(yōu)選甲基或乙基；

r⁵、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹獨(dú)立選自下組：

在進(jìn)一步的實施方式中，本發(fā)明的化合物中的上述苯環(huán)可以作鄰位取代、間位取代和/或?qū)ξ蝗〈?。在?yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的化合物中的上述苯環(huán)是鄰位取代和對位取代的。在具體的實施方式中，以上通式iii中的r⁶、r⁸和r⁹為h。

本發(fā)明人合成得到了一系列結(jié)構(gòu)未見文獻(xiàn)報道的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮類化合物，具體的化合物如下所示：

在本發(fā)明提供的具體化合物中，隨著取代基的不同，有些化合物中存在手性碳原子，即，有些化合物存在光學(xué)異構(gòu)體。本發(fā)明人進(jìn)一步拆分了這些光學(xué)異構(gòu)體，如下表所示：

在本發(fā)明的化合物的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該組合物含有治療有效量的本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。

本發(fā)明化合物的藥學(xué)上可接受的鹽的例子包括但不限于無機(jī)和有機(jī)酸鹽，例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；以及與堿例如鈉羥基、三(羥基甲基)胺基甲烷(tris，胺丁三醇)和n-甲基葡糖胺形成的無機(jī)和有機(jī)堿鹽。

雖然每個人的需求各不相同，本領(lǐng)域技術(shù)人員可確定本發(fā)明藥物組合物中每種活性成分的最佳劑量。一般情況下，本發(fā)明的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，對哺乳動物每天口服給藥，藥量按照約0.0025到50毫克/公斤體重。但最好是每公斤口服給藥約0.01到10毫克。例如，單位口服劑量可以包括約0.01到50毫克，最好是約0.1到10毫克的本發(fā)明化合物。單位劑量可給予一次或多次，每天為一片或多片，每片含有約0.1到50毫克，合宜地約0.25到10毫克的本發(fā)明化合物或其溶劑化物。

本發(fā)明的藥物組合物可被配制成適合各種給藥途徑的制劑形式，包括但不限于被配制成用于腸外，皮下，靜脈，肌肉，腹腔內(nèi)，透皮，口腔，鞘內(nèi)，顱內(nèi)，鼻腔或外用途徑給藥的形式，用于治療腫瘤和其他疾病。給藥量是有效地改善或消除一個或多個病癥的藥量。對于特定疾病的治療，有效量是足以改善或以某些方式減輕與疾病有關(guān)的癥狀的藥量。這樣的藥量可作為單一劑量施用，或者可依據(jù)有效的治療方案給藥。給藥量也許可治愈疾病，但是給藥通常是為了改善疾病的癥狀。一般需要反復(fù)給藥來實現(xiàn)所需的癥狀改善。藥的劑量將根據(jù)病人的年齡，健康與體重，并行治療的種類，治療的頻率，以及所需治療效益來決定。

本發(fā)明的藥物制劑可以給予任何哺乳動物，只要他們能獲得本發(fā)明化合物的治療效果。在這些哺乳動物中最為重要的是人類。

本發(fā)明的化合物或其藥物組合物可用于治療各種由表皮生長因子受體激酶(egfr)介導(dǎo)的疾病。本文中，由egfr介導(dǎo)的疾病為各種癌癥。所述癌癥包括但不限于：非小細(xì)胞肺癌、小細(xì)胞肺癌、肺腺癌、肺鱗癌、乳腺癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、卵巢癌、頭頸部鱗癌、宮頸癌、食管癌、肝癌、腎癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、皮膚癌、白血病、淋巴瘤、胃癌、多發(fā)性骨髓癌及實體瘤。

本發(fā)明的藥物制劑可用已知的方式制造。例如，由傳統(tǒng)的混合，制粒，制錠，溶解，或冷凍干燥過程制造。制造口服制劑時，可結(jié)合固體輔料和活性化合物，選擇性研磨混合物。如果需要或必要時加入適量助劑后，加工顆?；旌衔铮@得片劑或錠劑芯。

合適的輔料特別是填料，例如糖類如乳糖或蔗糖，甘露醇或山梨醇；纖維素制劑或鈣磷酸鹽，例如磷酸三鈣或磷酸氫鈣；以及粘結(jié)劑，例如淀粉糊，包括玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃芪膠，甲基纖維素，羥丙基甲基纖維素，羧甲基纖維素鈉，或聚乙烯吡咯烷酮。如果需要，可增加崩解劑，比如上面提到的淀粉，以及羧甲基淀粉，交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或褐藻酸或其鹽，如海藻酸鈉。輔助劑特別是流動調(diào)節(jié)劑和潤滑劑，例如，硅石，滑石，硬脂酸鹽類，如鎂硬脂酸鈣，硬脂酸或聚乙二醇。如果需要，可以給錠劑核芯提供可以抵抗胃液的合適包衣。為此，可以應(yīng)用濃縮糖類溶液。這個溶液可以含有阿拉伯樹膠，滑石，聚乙烯吡咯烷酮，聚乙二醇和/或二氧化鈦，漆溶液和合適的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。為了制備耐胃液的包衣，可使用適當(dāng)?shù)睦w維素溶液，例如醋酸纖維素鄰苯二甲酸或羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸?？上蛩幤蝈V劑核芯的包衣加入染料或色素。例如，用于識別或為了表征活性成分劑量的組合。

基于上述化合物和藥物組合物，本發(fā)明進(jìn)一步提供一種治療egfr介導(dǎo)的疾病的方法，該方法包括給予需要的對象以本發(fā)明的化合物或藥物組合物。

給藥方法包括但不限于本領(lǐng)域周知的各種給藥方法，可根據(jù)患者的實際情況加以確定。這些方法包括但不限于腸外、皮下、靜脈、肌肉、腹腔內(nèi)、透皮、口腔、鞘內(nèi)、顱內(nèi)、鼻腔或外用途徑給藥。

本發(fā)明也包括本發(fā)明化合物在制備預(yù)防或治療egfr介導(dǎo)的疾病或抑制egfr活性的藥物中的用途。

本發(fā)明的優(yōu)點：

1.本發(fā)明提供的化合物是一種結(jié)構(gòu)全新的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮化合物；

2.本發(fā)明提供的化合物對突變型egfr或egfr突變的癌細(xì)胞具有優(yōu)異的抑制活性；

3.本發(fā)明提供的化合物為開發(fā)能選擇性抑制t790m突變的，能克服臨床耐藥的egfr靶向藥物奠定了基礎(chǔ)，具備極大的產(chǎn)業(yè)化和商品化前景以及市場價值，經(jīng)濟(jì)效益顯著。

以下結(jié)合具體實施案例對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)一步描述，但以下實施案例不構(gòu)成對本發(fā)明的限制，所有依據(jù)本發(fā)明的原理和技術(shù)手段采用的各種施用方法，均屬于本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和份數(shù)按重量計算。

材料與方法

本發(fā)明的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮類化合物的合成如下所示：

試劑和條件：(a)(3-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯,dipea,ch3cn,回流,6h；(b)lialh4,thf,0℃,4h；(c)mno2,ch2cl2,室溫,過夜；(d)格氏試劑,thf,0℃,5h；(e)cdi,k2co3,thf,回流,過夜；(f)芳基胺,三氟乙酸,三氟乙醇,回流,24h；(g)三氟乙酸,ch2cl2,室溫,5h；(h)丙烯酰氯,et3n,ch2cl2,0℃到室溫,過夜。

實施例1

上述步驟a-h的具體合成方法如下：

1.4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)氨基)-2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯的合成

稱取2,4-二氯-5-嘧啶甲酸乙酯(22.100g,100mmol)、dipea(12.900g,100mmol)于500ml單口燒瓶，加入100ml乙腈溶解。另取(3-氨基苯基)氨基甲酸叔丁酯(20.800g,100mmol)溶于100ml乙腈，滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完回流6h。tlc跟蹤至原料轉(zhuǎn)化，冷卻至室溫，抽濾，乙腈洗滌，濾餅烘干，得4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)氨基)-2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯33.710g。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.23(s,1h),9.50(s,1h),8.80(s,1h),7.70(s,1h),7.35(d,j＝8.0hz,1h),7.29(t,j＝8.0hz,1h),7.23(d,j＝8.0hz,1h),4.38(q,j＝7.2hz,2h),1.49(s,9h),1.36(t,j＝7.2hz,3h).lc-ms:m/z:393.1(m+h)⁺.

2.(3–((2-氯-5-(羥甲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)氨基)-2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(31.360g,80mmol)于5000ml兩口燒瓶，加入100ml無水四氫呋喃溶解，冰浴攪拌10分鐘。另取氫化鋰鋁(12.160g,320mmol)溶于150ml無水四氫呋喃中，緩慢滴加到上述反應(yīng)液中，滴加完冰浴攪拌4小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，將反應(yīng)液分批滴入250ml飽和nh4cl水溶液中，乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝2:1,v/v)。得(3-((2-氯-5-(羥甲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯3.638g。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.38(s,1h),7.87(s,1h),7.70(s,1h),7.34(d,j＝8.4hz,1h),7.25(t,j＝8.0hz,1h),7.05(d,j＝8.0hz,1h),6.66(s,1h),4.65(s,2h),1.52(s,9h).lc-ms:m/z:351.1(m+h)⁺.

3.(3–((2-氯-5-甲?；奏?4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-((2-氯-5-(羥甲基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(3.500g,10mmol)于100ml單口燒瓶，加入40ml二氯甲烷溶解。分批加入二氧化錳(58％,15.000g,100mmol)，室溫攪拌過夜。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，墊硅藻土抽濾，濾液旋干，粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝4:1,v/v)。得(3-((2-氯-5-甲?；奏?4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯2.850g。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ10.60(s,1h),9.89(s,1h),8.56(s,1h),7.82(t,j＝2.0hz,1h),7.39(d,j＝8.8hz,1h),7.31(t,j＝8.0hz,1h),7.20(d,j＝8.0hz,1h),6.58(s,1h),1.53(s,9h).lc-ms:m/z:349.1(m+h)⁺.

4.(3-((2-氯-5-(1-羥乙基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-((2-氯-5-甲?；奏?4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.044g,3mmol)于50ml兩口燒瓶，加入20ml無水四氫呋喃溶解，氬氣保護(hù)，冰浴攪拌10分鐘。另取甲基溴化鎂(1minthf,9ml)，緩慢加入到上述反應(yīng)液中，滴加完冰浴攪拌5小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，將反應(yīng)液倒入30ml飽和nh4cl水溶液中，乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝2:1,v/v)。得(3-((2-氯-5-(1-羥乙基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯0.831g。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.83(s,1h),7.77(s,1h),7.70(s,1h),7.29(d,j＝8.4hz,1h),7.23(t,j＝8.0hz,1h),7.05(d,j＝8.0hz,1h),6.67(s,1h),4.87(q,j＝6.4hz,1h),1.55(d,j＝6.4hz,3h),1.52(s,9h).lc-ms:m/z:365.1(m+h)⁺.

5.(3-(7-氯-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-((2-氯-5-(1-羥乙基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.815g,2.2mmol)、碳酸鉀(0.455g,3.3mmol)、1,1'-羰基二咪唑(1.069g,6.6mmol)于25ml單口燒瓶，加入10ml無水四氫呋喃，回流過夜。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入冰水，二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝2:1,v/v)。得(3-(7-氯-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯0.754g。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.59(s,1h),8.54(s,1h),7.61(s,1h),7.41-7.36(m,2h),6.98(d,j＝6.8hz,1h),5.86(q,j＝6.4hz,1h),1.74(d,j＝6.4hz,3h),1.47(s,9h).lc-ms:m/z:391.1(m+h)⁺.

6.(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-(7-氯-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.737g,1.89mmol)、2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(0.502g,2.27mmol)于50ml兩口燒瓶，加入15ml三氟乙醇溶解，滴加三氟乙酸(210μl,2.84mmol)，氬氣保護(hù)，升溫回流24小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，冷卻至室溫，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇＝30:1,v/v)。得(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯0.294g％。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.46(s,1h),8.18(d,j＝8.8hz,1h),7.79(s,1h),7.74(s,1h),7.24-7.20(m,3h),6.69(s,1h),6.54(d,j＝2.4hz,1h),6.50(dd,j＝8.8hz,j＝2.4hz,1h),4.52(q,j＝6.8hz,1h),3.85(s,3h),3.17(t,j＝4.4hz,4h),2.60(t,j＝4.8hz,4h),2.36(s,3h),1.51(s,9h),1.49(d,j＝6.0hz,3h).lc-ms:m/z:576.3(m+h)⁺.

7.n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(001)

稱取(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.277g,0.48mmol)于25ml單口燒瓶，加入6ml二氯甲烷溶解，滴加1ml三氟乙酸，室溫攪拌5小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗品未經(jīng)分離純化直接用于下一步反應(yīng)。

將上一步脫boc產(chǎn)物(0.187g,0.39mmol)溶于5ml二氯甲烷，加入三乙胺(0.060g,0.6mmol)，冰浴攪拌10分鐘。另取丙烯酰氯(42μl,0.51mmol)，溶于1ml二氯甲烷，加入到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌過夜。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇＝20:1,v/v)。得n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺0.091g。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.46(s,1h),8.23(s,1h),7.85(d,j＝8.0hz,1h),7.81(s,1h),7.67(s,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.27(d,j＝8.4hz,1h),7.10(d,j＝8.0hz,1h),6.56(d,j＝1.2hz,1h),6.48(dd,j＝16.8hz,j＝9.6hz,1h),6.27(dd,j＝17.2hz,j＝1.6hz,1h),6.11-6.09(m,1h),5.77(dd,j＝16.8hz,j＝1.6hz,1h),5.73(q,j＝6.4hz,1h),3.76(s,3h),3.22-3.20(m,4h),3.02-2.99(m,4h),2.61(s,3h),1.70(d,j＝6.4hz,3h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc28h32n7o4530.2516,found,530.2512.

發(fā)明人對所得化合物作了進(jìn)一步的手性拆分，從而得到以下對映異構(gòu)體：

以下002-005化合物均按照上述步驟a-g的方法合成得到：

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-乙基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(002)

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.46(s,1h),8.22(s,1h),7.85(d,j＝8.4hz,1h),7.81(s,1h),7.66(s,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.26(d,j＝8.4hz,1h),7.09(d,j＝8.0hz,1h),6.55(d,j＝2.0hz,1h),6.48(dd,j＝16.8hz,j＝6.8hz,1h),6.27(dd,j＝16.8hz,j＝1.6hz,1h),6.10-6.09(m,1h),5.77(dd,j＝10.0hz,j＝1.6hz,1h),5.55(t,j＝6.8hz,1h),3.76(s,3h),3.19(t,j＝4.4hz,4h),2.92(t,j＝4.4hz,4h),2.56(s,3h),2.09-1.95(m,2h),1.03(t,j＝7.2hz,3h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc29h34n7o4544.2672,found,544.2654.

發(fā)明人對所得化合物作了進(jìn)一步的手性拆分，從而得到以下對映異構(gòu)體：

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-丙基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(003)

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.45(s,1h),8.22(s,1h),7.85(d,j＝8.0hz,1h),7.80(s,1h),7.66(s,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.25(d,j＝8.4hz,1h),7.08(d,j＝8.0hz,1h),6.54(d,j＝2.0hz,1h),6.48(dd,j＝16.8hz,j＝10.0hz,1h),6.26(dd,j＝16.8hz,j＝1.6hz,1h),6.10-6.09(m,1h),5.77(dd,j＝9.6hz,j＝1.6hz,1h),5.60(t,j＝7.2hz,1h),3.76(s,3h),3.14(t,j＝4.4hz,4h),2.79(t,j＝4.4hz,4h),2.47(s,3h),2.00-1.92(m,2h),1.56-1.44(m,2h),0.99(t,j＝7.2hz,3h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc30h36n7o4558.2829,found,558.2836.

發(fā)明人對所得化合物作了進(jìn)一步的手性拆分，從而得到以下對映異構(gòu)體：

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4-異丙基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(004)

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.52(s,1h),8.22(s,1h),7.87(d,j＝8.0hz,1h),7.85(s,1h),7.64(s,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.26(d,j＝7.6hz,1h),7.05(d,j＝7.6hz,1h),6.57(d,j＝1.6hz,1h),6.50(dd,j＝16.8hz,j＝10.0hz,1h),6.26(dd,j＝16.8hz,j＝1.6hz,1h),6.14-6.10(m,1h),5.77(dd,j＝10.0hz,j＝1.6hz,1h),5.40(d,j＝4.8hz,1h),3.77(s,3h),3.18(t,j＝4.4hz,4h),2.74(s,3h),2.27-2.22(m,1h),1.04(d,j＝6.8hz,3h),0.99(d,j＝6.8hz,3h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc30h36n7o4558.2829,found,558.2831.

發(fā)明人對所得化合物作了進(jìn)一步的手性拆分，從而得到以下對映異構(gòu)體：

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(005)

¹hnmr(400mhz,cdcl3+cd3od)δ8.09(s,1h),7.89(s,1h),7.75(d,j＝8.4hz,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.42-7.39(m,1h),7.07(d,j＝7.6hz,1h),6.42-6.38(m,2h),6.15(d,j＝7.2hz,1h),5.71(dd,j＝9.2hz,j＝2.8hz,1h),5.36(s,2h),3.80(s,3h),3.37(t,j＝4.8hz,4h),3.24(t,j＝4.8hz,4h),2.82(s,3h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc27h30n7o4516.2359,found,516.2364.

化合物006-008的具體合成方法如下：

試劑和條件：(a)格氏試劑,thf,0℃,6h；(b)cdi,k2co3,thf,回流,過夜；(c)芳基胺,三氟乙酸,三氟乙醇,回流,24h；(d)三氟乙酸,ch2cl2,室溫,5h；(e)丙烯酰氯,et3n,ch2cl2,0℃到室溫,過夜。

1.(3-((2-氯-5-(2-羥基丙-2-基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取4-((3-((叔丁氧基羰基)氨基)苯基)氨基)-2-氯嘧啶-5-甲酸乙酯(2.352g,6mmol)于50ml兩口燒瓶，加入20ml無水四氫呋喃溶解，氬氣保護(hù)，冰浴攪拌10分鐘。另取甲基溴化鎂(1minthf,24ml)，緩慢加入到上述反應(yīng)液中，滴加完冰浴攪拌6小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，將反應(yīng)液倒入50ml飽和nh4cl水溶液中，乙酸乙酯萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝2.5:1,v/v)。得(3-((2-氯-5-(2-羥基丙-2-基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯1.586g。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ10.01(s,1h),9.41(s,1h),8.12(s,1h),7.62(t,j＝2.0hz,1h),7.40(dd,j＝8.0hz,j＝1.2hz,1h),7.25(t,j＝8.4hz,1h),7.13(d,j＝8.8hz,1h),6.43(s,1h),1.56(s,6h),1.48(s,9h).lc-ms:m/z:379.1(m+h)⁺.

2.(3-(7-氯-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-((2-氯-5-(2-羥基丙-2-基)嘧啶-4-基)氨基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.512g,4mmol)、碳酸鉀(0.828g,6mmol)、1,1'-羰基二咪唑(1.296g,8mmol)于25ml單口燒瓶，加入10ml無水四氫呋喃，回流過夜。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入冰水，二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(石油醚/乙酸乙酯＝2.5:1,v/v)。得(3-(7-氯-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯1.049g。¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ9.57(s,1h),8.64(s,1h),7.57(s,1h),7.41-7.36(m,2h),7.01-6.99(m,1h),1.79(s,6h),1.47(s,9h).lc-ms:m/z:405.1(m+h)⁺.

3.(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯

稱取(3-(7-氯-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(1.010g,2.5mmol)、2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯胺(0.663g,3mmol)于50ml兩口燒瓶，加入15ml三氟乙醇溶解，滴加三氟乙酸(280μl,3.77mmol)，氬氣保護(hù)，升溫回流24小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，冷卻至室溫，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑。粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇＝25:1,v/v)。得(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯0.516g。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(s,1h),7.51(d,j＝8.4hz,2h),7.47-7.43(m,2h),7.01(d,j＝7.2hz,1h),6.45(s,1h),6.44(d,j＝2.4hz,1h),6.18-6.16(m,1h),3.82(s,3h),3.16(t,j＝4.4hz,4h),2.67(t,j＝4.4hz,4h),2.42(s,3h),1.80(s,6h),1.49(s,9h).lc-ms:m/z:590.4(m+h)⁺.

4.n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(006)

稱取(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)氨基甲酸叔丁酯(0.500g,0.85mmol)于25ml單口燒瓶，加入6ml二氯甲烷溶解，滴加1ml三氟乙酸，室溫攪拌5小時。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗品未經(jīng)分離純化直接用于下一步反應(yīng)。

將上一步脫boc產(chǎn)物(0.335g,0.68mmol)溶于5ml二氯甲烷，加入三乙胺(0.102g,1.02mmol)，冰浴攪拌10分鐘。另取丙烯酰氯(72μl,0.88mmol)，溶于1ml二氯甲烷，加入到上述反應(yīng)液中，室溫攪拌過夜。tlc跟蹤原料轉(zhuǎn)化，加入飽和nahco3水溶液中和至堿性。二氯甲烷萃取，收集有機(jī)層，無水na2so4干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，粗品經(jīng)硅膠柱層析分離純化(二氯甲烷/甲醇＝20:1,v/v)。得n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二甲基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺0.165g。¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.08(s,1h),7.79(d,j＝8.0hz,1h),7.74(s,1h),7.47(t,j＝8.0hz,1h),7.38-7.36(m,1h),7.05(d,j＝7.6hz,1h),6.41(d,j＝2.0hz,1h),6.36-6.33(m,2h),6.13(s,1h),5.70(dd,j＝9.2hz,j＝2.4hz,1h),3.80(s,3h),3.17(t,j＝4.4hz,4h),2.80(t,j＝4.4hz,4h),2.50(s,3h),1.80(s,6h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc29h34n7o4544.2672,found,544.2698.

以下007和008化合物均按照上述步驟a-e的方法合成得到：

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二乙基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(007)

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ9.42(s,1h),7.96(s,1h),7.89(s,1h),7.81(d,j＝5.6hz,1h),7.53(s,1h),7.42(t,j＝8.0hz,1h),7.33-7.31(m,1h),6.99(d,j＝7.6hz,1h),6.55-6.49(m,1h),6.36-6.32(m,2h),6.12(d,j＝7.6hz,1h),5.65(d,j＝10.4hz,1h),3.78(s,3h),3.41(t,j＝4.4hz,4h),3.21(t,j＝4.4hz,4h),2.80(s,3h),2.11-1.96(m,4h),1.00(t,j＝7.2hz,6h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc31h38n7o4572.2985,found,572.2981.

n-(3-(7–((2-甲氧基-4-(4-甲基哌嗪-1-基)苯基)氨基)-4,4-二異丙基基-2-氧代-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-1(4h)-基)苯基)丙烯酰胺(008)

¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ8.06(s,1h),7.96(s,1h),7.77(d,j＝4.8hz,1h),7.49(s,1h),7.41(t,j＝8.0hz,1h),6.97(d,j＝8.0hz,1h),6.40(d,j＝2.0hz,1h),6.36(dd,j＝16.8hz,j＝1.2hz,1h),6.18-6.12(m,2h),5.68(dd,j＝10.4hz,j＝1.2hz,1h),3.79(s,3h),3.09(t,j＝4.4hz,4h),2.58(t,j＝4.8hz,4h),2.36(s,3h),2.07-2.00(m,2h),1.96-1.89(m,2h),1.54-1.38(m,4h),0.97(t,j＝7.2hz,6h).hrms(esi)(m/z):(m+h)⁺calcdforc33h42n7o4600.3298,found,600.3297.

實施例2.生物活性測試

本發(fā)明提供的化合物對egfr激酶活性的體外抑制效果實驗如下進(jìn)行：

體外酶活性分析：野生型及突變型(l858/t790m)egfr均購自于invitrogen。為所有的待測試化合物設(shè)置了從5.1×10^-11mol/l到1.0×10^-6mol/l的10個濃度梯度。

不同激酶的濃度由優(yōu)化實驗決定，相應(yīng)的濃度為：egfr(pv3872,invitrogen)0.287μg/μl,egfr-l858r/t790m(pv4879,invitrogen)0.055μg/μl?；衔镌赿mso中從5.1x10^-9m到1x10^-4m稀釋三倍。4μl化合物溶于96μl水，得到4x的化合物溶液。40μmatp溶于1.33x激酶緩沖液，激酶/肽混合物包含2x激酶、4μm酪氨酸4肽準(zhǔn)備好待用。10μl激酶反應(yīng)包括2.5μl化合物溶液，5μl激酶/肽混合物，2.5μlatp溶液。5μl磷酸化肽溶液代替激酶/肽混合物用作100％磷酸化對照。2.5μl1.33x激酶緩沖液代替atp溶液用作100％抑制對照，2.5μl4％dmso代替化合物溶液用作0％抑制對照。板內(nèi)溶液充分混合后在室溫下培養(yǎng)1.5小時。每孔加入5μldevelopmentsolution后繼續(xù)在室溫下培養(yǎng)1小時，非磷酸化肽在此時間內(nèi)被裂解。最后，加入5μl終止制劑(stopreagent)結(jié)束反應(yīng)?？装逵胑nvisionmultilabelreader(perkinelmer)進(jìn)行測量。實驗數(shù)據(jù)使用graphpadprismversion4.0進(jìn)行計算。每次實驗均重復(fù)3次以上。

細(xì)胞增殖及生長抑制分析：h1975(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，egfr^l858r/t790m)、a431(非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞，egfr野生型)，細(xì)胞均從atcc獲得。細(xì)胞增殖活性采用mts分析法進(jìn)行評估。細(xì)胞暴露在處理條件下72小時，各細(xì)胞系每次實驗所使用的細(xì)胞數(shù)根據(jù)吸光度值(490nm處的吸光度值為1.3-2.2)進(jìn)行調(diào)整。為待測試化合物設(shè)置了6個濃度梯度(0.1nm-10μm)，每個濃度值至少使用6組平行對照。

h1975、a431細(xì)胞在相應(yīng)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，細(xì)胞在復(fù)蘇后至少傳代兩次，然后用于實驗使用。對數(shù)期的細(xì)胞受胰蛋白酶作用并在培養(yǎng)基中再懸浮。h1975(每孔1000細(xì)胞)、a431(每孔2000細(xì)胞)播種于96孔板中，體積100μl；設(shè)置6組平行及7列?？装宸庞?7℃5％二氧化碳的培養(yǎng)箱中過夜。將化合物溶于dmso，配制濃度為每升10μm，隨后將化合物濃度逐步稀釋得到的化合物濃度分別為每升10μm、1μm、0.1μm、0.01μm、0.001μm、0.0001μm。2μl化合物溶液加到998μl的培養(yǎng)基中，混合物經(jīng)充分混合。100μl的混合物加入96孔板中。2μldmso代替化合物溶液用作0％抑制對照。培養(yǎng)68小時之后，加入20μlmtt(5mg/ml)。4小時候，拋棄上清液并加入150μldmso。搖振10分鐘之后，孔板用synergyht(biotek)(od490)讀取數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)使用graphpadprismversion4.0進(jìn)行計算，ic50值通過使用劑量反應(yīng)曲線的非線性回歸模型調(diào)整得到。

測試結(jié)果如下表1所示。

表1

討論：

發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，設(shè)計并合成得到了一系列結(jié)構(gòu)未見文獻(xiàn)報道的1,4-二氫-2h-嘧啶并[4,5-d][1,3]噁嗪-2-酮類化合物，對得到的化合物進(jìn)行了分子水平和細(xì)胞水平的活性測試，得到一批能夠選擇性抑制egfrt790m突變的化合物。本發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的化合物對egfr突變型癌細(xì)胞(h1975)和egfr野生型癌細(xì)胞(a431)的增殖抑制能力差異高于對突變型egfr和野生型egfr激酶活性抑制能力差異，從而提示本發(fā)明的化合物在體內(nèi)有更好的差異毒性，有可能成為選擇性抑制t790m突變，克服臨床耐藥的第三代egfr靶向藥物，或者作為經(jīng)進(jìn)一步修飾得到活性更佳和/或差異毒性更佳的化合物的基礎(chǔ)。

在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。