孢囊菌酰胺(cystobactamides)是一種從粘細(xì)菌深棕色孢囊桿菌(mcy8071；內(nèi)部名稱(chēng)：深棕色孢囊桿菌)中分離出的新天然產(chǎn)物。孢囊菌酰胺表現(xiàn)出良好的抗菌活性，特別是對(duì)于選定的革蘭氏陰性菌，例如大腸桿菌、銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌，且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌具有廣譜活性。本發(fā)明提供了一種式(i)化合物其中，r1為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-6烷基所示的基團(tuán)；r2為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-6烷基所示的基團(tuán)；r3為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-6烷基所示的基團(tuán)；r4為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-6烷基所示的基團(tuán)；和r5為氫原子或如下式所示的基團(tuán)：其中r6為oh或nh2；或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，或其藥學(xué)上可接受的制劑。表述c1-6烷基是指含有1至6個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。表述c1-4烷基是指含有1至4個(gè)碳原子的飽和直鏈或支鏈烴基。實(shí)例是甲基(me)，乙基，丙基，異丙基，正丁基，異丁基，仲丁基或叔丁基。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中：r1為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-4烷基所示的基團(tuán)；r2為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-4烷基所示的基團(tuán)；r3為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-4烷基所示的基團(tuán)；r4為氫，oh或?yàn)槿缡?o-c1-4烷基所示的基團(tuán)；和r5為如下式所示的基團(tuán)：其中r6為oh或nh2；或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，或其藥學(xué)上可接受的制劑。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r1為oh。還優(yōu)選式(i)所示的化合物，其中r1為如式-o-c1-4烷基所示的基團(tuán)；特別是其中r1為如式-o-ch(ch3)2所示的基團(tuán)。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r2為氫。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r2為oh。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r3為氫。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r3為oh。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r3為如式-o-c1-4烷基所示的基團(tuán)。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r4為氫。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r4為oh。特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r5為如下式所示的基團(tuán)：其中r6為oh或nh2；特別優(yōu)選的為如式(i)所示的化合物，其中r5為如下式所示的基團(tuán)：其中r6為oh或nh2；特別優(yōu)選的為如式(ii)所示的化合物：其中r1，r2，r3和r5如上文對(duì)式(i)化合物所定義，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，或其藥學(xué)上可接受的制劑。更加優(yōu)選的為如式(iii)所示的化合物：其中r2，r3，r4和r5如上文對(duì)式(i)化合物所定義，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，或其藥學(xué)上可接受的制劑。特別優(yōu)選的為如式(iv)所示的化合物：其中r1，r3，r4和r5如上文對(duì)式(i)化合物所定義，或其藥學(xué)上可接受的鹽、溶劑化物或水合物，或其藥學(xué)上可接受的制劑。最優(yōu)選的是以下化合物：根據(jù)特別優(yōu)選的實(shí)施方案，本文所述的本發(fā)明化合物在r5基團(tuán)顯示以下立體化學(xué)構(gòu)型：其中r6為oh或nh2。優(yōu)選地，以下化合物被排除在本申請(qǐng)的范圍之外：根據(jù)另外的優(yōu)選實(shí)施方案，r1，r2，r3，r4和r5不同時(shí)為氫。此外優(yōu)選地，以下化合物被排除在本申請(qǐng)的范圍之外：本發(fā)明還提供了含有本發(fā)明所述的一種或多種化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽，溶劑合物或水合物，以及任選的一種或多種載體物質(zhì)和/或一種或多種佐劑的藥物組合物。本發(fā)明還提供了一種所述的化合物或藥物組合物用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌感染的用途，特別是由于大腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌或其它革蘭氏陰性細(xì)菌，以及革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌導(dǎo)致的感染。更加優(yōu)選地，本發(fā)明提供了化合物用于治療和/或預(yù)防細(xì)菌感染，特別是由銅綠假單胞菌和其他革蘭氏陰性菌所引起的感染的用途。本發(fā)明的另一目的是提供一種如本文所述的化合物或藥物組合物用于制備治療和/或預(yù)防細(xì)菌感染的藥物組合物的用途，特別是由選定的革蘭氏陰性細(xì)菌和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌所引起的感染。具有足夠堿性的化合物的藥理學(xué)上可接受的鹽的實(shí)例為生理學(xué)上可接受的無(wú)機(jī)酸如鹽酸，氫溴酸，硫酸和磷酸鹽；或有機(jī)酸如甲磺酸，對(duì)甲苯磺酸，乳酸，乙酸，三氟乙酸，檸檬酸，琥珀酸，富馬酸，馬來(lái)酸和水楊酸的鹽。此外，足夠酸性的化合物可形成堿金屬或堿土金屬鹽，例如鈉、鉀、鋰、鈣或鎂鹽；銨鹽；或有機(jī)堿鹽，例如甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙二胺、乙醇胺、膽堿氫氧化物、甲基葡胺、哌啶、嗎啉，三(2-羥乙基)胺、賴(lài)氨酸或精氨酸鹽；所有這些也都是本文所述的化合物的鹽的進(jìn)一步實(shí)例。本發(fā)明所述的化合物可以是溶劑合物，優(yōu)選水合物。在生產(chǎn)的過(guò)程中，或由于最初無(wú)水的化合物的吸濕性質(zhì)導(dǎo)致的結(jié)果，可能會(huì)發(fā)生水合/水化。其溶劑合物和/或水合物可以以例如固體或液體形式存在。本文所述的化合物，其藥理學(xué)上可接受的鹽，溶劑合物和水合物，以及制劑和藥物組合物的各自治療用途，也屬于本發(fā)明的范圍之內(nèi)。如本發(fā)明所述的藥物組合物包含至少一種本發(fā)明所述化合物和任選的一種或多種載體物質(zhì)和/或佐劑。如上所述，包含本發(fā)明所述的化合物、其溶劑合物，鹽或制劑的治療上有用的藥劑，也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在一般情況下，可通過(guò)使用本領(lǐng)域已知的公知的和可接受的方式，將本發(fā)明所述的化合物單獨(dú)地或與任何其它治療劑組合地施用。對(duì)于口服給藥，所述的治療上有用有效的試劑藥劑可以通過(guò)下列途徑之一施用：口服，例如作為片劑，錠劑，包衣片劑，丸劑，半固體，軟或硬膠囊，例如軟或硬明膠膠囊，水性或油性溶液劑，乳劑，混懸劑或糖漿劑，腸胃外給藥包括靜脈內(nèi)，肌內(nèi)和皮下注射，例如作為可注射溶液或懸浮液，直腸中作為栓劑，通過(guò)吸入或吹入，例如作為粉末制劑，如微晶或作為噴霧劑(例如液體氣霧劑)，經(jīng)皮，例如通過(guò)透皮遞送系統(tǒng)(tds)，例如包含活性成分的膏藥，或鼻內(nèi)。為了生產(chǎn)這樣的片劑，丸劑，半固體，包衣片劑，糖衣丸和硬膠囊例如明膠膠囊，治療有用的產(chǎn)物可以與藥學(xué)惰性的無(wú)機(jī)或有機(jī)的賦形劑混合，例如，乳糖、蔗糖、葡萄糖、明膠、麥芽、硅膠、淀粉或其衍生物、滑石、硬脂(stearinic)酸或其鹽、脫脂奶粉等。為生產(chǎn)軟膠囊，可以使用賦形劑，例如，植物油、石油、動(dòng)物油或合成油、蠟、脂肪和多元醇。用于生產(chǎn)液體溶液，乳劑或混懸劑或糖漿劑，可以使用以下物質(zhì)作為賦形劑，例如使用水、醇、含水鹽水、葡萄糖水溶液、多元醇、甘油、脂質(zhì)、磷脂、環(huán)糊精、植物油、石油、動(dòng)物油或合成油。特別優(yōu)選的為脂質(zhì)，而更優(yōu)選的是磷脂(優(yōu)選天然來(lái)源的；特別優(yōu)選具有300至350nm之間的粒徑)，優(yōu)選在磷酸鹽緩沖鹽水中(ph值＝7-8，優(yōu)選7.4)。用于栓劑，可以使用的賦形劑是例如，植物油、石油、動(dòng)物油或合成油、蠟、脂肪和多元醇。用于氣霧劑制劑，可以使用對(duì)于此目的合適的壓縮氣體，例如，氧、氮和二氧化碳。該藥學(xué)上有用的藥劑也可以含有添加劑用于保存、穩(wěn)定，如uv穩(wěn)定劑、乳化劑、甜味劑、芳香劑、鹽類(lèi)(用于改變滲透壓)、緩沖劑、包衣添加劑和抗氧化劑。通常，口服或腸胃外給藥于體重約80公斤的成人的情況，合適的日劑量為約1mg至約10,000mg，優(yōu)選為約5mg至約1,000mg，盡管在有提示時(shí)其上限可超標(biāo)。日劑量可以為單劑量或分劑量，或?qū)τ谀c胃外給藥，它可以通過(guò)連續(xù)輸注或皮下注射給藥。本發(fā)明的化合物可以通過(guò)發(fā)酵(例如，通過(guò)菌株mcy8071dsm27004的發(fā)酵)或通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的化學(xué)合成應(yīng)用程序來(lái)制備。本發(fā)明的化合物可以按照pct/ep2014/001925(wo2015/003816)中描述的方法合成，特別是在第87至138頁(yè)上，其通過(guò)引用并入本文。例如，本發(fā)明的化合物可以通過(guò)以下流程制備：實(shí)施例1.發(fā)酵制備條件生產(chǎn)用菌株菌株深棕色孢囊桿菌(cystobactervelatus)mcy8071屬于粘細(xì)菌目(粘細(xì)菌)、孢囊桿菌亞目、孢囊桿菌科、孢囊桿菌屬。部分16srrna基因序列與公共數(shù)據(jù)庫(kù)的序列比較(blast，由ncbi(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)所提供的“基本的局部比對(duì)搜索工具”)顯示，與深棕色孢囊桿菌菌株dsm14718相似度100％。在1982年收集的中國(guó)土壤樣品中，在亥姆霍茲感染研究中心(hzi，以前稱(chēng)為gbf)分離了mcy8071。該菌株于2013年3月保藏在布倫瑞克(braunschweig)的德國(guó)微生物保藏中心(dsm)，保藏號(hào)為dsm27004。培養(yǎng)菌株mcy8071在酵母瓊脂(vy/2：0.5％釀酒酵母，0.14％cacl2×2h2o，0.5μg維生素b12/l，1.5％瓊脂，ph7.4)，cy-瓊脂(酪胨0.3％，酵母提取物0.1％，cacl2×2h2o0.1％，瓊脂1.5％，ph7.2)和p-瓊脂(馬考爾蛋白胨(peptonemarcor)0.2％，淀粉0.8％，單細(xì)胞蛋白probione0.4％，酵母提取物0.2％，cacl2×2h2o0.1％，mgso40.1％，fe-edta8mg/l，1.5％瓊脂，ph7.5)上充分生長(zhǎng)。工作培養(yǎng)物在液體介質(zhì)cy/h(50％cy培養(yǎng)基+50mmhepes緩沖液，50％h培養(yǎng)基：大豆粉0.2％，葡萄糖0.8％，淀粉0.2％，酵母提取物0.2％，cacl2×2h2o)0.1％，mgso40.1％，fe-edta8mg/l，hepes緩沖液50mmph7.4)中培養(yǎng)。液體培養(yǎng)物在30℃下以180rpm搖動(dòng)。為了保存，將2ml每份的三日齡培養(yǎng)物儲(chǔ)存在-80℃下。在上述瓊脂平板上或在20mlcy/h介質(zhì)(在具有栓塞和鋁蓋的100ml錐形瓶中)中，即使經(jīng)過(guò)幾年再激活也沒(méi)有問(wèn)題。一兩天后，可將20毫升培養(yǎng)物放大至100毫升。形態(tài)描述在液態(tài)介質(zhì)cy/h中兩天后，上述菌株mcy8071的桿狀細(xì)胞具有9.0–14.5μm的長(zhǎng)度，以及0.8–1.0μm的寬度。在上述瓊脂平板上，菌落是圓形的。在vy/2-瓊脂中，菌落是薄而透明的。在vy/2-瓊脂中，酵母的退化是可見(jiàn)的。在cy-瓊脂中，培養(yǎng)物看起來(lái)是透明的橙色。在p-瓊脂上，細(xì)胞群的產(chǎn)生是獨(dú)特的，且菌落聚集行為減少。菌落是橙棕色的。p-瓊脂中的淀粉被分解。mcy8071對(duì)以下抗生素耐藥：氨芐青霉素，慶大霉素，潮霉素，多粘菌素(polymycin)，桿菌肽，大觀(guān)霉素，新霉素和夫西地酸。在頭孢菌素和春雷霉素存在下可能有微弱生長(zhǎng)，在硫鏈絲菌素，甲氧芐啶，卡那霉素，和土霉素存在下生長(zhǎng)是不可能的(所有抗生素的終濃度調(diào)節(jié)至50μgml-1)。孢囊菌酰胺生產(chǎn)菌株在復(fù)合介質(zhì)中生產(chǎn)。它更喜歡含氮營(yíng)養(yǎng)素，如單細(xì)胞蛋白(probion)和蛋白質(zhì)分解產(chǎn)物如蛋白胨，胰蛋白胨，酵母提取物，大豆粉和肉提取物等。在此，多個(gè)所述的蛋白混合物存在下的生產(chǎn)情況由于使用單一蛋白質(zhì)。孢囊菌酰胺是在相對(duì)于生長(zhǎng)固定相的對(duì)數(shù)期至穩(wěn)定期之間產(chǎn)生的。經(jīng)過(guò)在100升發(fā)酵(培養(yǎng)基e)兩天后，產(chǎn)物的量不再增加。孢囊菌酰胺被遞送到培養(yǎng)基，并與xad-吸附樹(shù)脂結(jié)合。xad通過(guò)金屬篩進(jìn)行篩分，并在丙酮中洗脫。在不同的生產(chǎn)溫度(21℃，30℃，37℃和42℃)下進(jìn)行了測(cè)試，而在42℃下是不能進(jìn)行生產(chǎn)的。在最大通氣量時(shí)的最佳溫度為30℃。mcy8071的發(fā)酵是采用100升培養(yǎng)基e(脫脂乳0.4％，大豆粉0.4％，酵母提取物0.2％，淀粉1.0％，mgso40.1％，fe-edta8mg/l，甘油0.5％；ph7.4)的150升發(fā)酵罐中進(jìn)行，以及采用70升培養(yǎng)基m(大豆蛋白胨1.0％，麥芽糖1.0％，cacl2×2h2o0.1％，mgso40.1％，fe-edta8mg/l；ph7.2)，在100升發(fā)酵罐中進(jìn)行，并在30℃下發(fā)酵4天。用氫氧化鉀(2.5％)和7.2至7.4之間的硫酸調(diào)節(jié)ph。攪拌器速度為100-400rpm，用0.05vvm壓縮空氣通氣。發(fā)酵液中的溶解氧含量由攪拌器轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)至po240％。將1％吸附樹(shù)脂加入到發(fā)酵液中以結(jié)合孢囊菌酰胺。將5升3天齡的預(yù)培養(yǎng)物(分別為e或m培養(yǎng)基)接種至發(fā)酵罐。通過(guò)hplc-ms分析和針對(duì)大腸桿菌的甲醇提取物的系列稀釋試驗(yàn)檢查發(fā)酵過(guò)程中的產(chǎn)物。菌株產(chǎn)生孢囊菌酰胺。以下孢囊菌酰胺(除了在wo2015/003816＝pct/ep2014/001925中描述的孢囊菌酰胺a，b，c，d，e和f之外)已經(jīng)分離并且通過(guò)nmr和ms表征：孢囊菌酰胺935-2:ms:nmr:孢囊菌酰胺935_2nmr(700mhz,meoh-d4)孢囊菌酰胺819-1：孢囊菌酰胺845-2：孢囊菌酰胺846-1：孢囊菌酰胺861-1：孢囊菌酰胺862-1：孢囊菌酰胺862-2：孢囊菌酰胺891-1：孢囊菌酰胺903-1：孢囊菌酰胺903-2：孢囊菌酰胺905-1：孢囊菌酰胺905-2：孢囊菌酰胺920-1：孢囊菌酰胺933-1：孢囊菌酰胺933-2：孢囊菌酰胺934-1：孢囊菌酰胺934-2：孢囊菌酰胺919-2:c46h46n7o14[m+h]+的hrms(esi):計(jì)算值920.3103，檢測(cè)值920.3106。孢囊菌酰胺919-2在meoh-d4中的核磁數(shù)據(jù):孢囊菌酰胺919-2在dmso-d6中的核磁數(shù)據(jù):*由于在dmso-d6中的nmr光譜中的信號(hào)變寬效應(yīng)，與這些單元相對(duì)應(yīng)的信號(hào)不能被分配：也參見(jiàn)“結(jié)構(gòu)闡明”和圖s42-s45。如正常肽中含有甲氧基-天門(mén)冬酰胺(或天冬氨酸)片段的孢囊菌酰胺在其質(zhì)譜中顯示413(414)-片段(圖1)。當(dāng)存在甲氧基-天門(mén)冬氨酸(天冬氨酸)時(shí)，含有異氨基酸的孢囊菌酰胺不顯示413(414)-片段(圖2)。基于孢囊菌酰胺的質(zhì)譜中該片段的存在，可以闡明異-和非-異氨基酸的存在。孢囊菌酰胺的生物學(xué)評(píng)價(jià)抗菌活性孢囊菌酰胺(cys)919-2,920-1,934-2,935-2,891-2和905-2和已經(jīng)描述的衍生物(861-2,877-2,920-2)一起評(píng)估，它們將用于抗所選擇的一組革蘭氏陰性細(xì)菌。衍生物861-2,877-2,919-1和920-2對(duì)應(yīng)于wo2015/003816中描述的孢囊菌酰胺f，h，a和b。mic值以μg/ml表示；使用環(huán)丙沙星(cp)作為參考。將孢囊菌酰胺919-2和891-2與已經(jīng)描述的衍生物861-2(f)和919-1(a)一起在更大的微生物組和cho-k1細(xì)胞系上一起測(cè)試。mic值以μg/ml表示；*ic50以μm計(jì)；使用環(huán)丙沙星(cp)作為參考耐藥率使用4倍mic下的大腸桿菌dsm-1116測(cè)定對(duì)孢囊菌酰胺861-2和919-2的耐藥率為10-7-10-8。體外活性與孢囊菌酰胺919-2和環(huán)丙沙星(cp)相比，測(cè)定了孢囊菌酰胺861-2對(duì)大腸桿菌和銅綠假單胞菌回旋酶dna超螺旋(sc)活性的活性?；蚨拘栽谑褂?0μg/ml的孢囊菌酰胺861-2,919-2和環(huán)丙沙星的cho-k1細(xì)胞系的微核形成測(cè)定中未觀(guān)察到可檢測(cè)到的基因毒性作用。絲裂霉素c(100ng/ml)用作陽(yáng)性對(duì)照。所有實(shí)驗(yàn)均一式三份進(jìn)行，并對(duì)染色的核的顯微鏡圖像進(jìn)行了評(píng)估。在絲裂霉素c處理的cho-k1細(xì)胞中清楚地觀(guān)察到微核形成，但未在未處理的對(duì)照組，環(huán)丙沙星和孢囊菌酰胺處理的細(xì)胞中觀(guān)察到細(xì)胞核形成。材料與方法最小抑菌濃度(mic)測(cè)定在敏感性試驗(yàn)中使用的細(xì)菌的指標(biāo)菌株是我們菌株收藏的一部分，或是從德國(guó)微生物菌種保藏中心(dsmz)或從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc)購(gòu)得。野生型(wt)大腸桿菌菌株以及大腸桿菌突變體為漢堡大學(xué)醫(yī)藥生物和微生物學(xué)的p.heisig教授，博士惠贈(zèng)。從cgsc的收藏得到大腸桿菌菌株jw0401-1(wt)和δtsx。mic值通過(guò)微量稀釋試驗(yàn)測(cè)定。過(guò)夜培養(yǎng)物在適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)培養(yǎng)基中稀釋以獲得104-106cfu/ml的接種物。酵母在myc培養(yǎng)基(1％植物蛋白胨，1％葡萄糖，50mmhepes緩沖液，ph7.0)，肺炎鏈球菌和腸球菌在胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基(tsb：1.7％蛋白胨酪蛋白，0.3％蛋白胨豆粕，0.25％葡萄糖，0.5％nacl，0.25％k2hpo4；ph7.3)中；恥垢分枝桿菌在補(bǔ)充有10％的米德?tīng)柌剪斂?middlebrook)adc富集和2毫升/升甘油的米德?tīng)柌剪斂?middlebrook)7h9培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所有其他列出的細(xì)菌在米勒-辛頓(müller-hinton)培養(yǎng)基(0.2％牛肉輸注固體，1.75％酪蛋白水解物，0.15％淀粉，ph7.4)中生長(zhǎng)。將孢囊菌酰胺和對(duì)照藥物直接添加到無(wú)菌96孔板中的培養(yǎng)物中，一式兩份，并制備系列稀釋物。微生物在微孔板搖床(750rpm，30-37℃，18-48小時(shí))上生長(zhǎng)，除了在非振蕩條件(37℃，5％co2，18小時(shí))下生長(zhǎng)的肺炎鏈球菌。通過(guò)目視檢查評(píng)估生長(zhǎng)抑制，mic被定義為抑制可見(jiàn)生長(zhǎng)的化合物的最低濃度。細(xì)胞毒性cho-k1細(xì)胞獲自dsmz，并在保藏人推薦的條件下培養(yǎng)。將細(xì)胞以6×103個(gè)細(xì)胞/孔接種在96孔板中的180μl完全培養(yǎng)基中，并在平衡2小時(shí)后用系列稀釋的化合物處理。每個(gè)樣品一式兩份測(cè)試以及內(nèi)部dmso對(duì)照。經(jīng)過(guò)5天的孵育，每孔加入20μl的5mg/mlmtt(噻唑藍(lán)四唑溴化物)的pbs溶液，并在37℃下再孵育2小時(shí)。然后棄去培養(yǎng)基，用100μlpbs洗滌細(xì)胞，然后加入100μl的2-丙醇/10nhcl(250:1)，以溶解甲瓚顆粒。使用酶標(biāo)儀(tecaninfinitem200pro)測(cè)量570nm處的吸光度，并且相對(duì)于相應(yīng)的甲醇對(duì)照表示細(xì)胞活力百分比。耐藥率為了確定對(duì)孢囊菌酰胺的自發(fā)耐藥率，在米勒-辛頓(müller-hinton)培養(yǎng)基中調(diào)整對(duì)數(shù)相細(xì)菌細(xì)胞懸浮液至終濃度為1010cfu/ml，并且在大腸桿菌上以4倍mic的含有孢囊菌酰胺的重復(fù)瓊脂平板上劃痕不同體積。此外，在不含抗生素的平板上劃線(xiàn)大腸桿菌培養(yǎng)物的幾種稀釋液。1天后，通過(guò)將含有孢囊菌酰胺的平板上的cfu除以無(wú)抗生素的平板上的cfu數(shù)來(lái)確定耐藥率。酶抑制為了測(cè)試孢囊菌酰胺的抗旋轉(zhuǎn)酶活性，使用市售的大腸桿菌和銅綠假單胞菌回旋酶超螺旋試劑盒(inspiralis公司，諾維奇，英國(guó))。對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)，將0.5μg松弛質(zhì)粒與1x反應(yīng)緩沖液中的1單位回旋酶混合(參見(jiàn)試劑盒手冊(cè))，并在37℃下孵育30分鐘。通過(guò)加入含有10％(w/v)sds的dna凝膠加載緩沖液淬滅反應(yīng)。樣品在1％(w/v)瓊脂糖凝膠上分離，dna用etbr顯色。所有天然產(chǎn)物儲(chǔ)備溶液和稀釋液在100％dmso中制備，并加入到超螺旋反應(yīng)中，得到最終的dmso濃度為2％(v/v)。遺傳毒性研究從dsmz獲得中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢cho-k1細(xì)胞(acc-110)，并在保藏人推薦的條件下保存。對(duì)于基因毒性研究，將細(xì)胞以5×103細(xì)胞/孔接種在具有光學(xué)底部的黑色96孔板中，并在化合物加入之前使其貼壁1天。cp，加入孢囊菌酰胺和絲裂霉素c至終濃度為20μg/ml(促旋酶抑制劑)和100ng/ml(絲裂霉素c)。處理細(xì)胞48小時(shí)，用磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)洗滌兩次，并在室溫下用aco/meoh(1:1,-20℃)固定10分鐘。用pbs反復(fù)洗滌之后，室溫下避光的條件下，在pbs中用5μg/mlhoechst33342染色細(xì)胞15分鐘。洗滌后，將樣品在具有適合用于hoechst的過(guò)濾器的自動(dòng)顯微鏡(pathway855，bd生物科學(xué))上成像(200倍放大)。制備和分析所有樣品，在兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中一式三份地分析微核形成。3.孢囊菌酰胺c衍生物的合成3.1不同使用的單個(gè)環(huán)的合成這里描述了在合成孢囊菌酰胺c衍生物期間使用的不同單環(huán)的制備。c環(huán)的制備b環(huán)的制備3.2通過(guò)b環(huán)和c環(huán)的偶聯(lián)得到不同的制備好的bc片段3.3.a環(huán)與bc片段(bc1，bc2，bc3)的偶聯(lián)以合成孢囊菌酰胺c衍生物(1s)-(3s)?；衔飏1r2(1s)ohome(2s)oiproipr(3s)omeoh3.4化合物4s的制備3.5.試驗(yàn)3.5.1.常規(guī)實(shí)驗(yàn)信息起始材料和溶劑從供應(yīng)商處市售購(gòu)買(mǎi)，且不進(jìn)行進(jìn)一步純化即被使用。所有化學(xué)產(chǎn)率是指純化的化合物，并沒(méi)有進(jìn)行光學(xué)純化。反應(yīng)過(guò)程通過(guò)tlc硅膠60f254鋁片監(jiān)控，并通過(guò)254nmuv進(jìn)行可視化。使用硅膠(40-63μm)進(jìn)行快速色譜法。制備型rp-hplc在沃特世公司的設(shè)備中進(jìn)行，該設(shè)備包含2767樣品管理器，2545二元梯度模塊，2998pda檢測(cè)器和3100電子噴霧質(zhì)譜儀。使用沃特世xbridge色譜柱(c18,150×19mm，5μm)，二元溶劑系統(tǒng)a和b(a＝具有0.1％甲酸的水；b＝具有0.1％甲酸的mecn)作為洗脫劑進(jìn)行純化，流速為20ml/min，8min時(shí)采用60％-95％b的梯度。熔點(diǎn)在stuartscientific熔點(diǎn)儀smp3(bibbysterilin公司，英國(guó))上測(cè)定，未校正。在300k下，在布魯克drx-500(1h，500mhz；13c，126mhz)或布魯克傅立葉300(1h，300mhz；13c，75mhz)光譜儀上記錄nmr光譜。將化學(xué)位移記錄為δ值，單位ppm，通過(guò)參考氘化溶劑的氫化殘基作為內(nèi)標(biāo)(cdcl3：δ＝7.26,77.02；dmso-d6：δ＝2.50,39.99)。分裂模式描述為表觀(guān)多重性，并被指定為s(單峰)，brs(寬單峰)，d(二重峰)，dd(二重二重峰)，t(三重峰)，q(四重峰)，m(多重峰)。耦合常數(shù)(j)以赫茲(hz)給出。lc/msfinnigansurveyormsqplus(賽默飛世爾科技，德萊艾希，德國(guó))測(cè)量的生物測(cè)定中使用的所有化合物的純度為≥95％。該系統(tǒng)由lc泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，pda檢測(cè)器和單四極桿ms檢測(cè)器，以及用于操作的標(biāo)準(zhǔn)軟件xcalibur組成。使用rpc18nucleodur100-5(125×3mm)色譜柱(macherey-nagelgmbh，dühren，德國(guó))作為固定相，二元溶劑體系a和b(a＝具有0.1％tfa的水；b＝具有0.1％tfa的mecn)用作流動(dòng)相。在梯度運(yùn)行中，b的百分比從0分鐘的0％的初始濃度在15分鐘增加到100％，并保持在100％5分鐘。注射體積為10μl，流速設(shè)置為800μl/min。ms(esi)分析在3800v的噴霧電壓，350℃的毛細(xì)管溫度和10v的源cid下進(jìn)行。在的正模式和254nm下獲得的紫外跟蹤光譜。3.5.2.一般合成程序：a)所述的酸(25mmol)、異丙基溴(52mmol)和碳酸鉀(52mmol)的100mldmf溶液在90℃下加熱過(guò)夜。減壓下去除多余的dmf，剩余的殘留物在水和乙酸乙酯之間分配。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，然后在減壓下除去過(guò)量的溶劑，得到純的產(chǎn)物。b)55℃下，攪拌下向硝基衍生物(10mmol)的etoh(60ml)溶液中加入鐵粉(2.80g,50mmol)和nh4cl(266mg,5mmol)的水(30ml)溶液。將反應(yīng)混合物回流1-2小時(shí)，然后趁熱過(guò)濾鐵，將濾液在真空下濃縮至干。將殘余物用水(30ml)稀釋并用nahco3(飽和水溶液)堿化至ph7-8?；旌衔镉胑toac萃取。合并的有機(jī)相用鹽水洗滌，干燥(mgso4)，真空蒸發(fā)除去溶劑。將得到的粗物質(zhì)物用正己烷研磨，并通過(guò)過(guò)濾收集。f)攪拌下向醛(4mmol)和naoh(0.8g,20mmol)的水(50ml)溶液中分批加入agno3(3.4g,20mmol)。將反應(yīng)物回流過(guò)夜，然后冷卻并通過(guò)硅藻土過(guò)濾。將濾液在冰浴中冷卻，用37％hcl酸化至ph3-4。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀的固體，用冷水洗滌，然后用正己烷洗滌。h)氮?dú)鈿夥障?，攪拌下，向?2mmol)，胺(2.4mmol)的無(wú)水chcl3(50ml)溶液中加入二氯三苯基膦(3.0g,9mmol)。反應(yīng)在80℃下加熱5h。溶劑通過(guò)真空蒸餾除去。殘留物通過(guò)快速色譜純化。i)根據(jù)以下報(bào)道的程序2進(jìn)行氨基化1。煮沸的酸(1mmol)和胺(1mmol)的2.5ml二甲苯溶液用2mpcl3的ch2cl2(0.4mmol)進(jìn)行處理。2小時(shí)候，蒸發(fā)除去多余溶劑，殘留物用柱色譜純化。j)根據(jù)以下報(bào)道的程序1進(jìn)行水解2。酯(0.1mmol)，氫氧化鈉1m(3ml)和無(wú)水甲醇在45℃下加熱過(guò)夜。冷卻過(guò)程中，將反應(yīng)混合物酸化至ph1(3ml，鹽酸1m)并用二氯甲烷(3×150ml)萃取。將有機(jī)層用硫酸鈉干燥，然后在減壓下除去溶劑，得到純的產(chǎn)物。3.5.3.特殊合成程序：2-甲酰基-6-甲氧基苯基乙酸酯攪拌下向3-甲氧基水楊醛的(4.56g，30mmol)和吡啶(2.43ml，30mmol)的dcm(40ml)溶液中滴加加入乙酰氯(2.36g，30mmol)。反應(yīng)在室溫下攪拌過(guò)夜，然后溶劑通過(guò)真空蒸餾除去。將殘余物在冷的稀鹽酸中稀釋。過(guò)濾，用冷水，然后用正己烷洗滌。產(chǎn)率94％(灰白色色固體),m/z(esi+)195[m+h]+。6-甲酰基-2-甲氧基-3-硝基苯基乙酸攪拌下，向冰冷的2-甲?；?6-甲氧基苯基乙酸酯(1.94g，10mmol)和kno3(1.01g,10mmol)在chcl3(15ml)中的懸浮液中加入三氟乙酸酐(12ml)。反應(yīng)物在冰浴中攪拌2h，然后在室溫下過(guò)夜。非常小心地用水(50ml)稀釋反應(yīng)物，并用chcl3萃取。合并的有機(jī)萃取物干燥(mgso4)，真空蒸發(fā)除去溶劑。將殘余物溶于甲苯，并使用快速色譜純化(sio2，正己烷–etoac＝3:1)。產(chǎn)率45％(黃色半固體)，m/z(esi+)239[m]+。2-羥基-3-甲氧基-4-硝基苯甲醛在攪拌下，往6-甲?；?2-甲氧基-3-硝基苯基乙酸(957mg,4mmol)在水(30ml)中的懸濁液中，加入naoh(0.8g,20mmol)。反應(yīng)物回流2h，然后在室溫下攪拌過(guò)夜。將溶液在冰浴中冷卻，并通過(guò)2mhcl酸化至ph3-4。通過(guò)過(guò)濾收集沉淀的固體，用冷水洗滌，然后用正己烷洗滌。產(chǎn)率90％(黃棕色固體),m/z(esi+)197[m]+。2,3-二羥基-4-硝基苯甲醛在冰浴中在0℃冷卻的18(1.2g，5mmol)在dcm(10ml)中的攪拌溶液中，在氮?dú)鈿夥障滦⌒牡丶尤隻br3(1m的dcm溶液，20ml)。將反應(yīng)混合物溫?zé)嶂潦覝?，并進(jìn)一步攪拌過(guò)夜。真空除去溶劑。殘余物用水(50ml)小心稀釋?zhuān)绻枰?，?nhcl將介質(zhì)酸化至ph4-5?；旌衔镉胑toac(3×30ml)萃取。將合并的有機(jī)萃取物用鹽水洗滌，用無(wú)水mgso4干燥，通過(guò)真空蒸餾除去溶劑。將殘余物溶解在chcl3中，并使用快速色譜法(sio2，dcm-meoh＝98:2)純化。3.5.4.衍生物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(1s-4s)4-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)-2-羥基-3-甲氧基苯甲酰氨基)-3-異丙氧基苯甲酸(1s)產(chǎn)率85％；淡黃色晶體；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.79(brs,1h),11.38(brs,1h),10.98(brs,1h),9.22(brs,1h),8.56(d,j＝8.5hz,1h),7.80(d,j＝8.8hz,1h),7.73(d,j＝8.5hz,2h),7.65(d,j＝8.8hz,1h),7.59(dd,j＝8.5,1.6hz,1h),7.57(d,j＝1.6hz,1h),6.69(d,j＝8.5hz,2h),5.39(brs,2h),4.76(septet,j＝6.0hz,1h),3.78(s,3h),1.39(d,j＝6.0hz,6h)；13cnmr(126mhz,dmso-d6)δ166.99,165.03,163.28,151.46,149.53,146.13,139.38,136.34,133.45,129.43,125.62,125.55,122.65,121.21,119.28,115.71,113.89,113.75,113.43,71.72,60.40,21.73；m/z(esi+)479.99[m+h]+；tr＝14.53min。4-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)-2,3-二異丙氧基苯甲酰氨基)-3-異丙氧基苯甲酸(2s)產(chǎn)率81％；米色固體；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.82(brs,1h),10.36(brs,1h),9.06(brs,1h),8.60(d,j＝8.5hz,1h),8.01(d,j＝8.8hz,1h),7.75(d,j＝8.8hz,1h),7.70(d,j＝8.8hz,2h),7.61(dd,j＝8.5,1.9hz,1h),7.58(d,j＝1.9hz,1h),6.63(d,j＝8.8hz,2h),5.90(brs,2h),4.75(septet,j＝6.0hz,1h),4.63(septet,j＝6.3hz,1h),4.52(septet,j＝6.0hz,1h),1.35(d,j＝6.0hz,6h),1.31(d,j＝6.0hz,6h),1.27(d,j＝6.3hz,6h)；13cnmr(126mhz,dmso-d6)δ166.88,164.45,162.79,152.66,148.60,145.71,141.15,137.69,132.89,129.08,125.58,125.44,123.52,122.83,119.87,118.64,117.50,113.94,112.87,77.12,75.70,72.02,22.25,21.90,21.79；m/z(esi+)549.86[m+h]+；tr＝13.10min。4-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)-3-羥基-2-甲氧基苯甲酰氨基)-3-異丙氧基苯甲酸(3s)產(chǎn)率79％；米色固體；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.67(brs,1h),10.90(s,1h),10.12(s,1h),9.73(s,1h),8.65(d,j＝8.4hz,1h),7.80–7.71(m,2h),7.64–7.54(m,4h),6.67–6.59(m,2h),5.95(brs,2h),4.86(septet,j＝6.2hz,1h),3.99(s,3h),1.41(d,j＝6.0hz,6h)；13cnmr(126mhz,dmso-d6)δ166.97,166.24,162.25,152.99,147.98,145.57,141.60,133.01,132.60,129.79,125.45,122.58,121.24,119.02,118.71,118.20,112.99,112.96,112.69,71.00,61.60,21.71.m/z(esi+)480.08[m+h]+；tr＝10.70min。4-(4-(4-氨基苯甲酰氨基)-3-異丙氧基-2-甲氧基苯甲酰氨基)-3-異丙氧基苯甲酸(4s)產(chǎn)率43％；米色固體；1hnmr(500mhz,dmso-d6)δ12.82(brs,1h),10.90(brs,1h),9.09(brs,1h),8.62(d,j＝8.2hz,1h),8.06(d,j＝8.8hz,1h),7.84(d,j＝8.8hz,1h),7.70(d,j＝8.5hz,2h),7.60(dd,j＝8.2,1.6hz,1h),7.58(d,j＝1.6hz,1h),6.63(d,j＝8.5hz,2h),5.92(brs,2h),4.85(septet,j＝6.0hz,1h),4.47(septet,j＝6.0hz,1h),4.04(s,3h),1.40(d,j＝6.0hz,6h),1.32(d,j＝6.0hz,6h)；13cnmr(126mhz,dmso-d6)δ166.96,164.45,161.87,152.74,151.59,145.55,140.72,138.04,133.03,129.11,125.79,125.47,122.67,120.61,119.78,118.58,117.31,113.14,112.87,76.50,71.14,61.78,22.36,21.66；m/z(esi+)522.04[m+h]+；tr＝15.58min。參考文獻(xiàn)：1)alinafomovska，richardd.wood，ernestmui，jitenterp.dubey，leandrar.ferreira，markr.hickman，patriciaj.lee，susane.leed，jenniferm.auschwitz，williamj.welsh，carolinesommerville，stuartwoods，craigroberts和rimamcleod.弓形蟲(chóng)的水楊酰苯胺抑制劑。藥物化學(xué)雜志(salicylanilideinhibitorsoftoxoplasmagondii.j.med.chem.)，2012,55(19)，pp8375-8391.2)valeriaazzarito，panchamiprabhakaran，alicei.bartlett，natashamurphy，michaelej.hardie，colina.kilner，thomasa.edwards，stuartl.werriner，andrewj.wilson.2-o-烷基化對(duì)-苯甲酰胺α-螺旋模擬物：支架曲率的作用。有機(jī)和生物分子化學(xué)(2-o-alkylatedpara-benzamideα-helixmimetics:theroleofscaffoldcurvature.org.biomol.chem.)，2012,10,66469.當(dāng)前第1頁(yè)12