本發(fā)明涉及醫(yī)藥治療領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及新型抗病毒劑及其在治療由病毒感染引起的疾病或病癥中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

本文中對背景技術(shù)的任何引用不應(yīng)被認(rèn)為承認(rèn)這樣的技術(shù)構(gòu)成澳大利亞或其他地方的公知常識。

病毒可引起大范圍的哺乳動物疾病，這代表著社會的巨大開銷。病毒感染的影響可以從常見的流感癥狀到嚴(yán)重的呼吸問題，并且可導(dǎo)致死亡，特別是在社區(qū)的兒童、老人和免疫受損的成員中。

包括a、b和c型流感病毒的正黏病毒科家族以及副粘液病毒科家族的病毒是每年導(dǎo)致大量人類感染的病原物。

以副粘病毒科家族為例，人類副流感病毒1型至3型(hpiv-1，2和3)是嬰兒和幼兒的上呼吸道和下呼吸道疾病的主要原因，并且還影響老年人和免疫受損的人。值得注意的是，據(jù)估計，僅在美國，每年5歲以下兒童就會發(fā)生多達(dá)500萬次下呼吸道感染，并且大約三分之一的病例中hpiv被分離出來。盡管不斷努力，目前仍沒有疫苗或特定的抗病毒療法以分別預(yù)防或治療hpiv感染。最近的一些方法集中于進(jìn)入阻斷和通過小分子觸發(fā)不成熟病毒融合。

副流感病毒與宿主細(xì)胞的初始相互作用是通過其表面糖蛋白，血凝素-神經(jīng)氨酸酶(hn)并涉及含有n-乙酰神經(jīng)氨酸的糖復(fù)合物的識別。副流感病毒hn是不僅在一個蛋白質(zhì)內(nèi)，而且明顯在單一結(jié)合位點包括受體結(jié)合(用于細(xì)胞粘附)和受體破壞(促進(jìn)病毒釋放)的功能的多功能蛋白。此外，hn參與引發(fā)目標(biāo)宿主細(xì)胞感染所必需的病毒表面融合(f)蛋白的激活。因此，血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶的抑制可以為抗病毒藥提供目標(biāo)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了化學(xué)式(i)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，r1選自由cooh或其鹽、c(o)nr9r10、c(o)or11組成的組，其中r9、r10、r11獨立地選自由氫和任選取代的c1-c6烷基組成的組；

r3選自由在一個或兩個環(huán)上碳原子處被取代的n-連接的三唑、任選取代的n-連接的四唑、任選取代的n-連接的吲哚、任選取代的n-連接的異吲哚和任選取代的n-連接的苯并三唑組成的組；

r4是nhc(o)r17，其中r17選自由c1-c6烷基，c1-c6鹵代烷基和c3-c6環(huán)烷基組成的組；

r6、r7和r8獨立地選自由oh、nh2、c1-c6烷基、nr18r18’、c1-c6烷氧基、–oc(o)r18、–nh(c＝o)r18和s(o)nr18組成的組，其中n＝0-2并且每個r18和r18’分別是氫或任選取代的c1-c6烷基。

在第一方面的一個實施方式中，化學(xué)式(i)的化合物是化學(xué)式(ii)的化合物：

其中，r1，r3，r4，r6，r7和r8如上所述。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了包含有效量的第一方面的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽和其藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑和/或賦形劑的藥物組合物。

合適地，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥。

本發(fā)明的第三方面在于一種治療患者中由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥的方法，包括向患者施用有效量的第一方面的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽、或第二方面的藥物組合物的步驟。

本發(fā)明的第四方面提供了用于治療患者中由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥的第一方面的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽或第二方面的藥物組合物。

本發(fā)明的第五方面提供了第一方面的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽在制備用于治療由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥的藥物中的用途。

在第三，第四或第五方面的一個實施方式中，所述疾病、失調(diào)或病癥是流感。

流感可以是a、b或c型流感或副流感。

在一個實施方式中，副流感是hpiv-1，-2或-3病毒。

優(yōu)選地，患者是家畜或牲畜動物或人。

本發(fā)明的第六方面提供了調(diào)節(jié)病毒血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶的活性的方法，包括使酶與第一方面的化合物接觸的步驟。

在以上各個部分中提及的本發(fā)明的各種特征和實施方式加以必要的修改恰當(dāng)?shù)剡m用于其他部分。因此，一個部分中指定的特征可以與其他部分中指定的特征適當(dāng)?shù)亟M合。

從下面的詳細(xì)描述中，本發(fā)明的進(jìn)一步特征和優(yōu)點將變得顯而易見。

附圖說明

為了使本發(fā)明易于理解并產(chǎn)生實踐效果，現(xiàn)在將參照附圖通過示例來描述優(yōu)選的實施方式，其中：

圖1示出了n-乙酰神經(jīng)氨酸(1)，唾液酸梅抑制劑neu5ac2en(2)，4-疊氮基-4-脫氧-neu5ac2en(3)，扎那米韋(4)，neu5ac2en的c-5異丁酰胺類似物(5)，參考hpiv抑制劑bcx2798(6)和新型抑制劑7-10的結(jié)構(gòu)；

圖2是使用豚鼠紅細(xì)胞(gprbc，實心條)和人的紅細(xì)胞(hrbc，虛線條)對抑制劑6和10的hiic50值的比較。

圖3是neu5ac2en的衍生物2、3、5-10的ni(實心)和hi(虛線)ic50值的圖示。具有c5乙酰氨基的抑制劑2、3、7、8(左側(cè)，第1組)和具有c5異丁酰胺基的抑制劑5、6、9、10(右側(cè)，第2組)。數(shù)值是來自三次獨立實驗測定的平均值，誤差條對應(yīng)于計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

圖4a-c是所選擇的抑制劑的ni(實心)和hi(虛線)ic50值的圖示比較。(a)化合物3、6-10及其c-4羥基類似物(2和5)的ni和hiic50值的比較。(b)化合物7-10及其c-4疊氮基類似物(3和6)的ni和hiic50值的比較。(c)化合物6、9和10及其c-5乙酰氨基類似物(分別為3、7和8)的ni和hiic50值的比較；

圖5是(a)在48小時病毒生長抑制測定后子代病毒的滴定(集中形成測定)。子代病毒滴定的代表性結(jié)果。在2μm化合物8、10或6存在下48小時擴(kuò)增后收集病毒。收集的病毒-培養(yǎng)物上清液至少1:1000稀釋，以確保剩余的化合物對病灶形成沒有影響。(b)參考抑制劑6和抑制劑10的病毒生長抑制。通過在2μm抑制劑存在下滴定來自低moi感染的融合llc-mk2單層的子代來測定病毒生長抑制。在該抑制劑濃度下，與6的14％抑制相比，10顯示94％抑制。這些結(jié)果代表兩次重復(fù)進(jìn)行的2次獨立實驗，誤差條對應(yīng)于計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

圖6示出在各種細(xì)胞系中參考抑制劑6(□)和抑制劑10(▲)的病毒生長抑制?；衔?(□)和10(▲)的病毒生長ic50值通過對人細(xì)胞系(a549和nhbe)和猴腎細(xì)胞系(llc-mk2)的原位elisa技術(shù)測定。分別測得6和10的ic50值為54.6±3.8μm和2.1±0.6μm(llc-mk2)；130.6±13.0μm和10.3±0.3μm(a549)；79.3±1.0μm和13.9±0.7μm(nhbe)。這些數(shù)值是從三次重復(fù)進(jìn)行的至少2次獨立實驗中確定的，誤差條對應(yīng)于計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差；

圖7是8與hpiv-3hn復(fù)合物的¹h和stdnmr圖譜。(a)8的¹hnmr圖譜和(b)在20μmhpiv-3hn存在下，蛋白質(zhì)-配體比例為1:100(2mm8)時8的stdnmr圖譜。(c)h7、h8、h9和h9′區(qū)域的¹hnmr圖譜。來自殘留甘油的信號標(biāo)記為★。(d)h7、h8、h9和h9′區(qū)域的stdnmr圖譜。(e)8的推薦結(jié)合表位。

圖8是10與hpiv-3hn復(fù)合物的¹h和stdnmr圖譜和表位圖。(a)10的¹hnmr圖譜。(b)在20μmhpiv-3hn存在下，蛋白質(zhì)-配體比例為1:100(2mm的10)時10的stdnmr圖譜。(c)h7，h8，h9和h9'區(qū)域的¹hnmr圖譜。(d)h7，h8，h9和h9'區(qū)域的stdnmr圖譜。(e)抑制劑10的推薦結(jié)合表位圖；

圖9是10與完整hpiv-3病毒或重組hn的復(fù)合物的stdnmr圖譜比較。(a)在hpiv-3hn存在下10的¹hnmr圖譜，(b)在完整hpiv-3病毒存在下的10的stdnmr圖譜和(c)在hpiv-3hn存在下的10的stdnmr圖譜；

圖10是來自10與完整病毒或重組hn的復(fù)合物的苯基質(zhì)子的疊加。(a)10的¹hnmr圖譜和(b)在hpiv-3病毒(黑色)或重組hpiv-3hn(紅色)存在下10的stdnmr圖譜的疊加；

圖11是針對a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗結(jié)果的圖示；和

圖12表示選擇的氟化和非氟化化合物的neu2抑制測定的結(jié)果。

具體實施方式

本發(fā)明是至少部分地基于以下發(fā)現(xiàn)確定的：某些神經(jīng)氨酸衍生物在由病毒感染引起的疾病的治療中表現(xiàn)出有用的功效。特別地，本發(fā)明的化合物可用于抑制副流感血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶。

術(shù)語

在本專利說明書中，術(shù)語“包括”或類似術(shù)語旨在表示非排他性包含，使得包括所列元素的方法或組合物不僅包括那些元素，而且當(dāng)然可以包括未列出的其他元素。

除非另有定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的通常理解相同的含義。

如本文所用，“有效量”是指相關(guān)活性藥劑的施用量足以防止所治療的病癥的癥狀發(fā)生，或使得癥狀惡化停止或治療并減輕或至少降低癥狀的嚴(yán)重性。有效量將以本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的方式隨患者年齡、性別、體重等變化。適當(dāng)?shù)膭┝炕騽┝糠桨缚梢酝ㄟ^常規(guī)試驗來確定。

本文所用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的鹽”是指對全身或局部給藥毒理學(xué)安全的鹽，例如由藥學(xué)上可接受的無毒性的堿或酸(包括無機(jī)或有機(jī)堿和無機(jī)或有機(jī)酸)制備的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽可以選自下組：堿金屬和堿土金屬鹽，銨鹽，鋁鹽，鐵鹽，胺鹽，葡萄糖胺鹽，氯鹽，硫酸鹽，磺酸鹽，硫酸氫鹽，硝酸鹽，檸檬酸鹽，酒石酸鹽，酒石酸氫鹽，磷酸鹽，碳酸鹽，碳酸氫鹽，蘋果酸鹽，馬來酸鹽，萘磺酸鹽，富馬酸鹽，琥珀酸鹽，乙酸鹽，苯甲酸鹽，對苯二甲酸鹽，雙羥奈酸鹽，哌嗪，果膠酸鹽和s-甲基甲硫氨酸鹽等。

在本文使用的術(shù)語“取代的”和“任選取代的”，在其每次出現(xiàn)和在沒有明確列出任何特定部分的情況下，是指相關(guān)部分的取代，比如烷基鏈或環(huán)結(jié)構(gòu)，其中一個或多個基團(tuán)選自c1-c6烷基、c1-c6鹵烷基、c1-c6烷氧基、cn、oh、含氧基、nh2、cl、f、br、i、芳基和雜環(huán)基，后兩者其自身是任選取代的。當(dāng)在所列舉多個官能團(tuán)之前使用該術(shù)語時，除非另有說明，否則其旨在應(yīng)用于所有列出的官能團(tuán)。比如，“任選取代的氨基、雜環(huán)基、芳基”是指所有的氨基、雜環(huán)基、芳基是可被任選取代的。

術(shù)語“烷基”是指直鏈或支鏈烷基取代基，含有例如1至約12個碳原子，優(yōu)選1至約8個碳原子，更優(yōu)選1至約6個碳原子，甚至更優(yōu)選1至約4個碳原子，還更優(yōu)選1至2個碳原子。這些取代基的實例包括甲基，乙基，丙基，異丙基，正丁基，仲丁基，異丁基，叔丁基，戊基，異戊基，2-甲基丁基，3-甲基丁基，己基，庚基，2-甲基戊基，3-甲基戊基，4-甲基戊基，2-乙基丁基，3-乙基丁基，辛基，壬基，癸基，十一烷基，十二烷基等。所涉及的碳數(shù)涉及碳主鏈和碳支鏈，但不包括屬于任何取代基的碳原子，例如主碳鏈分支的烷氧基取代基的碳原子。

術(shù)語“環(huán)烷基”是指任選取代的飽和單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)碳基團(tuán)。在適當(dāng)?shù)那闆r下，環(huán)烷基可以具有指定數(shù)目的碳原子，例如，c3-c6環(huán)烷基是具有3，4，5或6個碳原子的碳環(huán)基團(tuán)。非限制性的實例可包括環(huán)丙基，環(huán)丁基，環(huán)戊基，環(huán)戊烯基，環(huán)己基，環(huán)己烯基，環(huán)己二烯基等。

術(shù)語“芳基”是指本領(lǐng)域中通常理解的未取代的或取代的芳族碳環(huán)取代基。應(yīng)當(dāng)理解的是，根據(jù)休克爾(hückel)規(guī)則，術(shù)語芳基適用于平面的且包括4n+2π個電子的環(huán)狀取代基。優(yōu)選c-6芳基。

本文使用的具體涉及某些‘r’基團(tuán)的術(shù)語“雜環(huán)”和“雜環(huán)基”是指在環(huán)中具有5至7個原子的非芳族環(huán)，并且其中1至4個原子是雜原子，所述環(huán)是單獨的或稠合到第二環(huán)上，其中所述雜原子獨立地選自o，n和s。雜環(huán)包括部分飽和和全飽和的雜環(huán)基團(tuán)。雜環(huán)體系可以通過該基團(tuán)的任何數(shù)目的碳原子或雜原子連接到其他部分，并且可以是飽和的和不飽和的。雜環(huán)的非限制性實例可選自吡唑，咪唑，吲哚，異吲哚，三唑，苯并三唑，四唑，嘧啶，吡啶，吡嗪，二嗪，三嗪，四嗪，吡咯烷基，吡咯啉基，吡喃基，哌啶基，哌嗪基，嗎啉基，四氫呋喃基，四氫噻吩基，吡唑啉基，二巰基，氧硫基，二惡烷基，二惡英基，氧氮芑基，氮雜環(huán)庚三烯基，二氮雜環(huán)庚三烯基，硫氮雜環(huán)庚三烯基，氧雜環(huán)庚三烯基和thiapinyl，咪唑啉基，硫代嗎啉基等。

術(shù)語“被保護(hù)的oh”或“被保護(hù)的羥基”是指羥基被常用的保護(hù)基保護(hù)以形成醚或芳基，例如芐基，形成醚或c1-c4酯，所述保護(hù)基例如?；?，醚基或酯基，包括c1-c3酰基，c1-c4烷基。

本文關(guān)于第一方面的化合物(包括化學(xué)式(i)和(ii)的化合物)使用的術(shù)語“n-連接的”，例如“n-連接的三唑”或“n-連接的雜環(huán)”，是指在神經(jīng)氨酸核心(化學(xué)式(i)和(ii)中的r3)的c-4位連接的部分，并限定連接涉及碳環(huán)和氮原子之間的直接連接。優(yōu)選地，其是指經(jīng)由氮原子連接到神經(jīng)氨酸核心的r3部分，氮原子本身形成適當(dāng)雜環(huán)的一部分，例如三唑環(huán)，四唑，吲哚等的一個氮原子。對于化學(xué)式(iii)和(iiia)中“二氟”化合物，術(shù)語n-連接是指通過中間氮原子或者在雜環(huán)部分的情況下通過形成雜環(huán)本身一部分的氮原子(例如三唑環(huán)的一個氮)與核心連接的r3部分。

當(dāng)指定結(jié)構(gòu)中原子數(shù)目的范圍(例如，c1-c12，c1-c10，c1-c9，c1-c6，c1-c4，烷基等)時，特別預(yù)期落在所示范圍內(nèi)的任何子范圍或單個數(shù)量的碳原子也可以使用。因此，例如，相對于本文所用的任何化學(xué)基團(tuán)(例如，烷基等)所使用的1-12個碳原子(例如c1-c12)，1-9個碳原子(例如c1-c9)，1-6個碳原子(例如c1-c6)，1-4個碳原子(例如c1-c4)，1-3個碳原子(例如c1-c3)或2-8個碳原子(例如c2-c8)的范圍的列舉視情況而定包括并具體描述1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11和/或12個碳原子以及其任何子范圍：根據(jù)需要，例如，1-2個碳原子，1-3個碳原子，1-4個碳原子，1-5個碳原子，1-6個碳原子，1-7個碳原子，1-8個碳原子，1-9個碳原子，1-10個碳原子，1-11個碳原子，1-12個碳原子，2-3個碳原子，2-4個碳原子，2-5個碳原子，2-6個碳原子，2-7個碳原子，2-8個碳原子，2-9個碳原子，2-10個碳原子，2-11個碳原子，2-12個碳原子，3-4個碳原子，3-5個碳原子，3-6個碳原子，3-7個碳原子，3-8個碳原子，3-9個碳原子，3-10個碳原子，3-11個碳原子，3-12個碳原子，4-5個碳原子，4-6個碳原子，4-7個碳原子，4-8個碳原子，4-9個碳原子，4-10個碳原子，4-11個碳原子和/或4-12個碳原子等。

如本文所用，術(shù)語“受試者”或“個體”或“患者”可以指需要治療的任何受試者，特別是脊椎動物受試者，甚至更特別是哺乳動物受試者。合適的脊椎動物包括但不限于靈長類動物，鳥類，家畜動物(例如，綿羊，牛，馬，驢，豬)，實驗室試驗動物(例如兔，小鼠，大鼠，豚鼠，倉鼠)，伴侶動物(例如貓，狗)和捕獲的野生動物(例如，狐貍，鹿，野狗)。優(yōu)選的受試者是需要治療由病毒感染引起的疾病或病癥的人。然而，應(yīng)當(dāng)理解的是，上述術(shù)語并不暗示癥狀必定存在。

根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了化學(xué)式(i)的化合物，或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，r1選自由cooh或其鹽、c(o)nr9r10、c(o)or11組成的組，其中r9、r10、r11獨立地選自由氫和任選取代的c1-c6烷基組成的組；

r3選自由在一個或兩個環(huán)上碳原子處被取代的n-連接的三唑、任選取代的n-連接的四唑、任選取代的n-連接的吲哚、任選取代的n-連接的異吲哚和任選取代的n-連接的苯并三唑組成的組；

r4是nhc(o)r17，其中r17選自由c1-c6烷基，c1-c6鹵代烷基和c3-c6環(huán)烷基組成的組；

r6、r7和r8獨立地選自由oh、nh2、c1-c6烷基、nr18r18’、c1-c6烷氧基、–oc(o)r18、–nh(c＝o)r18和s(o)nr18組成的組，其中n＝0-2，并且每個r18和r18’獨立地是氫或任選取代的c1-c6烷基。

在第一方面的一個實施方式中，化學(xué)式(i)的化合物是化學(xué)式(ii)的化合物：

其中，r1，r3，r4，r6，r7和r8為之前所描述的。

優(yōu)選地，三唑是在n-1位置直接與神經(jīng)氨酸環(huán)上碳連接的1,2,3-三唑環(huán)。

在一個四唑被取代的實施方式中，其僅在環(huán)碳上被取代。

在化學(xué)式(i)或(ii)的一個實施方式中，r1是cooh或其鹽，或c(o)or11，其中r11選自甲基，乙基和丙基。

在某個特定的實施方式中r1選自由cooh、coona和c(o)ome構(gòu)成的組。

在化學(xué)式(i)或(ii)的化合物的一個實施方式中，r3選自以下基團(tuán)組成的組：

其中，r20和r21獨立地選自由氫、羥基、氰基、鹵素、c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基醚、任選取代的吡啶基和任選取代的苯基組成的組，其中r20和r21至少一個不是氫；

r22選自由氫，c1-c6烷基和任選取代的苯基組成的組；和

r23和r24獨立地選自由氫、羥基、氰基、鹵素、c1-c6烷基和c1-c6鹵代烷基組成的組。

在某些優(yōu)選的實施方式中，r20和r21選自c1-c6烷基、c1-c6羥基烷基、c1-c6烷氧基、任選取代的吡啶基和任選取代的苯基。

在一個實施方式中，其中當(dāng)r20，r21或r22視情況而定是任選取代的吡啶基或任選取代的苯基時，取代基可具有選自由c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烷基羥基、c1-c6烷氧基、鹵素、-c(o)ome和–ch2och3組成的組的一部分。

在某些實施方式中，r3可選自包含以下基團(tuán)的組：

以上列出的各具體部分可與本文所描述的r1，r4，r6，r7或r8基團(tuán)的任何公開內(nèi)容組合。

在上述任一實施方式中，r4可選自由以下基團(tuán)組成的組：

在某些實施方式中，r4選自由–nhac、-nhc(o)ch2(ch3)2、-nhc(o)cf3和–nhc(o)ch2ch3組成的組。

在化學(xué)式(i)和(ii)的化合物的任一實施方式中，r6、r7和r8可獨立地選自由oh、c1-c3烷氧基和–oc(o)r18組成的組，其中r18是任選取代的c1-c3烷基。

在任一個或多個前述實施方式中，r6、r7和r8可分別選自oh和oac。

在化學(xué)式(i)和(ii)的實施方式中，化合物可選自以下物質(zhì)組成的組：

及其所有c-2類似物，其中c-2羧基是質(zhì)子化的形式、鈉鹽形式或c1-c3酯前藥形式，并且其中每種化合物可以被認(rèn)為具有與所公開的相近類似物，其中r4位置可明確地被任何–nhc(o)r基團(tuán)取代，其中r是c1-c4烷基或鹵代烷基。

合成化學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，cooh基團(tuán)容易與鹽形式或如甲酯基團(tuán)的酯保護(hù)基互換，因此，關(guān)于上文中列出的化合物，其所有類似形式被認(rèn)為在本文公開。

在其中r4是nhac且r3是取代的三唑的化學(xué)式(i)和(ii)的一個具體實施方式中，三唑不被羧基基團(tuán)取代。

在其中r4是nhac且r3是只在三唑環(huán)的4-位取代的三唑(1-位是與神經(jīng)氨酸核心相連的環(huán)氮)的化學(xué)式(i)和(ii)的另一個具體實施方式中，三唑不被丙基、取代的丙基、取代的叔丁基或二乙氧基烷基取代。

在一個實施方式中，第一方面的化合物是血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶調(diào)節(jié)劑。優(yōu)選血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑。

在一個實施方式中，優(yōu)選血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑是流感或副流感血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶抑制劑。

在一個替代方面，本文稱為“二氟”的方面，本發(fā)明涉及化學(xué)式(iii)和(iiia)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽：

其中，r1選自由cooh或其鹽、c(o)nr9r10、c(o)or11、p(o)(oh)2和p(o)(or11)2組成的組；

r1a和r2是氟；

r3選自由任選取代的n-連接的雜環(huán)、-nhc(o)nhr12、-nhc(o)r13和-nhs(o)2r14組成的組；

r4選自由nr15r16和nhc(o)r17組成的組；

r6、r7和r8獨立地選自由oh、nh2、c1-c6烷基、nr18r18’、c1-c6烷氧基、–oc(o)r18、–nh(c＝o)r18和s(o)nr18組成的組，其中n＝0-2，并且每個r18和r18’獨立地是氫或任選取代的c1-c6烷基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r1選自由cooh或其鹽和coor11組成的組，其中r11是任選取代的c1-c6烷基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r1選自甲基、乙基、丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基和戊基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r12、r13和r14獨立地選自由任選取代的芐基和苯基組成的組。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r3選自由吡唑，咪唑，吲哚，異吲哚，三唑，苯并三唑，四唑，嘧啶，吡啶，吡嗪，二嗪，三嗪和四嗪組成的組，它們都可以任選被取代，并且通過環(huán)氮與核心連接。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r3選自包含以下物質(zhì)的組：

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r4選自由nr15r16和nhc(o)r17組成的組，其中r15、r16和r17分別選自由任選取代的c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基、c1-c6烯基和c3-c6環(huán)烷基組成的組。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r4是nhc(o)r17，其中r17選自由任選取代的c1-c6烷基、c1-c6鹵代烷基和c3-c6環(huán)烷基組成的組。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r4選自包含以下物質(zhì)的組：

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r4選自–nhc(o)-甲基、–nhc(o)-乙基、–nhc(o)-丙基、–nhc(o)-異丙基、–nhc(o)-正丁基、–nhc(o)-仲丁基、–nhc(o)-異丁基、–nhc(o)-叔丁基、和–nhc(o)-戊基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r5為可被任選取代的c1-c6烷基或c1-c6烯基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r5是被羥基或受保護(hù)羥基取代的c1-c6烷基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r6、r7和r8獨立地選自oh、c1-c10烷氧基和–oc(o)r18，其中r18為c1-c10烷基。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的一個實施方式中，r6、r7和r8獨立地選自oh和oac。

在二氟方面的一個實施方式中，化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的化合物或其藥學(xué)上可接受的鹽選自以下物質(zhì)組成的組：

其中每個cooh的影響都可以被認(rèn)為可與coona互換，反之亦然。

在化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)的任一上述實施方式中，r3不是n-連接的芳基，即通過中間n原子連接到核心的芳環(huán)。

假設(shè)如化學(xué)式(iii)和化學(xué)式(iiia)所表示的化合物對流感株是特別有效的，其中有c-2和c-3氟取代模式。雖然不希望受到任何特定理論的束縛，但由于類似化合物是病毒神經(jīng)氨酸酶的有效抑制劑，可以相信它們是活性的。

本發(fā)明的化合物可以通過許多種合成途徑來獲得。以下方案1示出了合成某些已知的神經(jīng)氨酸酶抑制劑以用作參考化合物的一種途徑。也可以用于合成第一方面的化合物的相關(guān)的合成工藝由carbohydr.res.244,181-185(1993)；carbohydr.res.342,1636-1650(2007)；bioorg.med.chem.lett.16,5009-5013(2006)；和pct申請wo2002076971公開。

方案1：i)(boc)2o,dmap,thf,60℃,o/n,(18,71％；19,96％)(ii)naoch3/ch3oh,rt,1h；(iii)ac2o,吡啶,rt,o/n,(20,81％；21,63％超過2個步驟)(iv)tfa,dcm,rt,o/n,(22,90％；23,85％)(v)異丁酰氯,et3n,dcm,rt,4h,(24,84％；12,91％)(vi)naoh,meoh/h2o(1:1),rt,o/n,(5,94％；6,82％).

下述方案2示出了作為第一方面的優(yōu)選化合物的化合物7-10的合成路線。

方案2:(i)cuso4,抗壞血酸鈉,叔丁醇/h2o(1:1),45℃,6h(13,78％；14,82％；15,71％；16,84％)；(ii)naoh,meoh/h2o(1:1),rt,o/n(7,85％；8,96％；9,92％；10,89％).

簡而言之，使用基于已知的基于4-疊氮基-4-脫氧-neu5ac2en的中間體11和12實現(xiàn)三唑7-10的合成。將兩種中間體的任一種在典型的點擊疊氮-炔耦合條件下(在水和叔丁醇(1:1)的混合物中加熱4-疊氮基-4-脫氧-neu5ac2en衍生物、炔烴、cuso4和抗壞血酸鈉的混合物6小時)暴露于甲基炔丙基醚或乙炔苯以得到三唑衍生物(圖1)。分離三唑13和14(從11開始)和三唑衍生物15和16(從12開始)，產(chǎn)率分別為78％，82％，71％和84％。通過用在室溫條件下調(diào)節(jié)ph為13-14的甲醇溶液(50％)處理24h，將所得到的全-o-乙?；蜓苌?3-16脫保護(hù)，以得到作為鈉鹽的最終產(chǎn)品7-10，產(chǎn)率分別為85％，96％，92％和89％。

合成的靶標(biāo)部分地由從hpiv-3hn晶體結(jié)構(gòu)的分子模擬收集的信息驅(qū)動。特別地，hpiv-3hn的216環(huán)顯示出顯著的柔性，因此假定具有稍大體積的c4取代基的neu5ac2en衍生物可以容納到在活性位點內(nèi)的216腔中并鎖開(lockopen)。使用分子動力學(xué)(md)模擬來設(shè)計和評估結(jié)合c4官能化三唑的neu5ac2en衍生物，作為測試該理論的基礎(chǔ)。從216環(huán)柔性和所得的216空腔尺寸的初始研究，認(rèn)為在不飽和的基于神經(jīng)氨酸的模板(圖1中所示的化合物7-10)上的相對大體積的c4取代基可以在開放的216空腔內(nèi)良好地耐受。此外，對與hpiv-3hn復(fù)合的c4三唑取代的抑制劑的模擬表明模板上c5處的乙酰氨基(7，8)和異丁酰氨基(9，10)部分也可以同時良好地容納在c5結(jié)合域內(nèi)。使用md模擬，評估了更大體積的三唑化合物(8和10)有效地鎖開hpiv-3hn中的216環(huán)的能力。測定與hpiv-3hn復(fù)合的8和10的相對相互作用能，以預(yù)測是否可預(yù)期與大體積c4取代基組合的更大體積的c5酰氨基部分可改善抑制劑親和。

模擬和生物學(xué)評價的方法在實驗部分中詳細(xì)討論，但簡要地得到了關(guān)于c4/c5取代基對抑制劑效力影響的許多結(jié)論。在兩個篩選組(組1(c5乙酰胺基)和組2(c5異丁酰胺基))的每一組內(nèi)，基于c4處取代基的效力順序為：羥基<疊氮基≤4-甲氧基甲基三唑<4-苯基三唑。觀察到兩組中最弱的抑制為4-羥基衍生物2和5。這樣的結(jié)果支持以下觀念，即容納neu5ac2en(2)上的c4羥基的c4結(jié)合域具有顯著的疏水特性，因此不利于與包括羥基的極性親水基團(tuán)的相互作用。袋的疏水性質(zhì)與由216環(huán)開口產(chǎn)生的216腔的大尺寸結(jié)合，有利于抑制劑，所述抑制劑包括抑制劑8和10，其具有用大體積疏水取代基取代的c4羥基。

兩組的ic50值的比較顯示，在所有制備的抑制劑中用異丁酰胺基代替c5乙酰氨基導(dǎo)致總體增強的效力。除了最有效的抑制劑10之外，通常觀察到接近一個數(shù)量級的改善。此外，ic50值的分析支持了下列觀念：最佳抑制劑8和10的效力增強主要由于引入c4取代基，引入c5取代基貢獻(xiàn)的程度小得多。該觀念還通過stdnmr數(shù)據(jù)分析證實，其得到抑制劑10的表位圖，其中4-苯基三唑部分的質(zhì)子對與hpiv-3hn復(fù)合的10的結(jié)合事件顯示出最強的貢獻(xiàn)，而異丁酰胺基觀察到的相對相互作用較少(～50％)。

抑制劑10對hn功能(ni和hi)的有效抑制證明該化合物通過作用于病毒的關(guān)鍵hn蛋白發(fā)揮其針對hpiv-3的抗病毒效果。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步得到與完整病毒或重組hn蛋白復(fù)合的10的stdnmr實驗的支持，其清楚地示出抑制劑的c4三唑芳族部分一致的stdnmr信號強度。此外，與hpiv-3hn復(fù)合的10的計算結(jié)合表位與清晰預(yù)測neu5ac2en衍生物的h3和c4三唑部分的苯基質(zhì)子與蛋白質(zhì)表面緊密接觸的md模擬非常一致。

此外，原位elisa結(jié)果與ni和hi測定數(shù)據(jù)非常一致。基于llc-mk2細(xì)胞的測定表明，與基于ni和hi蛋白的測定相比，10在細(xì)胞水平上甚至更有效。在這種基于細(xì)胞的測定中，發(fā)現(xiàn)10比6的效力強約26倍，而在ni和hi測定中，蛋白質(zhì)抑制測定分別僅顯示約8和11倍的改善。這強有力地表明10是一種有效的雙重作用抑制劑，來自對蛋白的神經(jīng)氨酸酶和血凝素活性兩者抑制的有效協(xié)同作用。這與已知的抑制劑6形成對比，由于已知的抑制劑6對血凝素活性的顯著較差的抑制，其導(dǎo)致較少的協(xié)同效應(yīng)。最后，與6相比，抑制劑10對兩種人類細(xì)胞系中病毒生長抑制的程度清楚地證明了設(shè)計者配體10的優(yōu)越性。

應(yīng)當(dāng)理解的是，第一方面的化合物具有對hpiv-3hn之外更多病毒的功效。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如實驗部分所示，化合物結(jié)構(gòu)的變化通?？梢哉{(diào)整對不同hpiv或流感神經(jīng)氨酸酶的活性。例如，本文公開的二氟衍生物可優(yōu)選對某些流感神經(jīng)氨酸酶有活性。

特別地，結(jié)果表明，不僅化合物10在抑制測定(比較它們抑制hpiv-3病毒感染和在llc-mk2細(xì)胞中繁殖的能力，分別減少94％對14％)中是比現(xiàn)有技術(shù)化合物bcx-2798(參考化合物6)好得多的抑制劑，第一方面的其他化合物已經(jīng)顯示具有比10或6甚至更大的效力。例如，本發(fā)明人已經(jīng)設(shè)計，合成和生物學(xué)評價化合物ie1398-33和ie927-99。這些化合物對hpiv-3hn的ic50值分別為1.97微摩爾和0.27微摩爾。這表示相對于現(xiàn)有技術(shù)的參考化合物bcx-2798的1至2個數(shù)量級的改善。這些結(jié)果證明了本發(fā)明化合物的令人驚訝的功效水平，并因此證明了本結(jié)構(gòu)導(dǎo)向的抑制劑設(shè)計的價值。

根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，其包含有效量的化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物或其藥學(xué)上可接受，和藥學(xué)上可接受的載體，稀釋劑和/或賦形劑。

適當(dāng)?shù)?，所述藥物組合物用于治療或預(yù)防由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥。

所述藥物組合物可包括多于一種的化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物。當(dāng)組合物包括多于一種化合物時，幾種化合物可以是任意比例。組合物可進(jìn)一步包括已知的助活性劑、傳送載體或佐劑。

化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物以足以抑制或改善作為治療對象的疾病、失調(diào)或病癥的量存在于藥物組合物中?；衔锖秃兴鼈兊乃幬锝M合物的合適劑型和比率可由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地確定。

劑型可包括片劑，分散劑，懸浮劑，注射劑，溶液，糖漿，含片，膠囊等。這些劑型還可包括專門設(shè)計或修改以確保在結(jié)締組織退化部位放置的注射或植入裝置。水凝膠是優(yōu)選的遞送形式。

本發(fā)明的第三方面在于治療患者由病毒感染引起的疾病，失調(diào)或病癥的方法，包括給患者施用有效量的化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽或第二方面的藥物組合物的步驟。

本發(fā)明的第四方面提供了化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽或第二方面的藥物組合物，其用于治療患者中由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥。

本發(fā)明的第五方面提供了化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物或其藥學(xué)上有效的鹽在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療由病毒感染引起的疾病、失調(diào)或病癥。

在第三，第四或第五方面的一個實施方式中，所述疾病、失調(diào)或病癥是由流感或副流感病毒引起的感染。

感染可以由流感病毒a、b或c或副流感病毒引起。

在一個實施方式中，副流感病毒是hpiv-1，2，3或4病毒。

優(yōu)選地，患者是家畜或牲畜動物或人。

本發(fā)明的第六方面提供了調(diào)節(jié)病毒血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶的活性的方法，包括使酶與化學(xué)式(i)、(ii)、(iii)或(iiia)的化合物接觸的步驟。

優(yōu)選地，調(diào)節(jié)包括抑制病毒血凝素和/或神經(jīng)氨酸酶。

以下實驗部分更詳細(xì)地描述了本發(fā)明的某些化合物的表征及其抗病毒活性。目的是說明本發(fā)明化合物的某些具體實施方式及其功效，而不以任何方式限制本發(fā)明。

實驗

計算化學(xué)

使用力場參數(shù)集54a4(參考39)用gromos軟件進(jìn)行分子動力學(xué)模擬。初始坐標(biāo)取自與4復(fù)合的hpiv-3hn的x射線結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1v3e)(圖1)。將化合物8與晶體結(jié)構(gòu)的扎那米韋(4)環(huán)原子疊加。8的參數(shù)以與gromos力場中的現(xiàn)有參數(shù)類似的方式生成。在1v3e-4和iv3e-8的最終復(fù)合體系中的原子數(shù)分別為78253和78084。氨基酸殘基的離子化狀態(tài)被指定為ph7.0。組氨酸側(cè)鏈在nε-原子處被質(zhì)子化。與x射線結(jié)構(gòu)相關(guān)的水分子被去除，并且使用簡單點電荷(spc)水模型和周期性邊界條件通過明確的溶劑化替代，與在先公開的方法一致。在模擬中，在截斷的八面體內(nèi)的蛋白周圍添加水分子，蛋白原子和周期性盒的正方形壁之間具有1.4nm的最小距離。使用shake算法用10^-4的幾何公差約束所有鍵。

進(jìn)行系統(tǒng)的最速下降能量最小化以緩和溶質(zhì)-溶劑接觸，同時使用具有2.5×10⁴kjmol^-1nm^-2的力常數(shù)的諧交互作用在位置上限制溶質(zhì)原子。接下來，進(jìn)行沒有任何約束的系統(tǒng)的最速下降能量最小化以消除任何殘余應(yīng)變。當(dāng)每步的能量變化小于0.1kjmol^-1時，終止能量最小化。對于非鍵合相互作用，使用具有0.8/1.4nm的截止半徑的三倍距離方法?；陔姾?基團(tuán)對列表，在每個時間步長評估短距離范德華和靜電相互作用。每五個時間步長，評估距離大于0.8nm且小于1.4nm的(電荷基團(tuán))對之間的中等距離范德華和靜電相互作用，在該點更新對列表。在較長截止半徑之外，使用具有78.5的相對介電常數(shù)的反應(yīng)場近似。每1000個時間步長移除整個系統(tǒng)的質(zhì)量運動的中心。溶劑和溶質(zhì)分別弱耦合到295k的溫度浴中，弛豫時間為0.1ps。

體系也弱耦合到1atm的壓力浴中，弛豫時間為0.5ps，等溫壓縮率為0.7513x10^-3(kjmol^-1nm^-3)^-1。進(jìn)行20ps周期的md模擬以進(jìn)一步分別在50k，120k，180k，240k和300k平衡體系，其中溶質(zhì)原子諧波位置約束，力常數(shù)為2.5x10⁴kjmol^-1nm^-2，2.5x10³kjmol^-1nm^-2，2.5x10²kjmol^-1nm^-2，2.5x10¹kjmol^-1nm^-2。模擬各進(jìn)行30ns。每0.5ps保存軌跡坐標(biāo)和能量用于分析。以與上述類似的方式產(chǎn)生與4復(fù)合的hpiv-3hn的模擬軌跡，其用于分析和比較與8復(fù)合的hpiv-3hn所獲得的結(jié)果。

用分析軟件gromos++進(jìn)行分析。使用給定的原子集(n，cα，c)通過在第二(參考結(jié)構(gòu))結(jié)構(gòu)上進(jìn)行一個結(jié)構(gòu)的旋轉(zhuǎn)和平移原子位置最小二乘法擬合，計算包括216-環(huán)的殘基(殘基210-221)的結(jié)構(gòu)之間的原子位置均方根差(rmsd)。通過在參考上執(zhí)行軌跡結(jié)構(gòu)的cα原子的旋轉(zhuǎn)和平移原子位置最小二乘法擬合，從30ns模擬周期計算原子位置均方根波動(rmsf)作為平均值。計算包括216-環(huán)的所有殘基(殘基210-221)的rmsf。為了獲得用于模擬的減少的代表性的結(jié)構(gòu)集合，進(jìn)行基于rmsd的構(gòu)象聚集。

從模擬中每10ps提取的結(jié)構(gòu)疊加在主鏈-cα原子上以去除總體旋轉(zhuǎn)和平移。聚集在結(jié)合位點排列的殘基的所有原子(殘基190-198，210-221，251-259，274-280，320-326，334-339，369-377，407-413，474-480，529-533)，以比較來自不同模擬軌跡的hpiv-3hn蛋白的相對結(jié)構(gòu)群體。所使用的相似性標(biāo)準(zhǔn)是這些殘基的所有原子的rmsd，截止值為0.13nm。提取從30ns的md模擬得到的最終結(jié)構(gòu)。使用gromos產(chǎn)生的能量、自由能λ-衍生物和塊均值作為單獨的軌跡文件(稱為能量軌跡)計算hpiv-3hn與抑制劑8和10之間的相互作用能。程序ene_ana用于從這些文件中提取單個相互作用能量值，例如非鍵合貢獻(xiàn)，即范德華力和庫侖相互作用。因此，配體和蛋白質(zhì)之間的這些貢獻(xiàn)從由模擬產(chǎn)生的能量軌跡和計算的相互作用能中提取。從生長尺寸的塊均值外推到無限塊尺寸來計算誤差估計值。分析疏水相互作用，并使用ligplot產(chǎn)生抑制劑10和hpiv-3hn之間的相互作用圖。為了測量所選結(jié)構(gòu)的腔開口的程度，使用povme分析袋體積。重要的是，最多80ns的延長的模擬時間提供的結(jié)果完全符合呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)。

作為具有大體積的c4取代基的基于neu5ac2en的hpiv-3hn抑制劑的模型的化合物8

與8復(fù)合的可用hpiv-3hn晶體結(jié)構(gòu)(pdb登錄號1v3e)的模擬允許分析蛋白質(zhì)相對于扎那米韋(4)結(jié)合結(jié)構(gòu)的動力學(xué)行為。來自hpiv-3hn-4和-8復(fù)合物的模擬的216-環(huán)的hpiv-3hn主鏈原子(cα，n，c)的原子位置均方根偏差(rmsd)顯示216-環(huán)在hpiv-3hn-8復(fù)合物的情況下經(jīng)歷與晶體結(jié)構(gòu)的更顯著的偏差。對于hpiv-3hn-8復(fù)合物的模擬，觀察到大于0.5nm的rmsd值，而hpiv-3hn-4復(fù)合物的結(jié)構(gòu)偏差較小(0.4nm)。這一觀念進(jìn)一步由觀察到的與216-環(huán)相關(guān)的殘基(殘基205-225)的主鏈的cα原子的均方根波動(rmsf)支持。對于216-環(huán)的另一半的殘基(215-220)觀察到增加的rms波動，其值達(dá)到～0.3nm，表明與起始hpiv-3hn參考的x-射線結(jié)構(gòu)相比(pdb登錄號iv3e)，在域內(nèi)大量構(gòu)象重排。表1示出了選擇的包含在216-環(huán)中殘基的rmsf值。

表1：與參考x-射線結(jié)構(gòu)iv3e對比的1v3e–4和1v3e–8模擬體系中包含在216-環(huán)中的選擇的殘基的均方根波動(rmsf)，單位納米。

數(shù)據(jù)表明，在生理模擬條件下存在的環(huán)的柔性在晶體結(jié)構(gòu)中被顯著低估，并提供了發(fā)現(xiàn)抗副流感病毒藥物的機(jī)會。hpiv-3hn-4復(fù)合物和hpiv-3hn-8復(fù)合物模擬的比較證明8上的c4取代基誘導(dǎo)hpiv-3hn216-環(huán)中的顯著運動。誘導(dǎo)的開環(huán)可以從由hpiv-3hn-4復(fù)合物和8的10ns模擬獲得的最終結(jié)構(gòu)的溶劑可進(jìn)入的表面圖中看出。

鑒定了來自與4和8復(fù)合的hpiv-3hn的md模擬的最密集的構(gòu)象群，并且產(chǎn)生來自與4和8復(fù)合的hpiv-3hn的模擬的最終構(gòu)象的疊加。可以清楚地看到216-環(huán)構(gòu)象的差異。當(dāng)與更空間阻塞的抑制劑8復(fù)合時，216-環(huán)腔采用更開放的構(gòu)象。通常，對hpiv-3hn-8復(fù)合物的模擬觀察到更大的腔。與模擬的hpiv-3-8復(fù)合物的腔體積相比，來自hpiv-3hn-4復(fù)合物的模擬的最密集的群具有略小的腔體積

進(jìn)行與hpiv-3hn復(fù)合的10的相同分析，以評價在c4官能化的三唑的存在下是否能容納較大體積的c5酰胺基部分。該分析表明，在c4官能化的三唑存在下，c5異丁酰胺基部分良好地容納在c5結(jié)合域內(nèi)。

與hpiv-3hn復(fù)合的8和10相關(guān)相互作用能

為了對抑制劑與hpiv-3hn結(jié)合的程度定量，使用md模擬方法來分別確定已知抑制劑2以及新的c5乙酰胺基和c5異丁酰胺基抑制劑8和10的理論平均相互作用能。對于與hpiv-3hn(1v3e)²⁵復(fù)合的2、8和10，其平均相互作用能(eavi)的值分別確定為-609.38±10.92kjmol^-1，-733.96±15.49kjmol^-1和-821.88±10.93kjmol^-1。這些計算支持用10中異丁酰胺基部分代替8中乙酰胺基部分可顯著改善與蛋白質(zhì)復(fù)合的抑制劑的絕對eavi值的觀點。因此，10被預(yù)測是比8更有效的hpiv-3hn抑制劑。進(jìn)一步分析md模擬并提取與hpiv-3hn(1v3e)復(fù)合的10的最低(-1,078.13kjmol-1)相互作用能量的結(jié)構(gòu)，顯示10在結(jié)合袋內(nèi)進(jìn)行幾個關(guān)鍵相互作用(圖3d)。值得注意的是配體的羧酸鹽和三精氨?；?arg192，arg424，arg502)之間的靜電相互作用，c7羥基和glu276和c5異丁酰胺nh和tyr337和glu409之間的氫鍵相互作用。此外，在c4和c5結(jié)合域內(nèi)分別觀察到c4芳族和c5異丁基官能團(tuán)的額外的疏水相互作用，特別是與肽主鏈。

化學(xué)

常規(guī)方法

試劑和干燥溶劑從商業(yè)來源購買，并且不需進(jìn)一步純化即可使用。在氬氣氣氛下在烘干的玻璃器皿中進(jìn)行無水反應(yīng)。使用薄層色譜(tlc)在預(yù)先涂覆有硅膠60f254(e.merck)的鋁板上監(jiān)測反應(yīng)。在254nm的紫外光下觀察顯色的薄板，然后施加h2so4的etoh(5％v/v)溶液之后使之可視化，隨后炭化。在硅膠60(0.040-0.063mm)上使用蒸餾溶劑進(jìn)行快速色譜。在brukeravance300mhz光譜儀上分別在300mhz和75.5mhz記錄¹h和¹³cnmr光譜。相對于作為內(nèi)部參考的殘留溶劑峰，化學(xué)位移(δ)以ppm記錄[cdcl3:¹h為7.26(s)，¹³c為77.0(t)；dmso:¹h為2.50(pent),¹³c為39.51(hept)；d2o:¹h為4.79(s)]。運行2dcosy和hsqc實驗以支持分配。在brukerdaltonicsesquire3000esi光譜儀上使用正模式以電噴霧離子化模式記錄低分辨率質(zhì)譜(lrms)。對于受保護(hù)或脫保護(hù)的最終衍生物，記錄高分辨率質(zhì)譜(hrms)，并且由昆士蘭大學(xué)在brukerdaltonicsapexiii4.7e傅立葉變換microtof-q70ms上的ftms設(shè)備實施或由格里菲斯大學(xué)在配備有apolloesi源的brukerdaltonicsapexiii4.7e傅里葉變換ms上的ftms設(shè)備實施。

最終脫保護(hù)的唾液酸衍生物在gracepure^tmspec18-aq(5000mg/20ml)柱上用2％乙腈/h2o作溶劑純化。通過¹h和¹³cnmr光譜測定所有合成中間體色譜純化后的純度為>90％，并且為篩選目的合成的參考化合物(2，3，5，6)以及新的最終產(chǎn)物7-10的純度測定為≥95％。

合成

通過文獻(xiàn)方法實現(xiàn)中間體11，12和17-24以及參考抑制劑2，3，5和6的合成。方案1和2中列出了常用方法，其允許獲得本文所述和合成的所有化合物。

18和19的合成的常規(guī)步驟：在氬氣氛下在60℃攪拌17或11(0.42mmol)，boc2o(275mg，1.27mmol)和dmap(50mg，0.42mmol)在無水thf(5ml)中的混合物，過夜。冷卻至室溫后，真空蒸發(fā)溶劑，將殘余物溶于二氯甲烷(dcm)中，在硅膠柱上使用乙酸乙酯：己烷(1:2)作為溶劑進(jìn)行色譜分離，得到純的18(170mg，71％)或19(225mg，96％)。

合成20和2的常規(guī)步驟：向通過將金屬鈉(0.39mmol，9mg)溶解在無水meoh(5ml)中而新制備的naome的甲醇溶液中加入化合物18或19(0.26mmol)。將混合物在室溫下攪拌1小時，然后用ir-120(h⁺)樹脂猝滅(至ph＝5)。過濾出樹脂，用meoh(5ml×3)洗滌，合并的濾液和洗滌液在真空下蒸發(fā)。將殘余物再溶解于吡啶(2ml)中，加入乙酸酐(0.5ml)。將反應(yīng)混合物在室溫氬氣氛下攪拌過夜，然后在真空下除去溶劑和過量的ac2o.最后，將殘余物溶于dcm中，在硅膠柱上使用乙酸乙酯：己烷(1:2)作為溶劑進(jìn)行色譜分離，得到純的20(112mg，81％)或21(84mg，63％)。

合成22和23的常規(guī)步驟：向20或21(0.15mmol)的無水dcm(2ml)溶液中加入tfa(230μl，3.0mmol)，將混合物在室溫和氬氣下攪拌過夜。將反應(yīng)液用dcm(20ml)稀釋，用飽和nahco3水溶液(20ml)猝滅。dcm層用水、鹽水洗滌，然后用無水na2so4干燥。將干燥的有機(jī)溶劑在真空下濃縮，并使用合適的溶劑體系通過硅膠色譜法純化，得到純的22(58mg，90％)或23(53mg，85％)。

合成24和12的常規(guī)步驟：在氬氣下向22或23(0.116mmol)的dcm(2ml)溶液中加入et3n(82μl，0.58mmol)和異丁酰氯(18μl，0.17mmol)。將混合物在室溫下攪拌4小時，然后裝填在硅膠柱上，用乙酸乙酯：己烷(1:1)作溶劑進(jìn)行色譜分離，得到純的24(50mg，84％)或12(51mg，91％)。

合成5和6的常規(guī)步驟：在0℃下向化合物24或12(0.08mmol)在meoh:h2o(2ml)的1:1混合物中的懸浮液中滴加naoh溶液(1.0m)直至ph為14。溫度逐漸升高至室溫，將混合物在室溫下攪拌過夜。然后將溶液用ir-120(h⁺)樹脂酸化(至ph＝5)，過濾并用meoh(10ml)和h2o(10ml)洗滌。然后將合并的濾液和洗滌液真空濃縮，殘余物用蒸餾水(5ml)稀釋，并用0.05mnaoh調(diào)節(jié)至ph＝8.0，將化合物轉(zhuǎn)化為其鈉鹽。然后在c18-gracepure^tm柱上使用2％乙腈/水作溶劑純化化合物，得到蓬松白色粉末的純的5(26mg，94％)或6(24mg，82％)。

合成13-16的常規(guī)步驟：將適量的4-疊氮基-4-脫氧-neu5ac2en衍生物(11或12，0.22mmol)和相應(yīng)的乙炔基衍生物(0.33mmol)溶解在叔丁醇:h2o的1:1的混合物(4ml)中。向混合物中加入五水硫酸銅(ii)(4mg，0.015mmol)，然后加入抗壞血酸鈉(0.1ml新鮮制備的1m的h2o溶液)。將混合物在45℃下攪拌6小時，然后冷卻至室溫。將混合物用dcm(100ml)稀釋，用10％nh4oh(50ml)洗滌，隨后用鹽水(50ml)洗滌。有機(jī)層用無水na2so4干燥并真空濃縮，得到粗產(chǎn)物13-16，使用合適的溶劑體系通過硅膠色譜法純化。

合成7-10的常規(guī)步驟：在0℃下向受保護(hù)的三唑衍生物13-16在meoh:h2o的1:1混合物(2ml)中的懸浮液中滴加naoh溶液(1.0m)，直至ph為14。溫度逐漸升高至室溫，將混合物在室溫下攪拌過夜。然后將溶液用ir-120(h⁺)樹脂酸化(至ph＝5)，過濾并用meoh(10ml)和h2o(10ml)洗滌。然后將合并的濾液和洗滌液在真空下濃縮，然后用蒸餾水(5ml)稀釋并用0.05mnaoh調(diào)節(jié)至ph＝8.0，以將化合物轉(zhuǎn)化為其鈉鹽。最后，化合物在c18-gracepure^tm柱上使用2％乙腈/水作溶劑純化，得到純的產(chǎn)物7-10。

合成的化合物的表征

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(13)

使用乙酸乙酯：丙酮(6:1)通過硅膠色譜純化得到純的13(90mg,78％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.81(s,3h,nac),2.05(s,6h,2oac),2.06(s,3h,oac),3.36(s,3h,och3),3.80(s,3h,cooch3),4.17(dd,j＝12.5,7.2hz,1h,h-9),4.29(m,1h,h-5),4.50(s,2h,och2),4.68–4,79(m,2h,h-9′,h-6),5.40(ddd,j＝7.4,4.9,2.5hz,1h,h-8),5.53(dd,j＝5.1,1.8hz,1h,h-7),5.78(dd,j＝10.0,2.5hz,1h,h-4),6.00(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.05(d,j＝9.1hz,1h,nh),7.64(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.71,20.79,20.91(3ococh3),22.80(nhcoch3),48.39(c-5),52.71(cooch3),58.16(och3),58.38(c-4),62.21(c-9),65.68(och2),67.73(c-7),70.90(c-8),76.71(c-6),107.18(c-3),121.50(三唑-c-5),145.24(三唑-c-4),145.92(c-2),161.27(cooch3),170.06,170.27,170.81,170.88(nhcoch3,3ococh3).lrms[c22h30n4o11](m/z):(+ve離子模式)549.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c22h30n4nao11[m+na]⁺549.1803；實測值549.1805.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(15)

使用乙酸乙酯：丙酮(9:1)通過硅膠色譜純化得到純的15(65mg,71％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.97(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),1.01(d,j＝6.8hz,3h,異丁-ch3),2.05(s,3h,oac),2.08(s,6h,2oac),2.24(m,1h,異丁-ch),3.37(s,3h,och3),3.81(s,3h,cooch3),4.14–4.29(m,2h,h-9,h-5),4.51(s,2h,och2),4.68(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9′),4.84(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.38(ddd,j＝6.6,5.5,2.5hz,1h,h-8),5.48(dd,j＝5.5,1.7hz,1h,h-7),5.91(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.02(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.44(d,j＝8.7hz,1h,nh),7.59(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.81,19.30(異丁-2ch3),20.74,20.90(3ococh3),35.51(異丁-ch),48.79(c-5),52.69(cooch3),57.59(c-4),58.38(och3),62.08(c-9),65.73(och2),67.66(c-7),70.79(c-8),76.24(c-6),107.07(c-3),121.54(三唑-c-5),145.39(三唑-c-4),145.82(c-2),161.30(cooch3),170.15,170.23,170.69(3ococh3),177.87(異丁-co).lrms[c24h34n4o11](m/z):(+ve離子模式)577.2[m+na]⁺.

7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(16)

使用乙酸乙酯：己烷(4:1)通過硅膠色譜純化得到純的16(82mg,84％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.95(d,j＝6.8hz,3h,異丁-ch3),0.99(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.06(s,3h,oac),2.09(s,6h,2oac),2.20–2.27(m,1h,異丁-ch),3.83(s,3h,cooch3),4.16–4.39(m,2h,h-9,h-5),4.70(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9′),4.88(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.40(m,1h,h-8),5.52(dd,j＝5.4,1.7hz,1h,h-7),5.99(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.08(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.51(d,j＝8.7hz,1h,nh),7.26–7.43(m,3h,ph-h-3′,ph-h-4′,ph-h-5′),7.74(d,j＝7.2hz,2h,ph-h-2′,ph-h-6′),7.81(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.83,19.31(異丁-2ch3),20.76,20.92(3ococh3),35.55(異丁-ch),48.74(c-5),52.72(cooch3),57.67(c-4),62.12(c-9),67.72(c-7),70.84(c-8),76.39(c-6),107.25(c-3),118.84(三唑-c-5),125.83(ph),128.47(ph),128.89(ph),129.97(ph季碳),145.81(c-2),148.19(三唑-c-4),161.35(cooch3),170.18,170.26,170.71(3ococh3),178.00(異丁-co).lrms[c28h34n4o10](m/z):(+ve離子模式)608.9[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(7)

產(chǎn)率＝85％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.84(s,3h,nac),3.31(s,3h,och3),3.52–3.71(m,2h,h-9&h-7),3.85(dd,j＝11.9,2.6hz,1h,h-9′),3.95(ddd,j＝9.3,6.2,2.5hz,1h,h-8),4.33(m,1h,h-5),4.51(dd,j＝10.9,1.2hz,1h,h-6),4.56(s,2h,och2),5.48(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.80(d,j＝2.2hz,1h,h-3),8.08(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.65(nhcoch3),48.68(c-5),57.15(och3),59.94(c-4),63.06(c-9),64.22(och2),68.05(c-7),69.71(c-8),75.34(c-6),101.80(c-3),123.54(三唑-c-5),144.08(三唑-c-4),150.43(c-2),168.75(coona),173.57(nhcoch3)；lrms[c15h21n4nao8](m/z):(+ve離子模式)432.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(8)

產(chǎn)率＝96％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.87(s,3h,nac),3.64(dd,j＝12.1,6.4hz,1h,h-9),3.69(dd,j＝9.6,1.4hz,1h,h-7),3.89(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9′),4.00(ddd,j＝9.3,6.3,2.7hz,1h,h-8),4.39(m,1h,h-5),4.56(dd,j＝10.8,1.4hz,1h,h-6),5.49(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.83(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.40(m,1h,ph-h4′),7.46(dd,j＝8.4,6.9hz,2h,ph-h-3′,ph-h-5′),7.71(d,j＝7.1hz,2h,ph-h-2′,ph-h-6′),8.28(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.63(nhcoch3),48.70(c-5),59.96(c-4),63.05(c-9),68.03(c-7),69.69(c-8),75.31(c-6),101.75(c-3),120.41(ph),125.61(ph),128.77(三唑-c-5),129.10(ph),129.28(ph季碳),147.74(三唑-c-4),150.48(c-2),168.75(coona),173.58(nhcoch3).lrms[c19h21n4nao7](m/z):(+ve離子模式)463.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c19h22n4nao7[m+h]⁺441.138070；實測值,441.140189.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(9)

產(chǎn)率＝92％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.98(d,j＝7.0hz,3h,異丁-ch3),1.03(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.46(m,1h,異丁-ch),3.39(s,3h,och3),3.65–3.76(m,2h,h-9,h-7),3.94(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9′),4.04(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.49(m,1h,h-5),4.60–4.65(m,3h,h-6,och2),5.61(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.87(d,j＝2.2hz,1h,h-3),8.18(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.43(異丁-ch3),18.64(異丁-ch3),35.10(異丁-ch),48.19(c-5),57.24(och3),59.86(c-4),63.07(c-9),64.24(och2),68.13(c-7),69.82(c-8),75.43(c-6),102.02(c-3),123.65(三唑-c-5),144.07(三唑-c-4),150.30(c-2),168.81(coona),180.66(異丁-co).lrms[c17h25n4nao8](m/z):(+ve離子模式)459.0[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c17h25n4na2o8[m+na]⁺459.1462；實測值,459.1458.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(10)

產(chǎn)率＝89％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.94(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),0.99(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.43(m,1h,異丁-ch),3.60–3.76(m,2h,h-9,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9′),4.04(ddd,j＝9.2,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.51(m,1h,h-5),4.62(d,j＝11.0hz,1h,h6),5.58(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.88(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.42–7.54(m,3h,ph-h-3′,ph-h-4′,ph-h-5′),7.78(d,j＝7.1hz,2h,ph-h-2′,ph-h-6′),8.36(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.38(異丁-ch3),18.65(異丁-ch3),35.10(異丁-ch),48.23(c-5),59.91(c-4),63.07(c-9),68.15(c-7),69.76(c-8),75.41(c-6),101.96(c-3),120.66(ph),125.67(ph),128.81(三唑-c-5),129.16(ph),129.36(ph季碳),147.71(三唑-c-4),150.32(c-2),168.80(coona),180.67(異丁-co).lrms[c21h25n4nao7](m/z):(+ve離子模式)491.2[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c21h25n4na2o7[m+na]⁺491.1513；實測值,491.1515.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-異丁基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-6).

使用乙酸乙酯通過硅膠色譜純化得到純的ie832-6(93mg,66％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.89(d,j＝6.6hz,6h,異丁基-2ch3),1.81(s,3h,nac),1.93(m,1h,異丁基-ch),2.06(s,6h,2oac),2.09(s,3h,oac),2.58(d,j＝6.9hz,2h,異丁基-ch2),3.82(s,3h,cooch3),4.17(dd,j＝12.5,6.7hz,1h,h-9),4.38(m,1h,h-5),4.67(dd,j＝12.4,2.3hz,1h,h-9’),4.77(d,j＝10.5hz,1h,h-6),5.40(m,1h,h-8),5.55(d,j＝5.4hz,1h,h-7),5.88(d,j＝9.9hz,1h,h-4),6.03(s,1h,h-3),7.07(brs,1h,nh),7.49(s,1h,三唑-ch)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ20.74,20.81,20.93(3ococh3),22.12,22.84(2異丁基-ch3+nhcoch3),28.60(異丁基-ch),34.17(異丁基-ch2),48.04(c-5),52.76(cooch3),58.62(c-4),62.06(c-9),67.56(c-7),70.55(c-8),76.57(c-6),106.82(c-3),120.94(三唑-c-5),146.03(c-2),146.83(三唑-c-4),161.30(cooch3),169.99,170.00170.13,170.78(nhcoch3,3ococh3).lrms[c24h34n4o10](m/z):(+ve離子模式)561.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-異丁基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-8).

產(chǎn)率＝79％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.82(d,j＝6.6hz,6h,異丁基-2ch3),1.81-1.86(m,4h,nac&異丁基-ch),2.53(d,j＝6.9hz,2h,異丁基-ch2),3.54-3.68(m,2h,h-9&h-7),3.85(dd,j＝11.9,2.6hz,1h,h9'),3.94(ddd,j＝9.3,6.3,2.5hz,1h,h-8),4.33(m,1h,h-5),4.49(dd,j＝10.9,1.2hz,1h,h-6),5.40(dd,j＝9.7,2.2hz,1h,h-4),5.78(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.80(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.15(異丁基-2ch3),21.54(nhcoch3),28.09(異丁基-ch),33.42(異丁基-ch2),48.53(c-5),59.65(c-4),62.99(c-9),67.98(c-7),69.63(c-8),75.29(c-6),102.06(c-3),122.01(三唑-c-5),147.74(三唑-c-4),150.12(c-2),168.81(coona),173.28(nhcoch3).lrms[c17h25n4nao7](m/z):(+ve離子模式)443.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c17h26n4nao7[m+1]⁺421.169370；實測值,421.170091.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(4-羥甲基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie932-10).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ¹hnmr(300mhz,氯仿-d)δ1.86(s,3h,nac),2.07(s,3h,oac),2.09(s,3h,oac),2.10(s,3h,oac),3.84(s,3h,cooch3),4.19(dd,j＝12.5,6.6hz,1h,h-9),4.31(m,1h,h-5),4.60-4.74(m,3h,h-9’,ch2),4.80(d,j＝10.4hz,1h,h-6),5.40(m,1h,h-8),5.54(dd,j＝5.8,1.7hz,1h,h-7),5.93(d,j＝10.1hz,1h,h-4),6.07(d,j＝2.2hz,1h,h-3),6.74(brs,1h,nh),7.38(d,j＝7.9hz,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.74(d,j＝7.7hz,2h,ph-h-2’,ph-h-6’),7.96(s,1h,三唑-ch)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ20.74,20.85,20.98(3ococh3),22.90(nhcoch3),48.31(c-5),52.83(cooch3),58.49(c-4),62.19(c-9),64.66(ch2),67.72(c-7),70.93(c-8),76.78(c-6),107.12(c-3),119.00(三唑-c-5),125.91(ph),127.47(ph),128.61(ph季碳),141.59(ph季碳),146.01(c-2),147.65(三唑-c-4),161.37(cooch3),170.13,170.41,170.92,171.26(nhcoch3,3ococh3).lrms[c27h32n4o11](m/z):(+ve離子模式)611.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(4-羥甲基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-12).

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.85(s,3h,nac),3.54-3.71(m,2h,h-9,h-7),3.86(dd,j＝11.9,2.5hz,1h,h-9’),3.96(ddd,j＝9.3,6.3,2.4hz,1h,h-8),4.37(m,1h,h-5),4.54(d,j＝10.9hz,1h,h-6),4.62(s,2h,ch2),5.50(dd,j＝9.6,2.1hz,1h,h-4),5.83(d,j＝2.1hz,1h,h-3),7.44(d,j＝8.2hz,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.75(d,j＝8.2hz,2h,ph-h-2’,ph-h-6’),8.38(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.70(nhcoch3),48.78(c-5),60.04(c-4),63.12(c-9),63.55(ch2),68.11(c-7),69.77(c-8),75.39(c-6),101.78(c-3),120.53(三唑-c-5),125.90(ph),128.06(ph),128.77(ph季碳),140.80(ph季碳),147.60(c-2),150.57(三唑-c-4),168.77(coona),173.66(nhcoch3).lrms[c20h23n4nao8](m/z):(+ve離子模式)493.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c20h24n4nao8[m+1]⁺471.148635；實測值,471.147973.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-甲氧基甲基-[1，2，3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-13).

使用乙酸乙酯：丙酮(6:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie832-13(67mg,58％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.81(s,3h,nac),2.05(s,6h,2oac),2.06(s,3h,oac),3.36(s,3h,och3),3.80(s,3h,cooch3),4.17(dd,j＝12.5,7.2hz,1h,h-9),4.29(m,1h,h-5),4.50(s,2h,och2),4.68-4.79(m,2h,h-9’,h-6),5.40(ddd,j＝7.4,4.9,2.5hz,1h,h-8),5.53(dd,j＝5.1,1.8hz,1h,h-7),5.78(dd,j＝10.0,2.5hz,1h,h-4),6.00(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.05(d,j＝9.1hz,1h,nh),7.64(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.71,20.79,20.91(3ococh3),22.80(nhcoch3),48.39(c-5),52.71(cooch3),58.16(och3),58.38(c-4),62.21(c-9),65.68(och2),67.73(c-7),70.90(c-8),76.71(c-6),107.18(c-3),121.50(三唑-c-5),145.24(三唑-c-4),145.92(c-2),161.27(cooch3),170.06,170.27,170.81,170.88(nhcoch3,3ococh3).lrms[c22h30n4o11](m/z):(+ve離子模式)549.1[m+na]⁺.hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c22h30n4nao11[m+na]⁺549.1803；實測值,549.1805.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-17)

產(chǎn)率＝85％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.84(s,3h,nac),3.31(s,3h,och3),3.52–3.71(m,2h,h-9&h-7),3.85(dd,j＝11.9,2.6hz,1h,h-9'),3.95(ddd,j＝9.3,6.2,2.5hz,1h,h-8),4.33(m,1h,h-5),4.51(dd,j＝10.9,1.2hz,1h,h-6),4.56(s,2h,och2),5.48(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.80(d,j＝2.2hz,1h,h-3),8.08(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.65(nhcoch3),48.68(c-5),57.15(och3),59.94(c-4),63.06(c-9),64.22(och2),68.05(c-7),69.71(c-8),75.34(c-6),101.80(c-3),123.54(三唑-c-5),144.08(c-2),150.43(三唑-c-4),168.75(coona),173.57(nhcoch3)；lrms[c15h21n4nao8](m/z):(+ve離子模式)432.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(3-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-18).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.84(s,3h,nac),2.05(s,3h,oac),2.06(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),3.83(s,3h,cooch3),3.84(s,3h,och3),4.20(dd,j＝12.5,7.0hz,1h,h-9),4.32(m,1h,h-5),4.71(dd,j＝12.5,2.7hz,1h,h9’),4.83(dd,j＝10.5,1.9hz,1h,h-6),5.43(ddd,j＝6.9,5.4,2.6hz,1h,h-8),5.57(dd,j＝5.4,1.9hz,1h,h-7),5.87(dd,j＝10.0,2.5hz,1h,h-4),6.05(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.79–6.92(m,2h,nh,ph-h-4’),7.23–7.38(m,3h,ph-h-2’,ph-h-5’,ph-h-6’),7.84(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.73,20.79,20.92(3ococh3),22.98(nhcoch3),48.79(c-5),52.74(cooch3),55.35(ar-och3),58.04(c-4),62.18(c-9),67.74(c-7),70.78(c-8),76.63(c-6),107.19(c-3),110.94(ph),114.43(ph),118.20(ph),118.93(三唑-c-5),129.97(ph),131.17(ph季碳),146.02(c2),148.03(三唑-c-4),160.02(ph季碳),161.31(cooch3),170.12,170.24,170.81,170.99(nhcoch3,3ococh3).lrms[c27h32n4o11](m/z):(+ve離子模式)611.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(3-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-20)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.86(s,3h,nac),3.52–3.74(m,2h,h-9,h-7),3.77–3.92(m,4h,och3,h-9’),3.97(m,1h,h-8),4.37(m,1h,h-5),4.54(d,j＝10.9hz,1h,h-6),5.49(dd,j＝9.6,2.4hz,1h,h-4),5.84(s,1h,h-3),6.96(m,1h,ph-h-4’),7.23–7.48(m,3h,ph-h-2’,ph-h-5’,ph-h-6’),8.35(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.71(nhcoch3),48.80(c-5),55.39(och3),60.03(c-4),63.12(c-9),68.11(c-7),69.77(c-8),75.39(c-6),101.73(c-3),110.89(ph),114.54(ph),118.49(ph),120.66(三唑-c-5),130.49(ph),130.85(ph季碳),147.51(c2),150.62(三唑-c-4),159.29(ph季碳),168.77(coona),173.65(nhcoch3).lrms[c20h23n4nao8](m/z):(+ve離子模式)493.0[m+1]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c20h24n4nao8[m+1]⁺471.148635；實測值,471.148177.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-丙基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-24)

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.97(t,j＝7.3hz,3h,丙基-ch3),1.73(m,2h,丙基-2’-ch2),1.83(s,3h,nac),2.07(s,6h,2oac),2.10(s,3h,oac),2.77(t,j＝7.6hz,2h,丙基-1’-ch2),3.83(s,3h,cooch3),4.16(dd,j＝12.5,6.0hz,1h,h-9),4.38(m,1h,h-5),4.58(dd,j＝12.6,2.6hz,1h,h-9’),4.85(d,j＝10.6hz,1h,h-6),5.42(m,1h,h-8),5.56(d,j＝6.5hz,1h,h-7),6.01(s,1h,h-3),6.11(d,j＝10.1hz,1h,h-4),7.37(brs,1h,nh),7.68(s,1h,三唑-ch)；lrms[c23h32n4o10](m/z):(+ve離子模式)547.2[m+na]⁺

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-丙基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-26)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.92(t,j＝7.4hz,3h,丙基-ch3),1.57–1.76(m,2h,丙基-2’-ch2),1.93(s,3h,nac),2.71(t,j＝7.3hz,2h,丙基-1’-ch2),3.62–3.77(m,2h,h-9,h-7),3.94(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.04(ddd,j＝9.2,6.3,2.7hz,1h,h-8),4.41(m,1h,h-5),4.58(dd,j＝10.9,1.3hz,1h,h-6),5.50(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.87(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.89(s,1h,三唑-ch).lrms[c16h23n4nao7](m/z):(+ve離子模式)429.0[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c16h23n4na2o7[m+1]⁺429.1357；實測值,429.1361.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(吡啶-3-基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-25)

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.82(s,3h,nac),2.06(s,6h,2oac),2.08(s,3h,oac),3.82(s,3h,cooch3),4.19(dd,j＝12.5,7.2hz,1h,h-9),4.40(q,j＝9.9hz,1h,h-5),4.64–4.88(m,2h,h-7,h-9’),5.38(m,1h,h-8),5.57(dd,j＝4.8,1.9hz,1h,h-7),5.86(dd,j＝9.9,2.4hz,1h,h-4),6.08(d,j＝2.4hz,1h,h-3),7.08(d,j＝9.1hz,1h,nh),7.36(dd,j＝7.9,4.8hz,1h,pyr-h5’),8.04(s,1h,三唑-ch),8.14(d,j＝7.8hz,1h,pyr-h4’),8.54(d,j＝4.8hz,1h,pyr-h-6’),8.96(s,1h,pyr-h-2’)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.69,20.79,20.94(3ococh3),22.89(nhcoch3),48.35(c-5),52.81(cooch3),58.57(c-4),62.14(c-9),67.77(c-7),71.17(c-8),76.85(c-6),106.88(c-3),119.07(三唑-c-5),123.89(pyr),126.33(pyr季碳),133.20(pyr),145.13(三唑-c-4),146.17(c2),146.88(pyr),149.31(pyr),161.25(cooch3),170.16,170.49,170.80,170.95(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c25h29n5o10](m/z):(+ve離子模式)582.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(吡啶-3-基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-27)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.92(s,3h,nac),3.62–3.78(m,2h,h-9,h-7),3.93(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.04(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.44(m,1h,h-5),4.61(dd,j＝10.9,1.3hz,1h,h-6),5.59(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.90(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.53(m,1h,pyr-h-5’),8.17(d,j＝8.0hz,1h,pyr-h-4’),8.49-8.60(m,2h,三唑-ch,phyr-h-6’),8.87(brs,1h,pyr-h-2’)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.67(nhcoch3),48.77(c-5),60.17(c-4),63.08(c-9),68.06(c-7),69.73(c-8),75.36(c-6),101.61(c-3),121.13(三唑-c-5),134.31(pyr),144.68(c-2),145.64(pyr),148.42(pyr),150.65(三唑-c-4),168.72(coona),173.65(nhcoch3).lrms[c18h20n5nao7](m/z):(+ve離子模式)463.7[m+1]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c18h21n5nao7[m+1]⁺442.133319；實測值,442.133358.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(4-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-29)

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.88(s,3h,nac),2.06(s,3h,oac),2.10(s,6h,2oac),3.83(s,3h,cooch3),3.84(s,3h,och3),4.13–4.30(m,2h,h-9,h-5),4.66(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.83(dd,j＝10.6,1.9hz,1h,h-6),5.41(m,1h,h-8),5.52(dd,j＝5.8,1.8hz,1h,h-7),5.93(dd,j＝10.0,2.5hz,1h,h-4),6.01–6.16(m,2h,h-3,nh),6.94(d,j＝8.6hz,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.61–7.83(m,3h,三唑-ch,ph-h-2’,ph-h-6’)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.71,20.78,20.90(3ococh3),22.90(nhcoch3),48.45(c-5),52.70(cooch3),55.31(ph-och3),58.17(c-4),62.23(c-9),67.80(c-7),70.92(c-8),76.83(c-6),107.40(c-3),114.32(ph),117.88(三唑-c-5),122.57(ph季碳),127.13(ph),145.93(c-2),148.07(三唑-c-4),159.87(ph季碳),161.33(cooch3),170.10,170.27,170.81,170.99(nhcoch3,3ococh3).lrms[c27h32n4o11](m/z):(+ve離子模式)611.3[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(4-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-31)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.92(s,3h,nac),3.63–3.77(m,2h,h-9,h-7),3.85(s,3h,och3),3.93(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.6,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.42(m,1h,h-5),4.59(dd,j＝10.9,1.3hz,1h,h-6),5.52(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.87(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.05(d,j＝9.0hz,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.68(d,j＝9.0hz,1h,ph-h-2’,ph-h-6’),8.26(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.65(nhcoch3),48.75(c-5),55.39(och3),60.01(c-4),63.08(c-9),68.07(c-7),69.72(c-8),75.35(c-6),101.82(c-3),114.60(ph),119.78(三唑-c-5),122.49(ph季碳),127.21(ph),147.65(c-2),150.49(三唑-c-4),159.23(ph季碳),168.78(coona),173.62(nhcoch3).lrms[c20h23n4nao8](m/z):(+ve離子模式)492.6[m+1]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c20h24n4nao8[m+1]⁺471.148635；實測值,471.147452.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-30).

使用乙酸乙酯：己烷(7:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie832-30(81mg,62％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.84(s,3h,nac),2.05(s,3h,oac),2.06(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),3.83(s,3h,cooch3),3.88(s,3h,och3),4.20(dd,j＝12.4,7.0hz,1h,h-9),4.37(m,1h,h-5),4.71(dd,j＝12.4,2.7hz,1h,h-9’),4.89(dd,j＝10.5,1.9hz,1h,h-6),5.45(m,1h,h-8),5.59(dd,j＝5.4,1.9hz,1h,h-7),5.87(dd,j＝9.9,2.5hz,1h,h-4),6.07(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.91(d,j＝8.3hz,1h,ph-h-3’),7.03(m,1h,ph-h-5’),7.22–7.30(m,2h,ph-h-4’,nh),8.07(s,1h,三唑-ch),8.17(dd,j＝7.8,1.8hz,1h,ph-h-6’)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.71,20.76,20.88(3ococh3),22.90(nhcoch3),48.84(c-5),52.64(cooch3),55.36(ph-och3),57.83(c-4),62.24(c-9),67.85(c-7),70.79(c-8),76.75(c-6),107.72(c-3),110.87(ph),118.66(ph季碳),120.88(ph),122.32(三唑-c-5),127.37(ph),129.24(ph),143.40(三唑-c4),145.82(c-2),155.68(ph季碳),161.44(cooch3),170.06,170.19,170.75,171.04(nhcoch3,3ococh3).lrms[c27h32n4o11](m/z):(+ve離子模式)611.2[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c27h32n4nao11[m+na]⁺611.195979；實測值,611.196049.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-37)

產(chǎn)率＝91％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.91(s,3h,nac),3.63–3.77(m,2h,h-9,h-7),3.86–3.97(m,4h,h-9’,och3),4.04(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.45(m,1h,h-5),4.60(dd,j＝10.9,1.2hz,1h,h-6),5.53(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.90(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.08–7.14(m,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.34–7.49(m,1h,ph-h-4’),7.92(dd,j＝8.0,1.7hz,h-6’),8.32(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.67(nhcoch3),48.59(c-5),55.38(och3),59.81(c-4),63.09(c-9),68.11(c-7),69.74(c-8),75.40(c-6),101.95(c-3),111.84(ph),117.87(ph季碳),121.00(ph),123.12(三唑-c-5),127.27(ph),130.05(ph),143.23(三唑-c-4),150.33(c-2),155.70(ph季碳),168.81(coona),173.59(nhcoch3).lrms[c20h23n4nao8](m/z):(+ve離子模式)493.2[m+1]⁺.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-(2-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie889-23)

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.00-1.04(m,6h,異丁酰基-2ch3),2.08(s,6h,2oac),2.10(s,3h,oac),2.25–2.34(m,1h,異丁?；?ch),3.84(s,3h,cooch3),3.88(s,3h,ph-och3),4.20-4.28(m,2h,h-9,h-5),4.71(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9),4.99(d,j＝10.5hz,1h,h-6),5.43(m,1h,h-8),5.55(dd,j＝5.4,1.6hz,1h,h-7),6.03(dd,j＝10.1,2.4hz,1h,h-4),6.11(d,j＝2.3hz,1h,h-3),6.79(d,j＝8.3hz,1h,nh),6.93(d,j＝8.3hz,1h,ph-h-3’),7.05(m,1h,ph-h-5’),7.29(m,1h,ph-h-4’),8.04(s,1h,三唑-ch),8.2(d,j＝7.9hz,1h,ph-h-6’)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.86,19.34,20.80,20.95(3ococh3,異丁?；?2ch3),35.42(異丁酰基-ch),49.31(c-5),52.68(cooch3),55.29(ph-och3),57.12(c-4),62.19(c-9),67.74(c-7),70.75(c-8),76.30(c-6),107.73(c-3),110.71(ph),118.68(ph季碳),120.89(ph),122.62(三唑-c-5),127.51(ph),129.21(ph),143.30(三唑-c-5),145.68(c-2),155.68(ph季碳),161.56(cooch3),170.10,170.20,170.68(3ococh3),178.05(異丁?；?co).lrms[c29h36n4o11](m/z):(+ve離子模式)639.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c29h36n4nao11[m+na]⁺639.227279；實測值,639.225897.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-(2-甲氧基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie889-34)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.90(d,j＝6.9hz,3h,異丁?；?ch3),0.97(d,j＝6.9hz,3h,異丁酰基-ch3),2.31(m,1h,異丁?；?ch),3.53(d,j＝9.4hz,1h,h-7),3.60(dd,j＝11.5,5.4hz,1h,h-9),3.79(dd,j＝11.4,3.0hz,1h,h-9’),3.85-3.91(m,4h,h-8,ph-och3),4.39–4.55(m,2h,h-5,h-6),5.61(dd,j＝9.7,2.2hz,1h,h-4),5.72(d,j＝2.2hz,1h,h-3),6.89–7.10(m,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.27(ddd,j＝8.7,7.4,1.7hz,1h,h-4’),8.02(dd,j＝7.7,1.7hz,1h,ph-h-6’),8.23(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.38,18.53(異丁酰基-2ch3),35.09(異丁?；?ch),48.18(c-5),55.34(och3),59.66(c-4),63.08(c-9),68.18(c-7),69.76(c-8),75.44(c-6),102.15(c-3),111.80(ph),117.86(ph季碳),121.00(ph),123.47(三唑-c-5),127.21(ph),130.05(ph),143.12(三唑-c-4),150.16(c-2),155.70(ph季碳),168.84(coona),180.64(nhcoch3)；lrms[c22h28n4o8](m/z):(+ve離子模式)499.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c22h28n4nao8[m+na]⁺499.179935；實測值,499.179943.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie889-45)

使用乙酸乙酯：己烷(5:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie889-45(88mg,70％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.79(s,3h,nac),2.04(s,3h,oac),2.05(s,3h,oac),2.06(s,3h,oac),3.81(s,3h,cooch3),4.18(dd,j＝12.4,7.2hz,1h,h-9),4.42(m,1h,h-5),4.72(dd,j＝12.6,2.7hz,1h,h-9’),4.79(dd,j＝10.5,1.6hz,1h,h-6),5.42(m,1h,h-8),5.58(dd,j＝5.1,1.8hz,1h,h-7),5.83(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.04(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.20–7.42(m,4h,nh,ph-h-3’,ph-h-4’,ph-h-5’),7.72(dd,j＝8.2,1.3hz,2h,ph-h-2’,ph-h-6’),7.88(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3)δ20.70,20.80,20.90(3ococh3),22.85(nhcoch3),48.26(c-5),52.71(cooch3),58.41(c-4),62.26(c-9),67.80(c-7),70.97(c-8),76.95(c-6),107.37(c-3),118.76(三唑-c-5),125.77(ph),128.51(ph),128.91(ph),129.85(ph,季碳),145.95(c-2),148.13(三唑-c-4),161.32(cooch3),170.04,170.30,170.84,170.99(nhcoch3,3ococh3).lrms[c26h30n4o10](m/z):(+ve離子模式)581.0[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c26h30n4nao10[m+na]⁺581.185414；實測值,581.184724.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie889-52)

產(chǎn)率＝96％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.87(s,3h,nac),3.64(dd,j＝12.1,6.4hz,1h,h-9),3.69(dd,j＝9.6,1.4hz,1h,h-7),3.89(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9'),4.00(ddd,j＝9.3,6.3,2.7hz,1h,h-8),4.39(m,1h,h-5),4.56(dd,j＝10.8,1.4hz,1h,h-6),5.49(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.83(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.40(m,1h,ph-h4’),7.46(dd,j＝8.4,6.9hz,2h,ph-h-3’,ph-h-5’),7.71(d,j＝7.1hz,2h,ph-h-2’,ph-h-6’),8.28(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.63(nhcoch3),48.70(c-5),59.96(c-4),63.05(c-9),68.03(c-7),69.69(c-8),75.31(c-6),101.75(c-3),120.41(ph),125.61(ph),128.77(三唑-c-5),129.10(ph),129.28(ph季碳),147.74(三唑-c-4),150.48(c-2),168.75(coona),173.58(nhcoch3).lrms[c19h21n4nao7](m/z):(+ve離子模式)463.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c19h22n4nao7[m+h]⁺441.138070；實測值,441.140189.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie927-57).

使用乙酸乙酯：丙酮(9:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie927-57(60mg,66％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.97(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),1.01(d,j＝6.8hz,3h,異丁-ch3),2.05(s,3h,oac),2.08(s,6h,2oac),2.24(m,1h,異基-ch),3.37(s,3h,och3),3.81(s,3h,cooch3),4.14–4.29(m,2h,h-9,h-5),4.51(s,2h,och2),4.68(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.84(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.38(ddd,j＝6.6,5.5,2.5hz,1h,h-8),5.48(dd,j＝5.5,1.7hz,1h,h-7),5.91(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.02(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.44(d,j＝8.7hz,1h,nh),7.59(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.81,19.30,20.74,20.90(3ococh3,異丁-2ch3),35.51(異基-ch),48.79(c-5),52.69(cooch3),57.59(c-4),58.38(och3),62.08(c-9),65.73(och2),67.66(c-7),70.79(c-8),76.24(c-6),107.07(c-3),121.54(三唑-c-5),145.39(三唑-c-4),145.82(c-2),161.30(cooch3),170.15,170.23,170.69(3ococh3),177.87(異丁基-co).lrms[c24h34n4o11](m/z):(+ve離子模式)577.2[m+na]⁺.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie927-60).

產(chǎn)率＝92％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.98(d,j＝7.0hz,3h,異丁-ch3),1.03(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.46(m,1h,異丁-ch),3.39(s,3h,och3),3.65-3.76(m,2h,h-9,h-7),3.94(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.04(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.49(m,1h,h-5),4.60-4.65(m,3h,h-6,och2),5.61(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.87(d,j＝2.2hz,1h,h-3),8.18(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.43(異丁-ch3),18.64(異丁-ch3),35.10(異丁-ch),48.19(c-5),57.24(och3),59.86(c-4),63.07(c-9),64.24(och2),68.13(c-7),69.82(c-8),75.43(c-6),102.02(c-3),123.65(三唑-c-5),144.07(三唑-c-4),150.30(c-2),168.81(coona),180.66(異丁-co).lrms[c17h25n4nao8](m/z):(+ve離子模式)459.0[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c17h25n4na2o8[m+na]⁺459.1462；實測值,459.1458.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-異丁基-[1,2,3]三唑-1-基)-5-異丁酰胺基-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie927-58).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.90(d,j＝6.6hz,6h,異丁基-2ch3),0.96(d,j＝6.9hz,3h,異丁酰基-ch3),1.00(d,j＝6.8hz,3h,異丁?；?ch3),1.90(m,1h,異丁基-ch),2.05(s,3h,oac),2.08(s,6h,2oac),2.22(m,1h,異丁?；?ch),2.53(d,j＝7.0hz,2h,異丁基-ch2),3.82(s,3h,cooch3),4.13–4.36(m,2h,h-9,h-5),4.70(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.81(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.38(ddd,j＝6.6,5.4,2.5hz,1h,h-8),5.49(dd,j＝5.5,1.7hz,1h,h-7),5.87(dd,j＝10.1,2.4hz,1h,h-4),6.02(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.41(d,j＝8.8hz,1h,nh),7.32(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.83,19.29,20.76,20.92(3ococh3+異丁?；?2ch3),22.23(異丁基-2ch3),28.70(異丁基-ch),34.68(異丁基-ch2),35.55(異丁酰基-ch),48.48(c-5),52.68(cooch3),57.47(c-4),62.11(c-9),67.69(c-7),70.89(c-8),76.44(c-6),107.53(c-3),120.36(三唑-c-5),145.56(c-2),147.53(三唑-c-4),161.40(cooch3),170.15,170.24,170.70(3ococh3),177.74(異丁?；?co).lrms[c26h38n4o10](m/z):(+ve離子模式)589.3[m+na]⁺.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-異丁基-[1,2,3]三唑-1-基)-5-異丁酰胺基-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉

¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.90(d,j＝6.6hz,6h,異丁基-2ch3),0.97(d,j＝6.9hz,3h,異丁?；?ch3),1.02(d,j＝6.9hz,3h,異丁?；?ch3),1.92(m,1h,異丁基-ch),2.43(m,1h,異丁?；?ch),2.60(d,j＝6.9hz,2h,異丁基-ch2),3.62–3.74(m,2h,h-9,h-7),3.93(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.02(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.47(m,1h,h-5),4.56(d,j＝11.1hz,1h,h-6),5.53(dd,j＝9.7,2.2hz,1h,h-4),5.84(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.88(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.45(異丁酰基-ch3),18.61(異丁?；?ch3),21.31(異丁基-2ch3),28.17(異丁基-ch),33.54(異丁基-ch2),35.12(異丁酰基-ch),48.09(c-5),59.53(c-4),63.07(c-9),68.14(c-7),69.78(c-8),75.47(c-6),102.30(c-3),121.99(三唑-c-5),147.82(三唑-c-4),150.05(c-2),168.88(coona),180.46(異丁?；?co).lrms[c19h29n4nao7](m/z):(+ve離子模式)471.2[m+na]⁺,449.2；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c19h29n4na2o7[m+na]⁺471.1826；實測值,471.1823.

7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁?；?4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie984-4)

使用乙酸乙酯：己烷(4:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie984-4(72mg,74％)。¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.95(d,j＝6.8hz,3h,異丁-ch3),0.99(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.06(s,3h,oac),2.09(s,6h,2oac),2.20–2.27(m,1h,異丁-ch),3.83(s,3h,cooch3),4.16–4.39(m,2h,h-9,h-5),4.70(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.88(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.40(m,1h,h-8),5.52(dd,j＝5.4,1.7hz,1h,h-7),5.99(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.08(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.51(d,j＝8.7hz,1h,nh),7.26-7.43(m,3h,ph-h-3’,ph-h-4’,ph-h-5’),7.74(d,j＝7.2hz,2h,ph-h-2’,ph-h-5’),7.81(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,cdcl3):δ18.83,19.31,20.76,20.92(3ococh3,異丁-2ch3),35.55(異丁-ch),48.74(c-5),52.72(cooch3),57.67(c-4),62.12(c-9),67.72(c-7),70.84(c-8),76.39(c-6),107.25(c-3),118.84(三唑-c-5),125.83(ph),128.47(ph),128.89(ph),129.97(ph季碳),145.81(c-2),148.19(三唑-c-4),161.35(cooch3),170.18,170.26,170.71(3ococh3),178.00(異丁-co).lrms[c28h34n4o10](m/z):(+ve離子模式)608.9[m+na]⁺.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(4-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie984-5)

產(chǎn)率＝89％。¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.94(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),0.99(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.43(m,1h,異丁-ch),3.60–3.76(m,2h,h-9,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.04(ddd,j＝9.2,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.51(m,1h,h-5),4.62(d,j＝11.0hz,1h,h6),5.58(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.88(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.42-7.54(m,3h,ph-h-3’,ph-h-4’,ph-h-5’),7.78(d,j＝7.1hz,2h,ph-h-2’,ph-h-6’),8.36(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.38(異丁-ch3),18.65(異丁-ch3),35.10(異丁-ch),48.23(c-5),59.91(c-4),63.07(c-9),68.15(c-7),69.76(c-8),75.41(c-6),101.96(c-3),120.66(ph),125.67(ph),128.81(三唑-c-5),129.16(ph),129.36(ph季碳),147.71(三唑-c-4),150.32(c-2),168.80(coona),180.67(異丁-co).lrms[c21h25n4nao7](m/z):(+ve離子模式)491.2[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c21h25n4na2o7[m+na]⁺491.1513；實測值,491.1515.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-4-(4-(2-氯苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-70)

使用丙酮：己烷(3:2)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-70(76％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.81(s,3h,nac),2.05(s,6h,2oac),2.07(s,3h,oac),3.82(s,3h,cooch3),4.20(dd,j＝12.5,7.0hz,1h,h-9),4.30(q,j＝9.8hz,1h,h-5),4.71(dd,j＝12.5,2.7hz,1h,h-9’),4.86(dd,j＝10.7,1.9hz,1h,h-6),5.42(ddd,j＝6.8,5.4,2.6hz,1h,h-8),5.55(dd,j＝5.3,1.9hz,1h,h-7),5.91(dd,j＝10.0,2.4hz,1h,h-4),6.09(d,j＝2.3hz,1h,h-3),6.93(d,j＝8.8hz,1h,nh),7.26(td,j＝7.8,1.8hz,1h,ph-h),7.34(td,j＝7.6,1.4hz,1h,ph-h),7.41(dd,j＝8.0,1.3hz,1h,ph-h),8.05(dd,j＝7.9,1.7hz,1h,ph-h),8.19(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.75,20.80,20.93(3ococh3),22.94(nhcoch3),49.00(c-5),52.74(cooch3),57.92(c-4),62.18(c-9),67.81(c-7),70.86(c-8),76.48(c-6),107.11(c-3),122.63(三唑-c-5),127.22(ph),128.62(ph,季碳),129.44(ph),129.80(ph),130.28(ph),131.42(ph,季碳),144.31(三唑-c-4),145.96(c-2),161.34(cooch3),170.20,170.28,170.79,171.01(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c26h29cln4o10](m/z):(+ve離子模式)615.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-4-(4-(2-氯苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-78)

產(chǎn)率＝89％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.93(s,3h,nac),3.68(dd,j＝12.0,6.4hz,1h,h-9),3.73(dd,j＝9.7,1.3hz,1h,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.48(t,j＝10.3hz,1h,h-5),4.61(dd,j＝11.1,1.3hz,1h,h-6),5.58(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.93(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.37–7.51(m,2h,2ph-h),7.58(dd,j＝7.5,1.9hz,1h,ph-h),7.81(dd,j＝7.0,2.5hz,1h,ph-h),8.49(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.70(nhcoch3),48.67(c-5),60.10(c-4),63.09(c-9),68.10(c-7),69.74(c-8),75.39(c-6),101.87(c-3),123.78(三唑-c-5),127.36(ph),128.03(ph季碳),129.94(ph),130.10(ph),130.19(ph),131.50(ph季碳),144.37(三唑-c-4),150.41(c-2),168.78(coona),173.56(nhcoch3)；lrms[c19h20cln4nao7](m/z):(+ve離子模式)497.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-72).

使用丙酮：己烷(4:3)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-72(81％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.76(s,3h,nac),2.04(s,3h,oac),2.06(s,3h,oac),2.07(s,3h,oac),2.33(s,3h,ph-ch3),3.82(s,3h,cooch3),4.19(dd,j＝12.5,7.1hz,1h,h-9),4.39(q,j＝9.9hz,1h,h-5),4.71(dd,j＝12.4,2.7hz,1h,h-9’),4.82(dd,j＝10.4,2.0hz,1h,h-6),5.41(ddd,j＝7.6,5.1,2.7hz,1h,h-8),5.57(dd,j＝5.2,1.9hz,1h,h-7),5.86(dd,j＝10.2,2.4hz,1h,h-4),6.07(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.16–7.30(m,4h,nh,3ph-h),7.60(m,1h,ph-h),7.70(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.72,20.81,20.93(3ococh3),21.09(ph-ch3),22.82(nhcoch3),48.63(c-5),52.73(cooch3),58.03(c-4),62.21(c-9),67.76(c-7),70.93(c-8),76.72(c-6),107.38(c-3),121.28(三唑-c-5),126.16(ph),128.58(ph),128.94(ph),129.23(ph,季碳),130.90(ph),135.64(ph,季碳),145.85(c-2),147.15(三唑-c-4),161.37(cooch3),170.07,170.30,170.80,171.06(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c27h32n4o10](m/z):(+ve離子模式)595.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲基苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-82).

產(chǎn)率＝85％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.93(s,3h,nac),2.36(s,3h,ph-ch3),3.68(dd,j＝11.9,6.3hz,1h,h-9),3.74(d,j＝9.7hz,1h,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.48(t,j＝10.3hz,1h,h-5),4.60(dd,j＝10.8,1.3hz,1h,h-6),5.58(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.92(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.29–7.46(m,3h,3ph-h),7.58(d,j＝7.4hz,1h,ph-h),8.19(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ19.77(ph-ch3),21.67(nhcoch3),48.69(c-5),60.06(c-4),63.09(c-9),68.10(c-7),69.74(c-8),75.39(c-6),101.92(c-3),122.60(三唑-c-5),126.17(ph),128.94(ph季碳),129.01(ph),129.03(ph),130.76(ph),136.45(ph季碳),146.87(三唑-c-4),150.42(c-2),168.80(coona),173.52(nhcoch3)；lrms[c20h23n4nao7](m/z):(+ve離子模式)477.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-(三氟甲基)苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-74).

使用丙酮：己烷(3:2)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-74(90％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.75(s,3h,nac),2.04(s,3h,oac),2.05(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),3.83(s,3h,cooch3),4.14–4.35(m,2h,h-9,h-5),4.70(dd,j＝12.4,2.6hz,1h,h-9’),4.92(dd,j＝10.6,1.8hz,1h,h-6),5.42(ddd,j＝6.8,5.4,2.6hz,1h,h-8),5.54(dd,j＝5.5,1.8hz,1h,h-7),5.97(dd,j＝10.1,2.4hz,1h,h-4),6.08(d,j＝2.3hz,1h,h-3),6.99(d,j＝8.5hz,1h,nh),7.48(t,j＝7.7hz,1h,ph-h),7.61(td,j＝7.7,1.4hz,1h,ph-h),7.72(dd,j＝8.1,1.4hz,1h,ph-h),7.75–7.84(m,2h,ph-h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.76,20.79,20.92(3ococh3),22.73(nhcoch3),49.38(c-5),52.74(cooch3),57.48(c-4),62.16(c-9),67.80(c-7),70.79(c-8),76.25(c-6),107.09(c-3),122.58(ph,季碳),122.82(q,j＝5.1,4.6hz,三唑-c-5),125.29(ph,季碳),126.22(q,j＝5.5hz,ph),127.61(q,j＝30.4hz,cf3),128.71(ph),131.79(ph),132.09(ph),144.40(三唑-c-4),145.84(c-2),161.35(cooch3),170.20,170.26,170.75,171.19(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c27h29f3n4o10](m/z):(+ve離子模式)649.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-(三氟甲基)苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-83).

產(chǎn)率＝77％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.94(s,3h,nac),3.68(dd,j＝11.8,6.3hz,1h,h-9),3.73(d,j＝9.6hz,1h,h-7),3.93(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.3,6.2,2.6hz,1h,h-8),4.51(t,j＝10.2hz,1h,h-5),4.59(d,j＝10.9hz,1h,h-6),5.61(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.93(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.61–7.70(m,2h,2ph-h),7.75(t,j＝7.6hz,1h,ph-h),7.90(d,j＝7.8hz,1h,ph-h),8.23(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.61(nhcoch3),48.62(c-5),59.96(c-4),63.09(c-9),68.10(c-7),69.73(c-8),75.48(c-6),101.96(c-3),122.49(ph季碳),123.77(q,j＝3.0hz,三唑-c-5),125.20(ph季碳),126.32(q,j＝5.4hz,ph),127.39–128.51(m,cf3),129.38(ph),131.99(ph),132.27(ph),144.83(三唑-c-4),150.33(c-2),168.75(coona),173.52(nhcoch3)；lrms[c20h20f3n4nao7](m/z):(+ve離子模式)531.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(5-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-79)

使用乙酸乙酯：丙酮(6:1)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-79(68％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.87(s,3h,nac),2.01(s,3h,oac),2.03(s,3h,oac),2.07(s,3h,oac),3.34(s,3h,ch2och3),3.79(s,3h,cooch3),4.15–4.27(m,2h,h-5,h-9),4.34–4.50(m,2h,ch2o),4.60(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),5.09(dd,j＝10.7,1.8hz,1h,h-6),5.42(td,j＝6.2,2.6hz,1h,h-8),5.49(dd,j＝6.3,1.8hz,1h,h-7),5.91(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.05(dd,j＝9.9,2.5hz,1h,h-4),7.26(d,j＝7.8hz,1h,nh),7.46(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.71,20.76,20.92(3ococh3),23.04(nhcoch3),50.03(c-5),52.60(cooch3),55.20(c-4),58.59(ch2och3),61.94(ch2och3),62.10(c-9),67.74(c-7),70.25(c-8),75.54(c-6),107.87(c-3),133.48(三唑-c-4),134.46(三唑-c-5),145.50(c-2),161.55(cooch3),169.96,170.21,170.66,171.54(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c22h30n4o11](m/z):(+ve離子模式)549.3[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(5-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-87).

產(chǎn)率＝83％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.89(s,3h,nac),3.40(s,3h,och3),3.65–3.74(m,2h,h-9,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.57(d,j＝10.9hz,1h,h-6),4.61–4.73(m,3h,h-5,och2),5.62(dd,j＝9.6,2.4hz,1h,h-4),5.85(d,j＝2.4hz,1h,h-3),7.81(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.73(nhcoch3),47.97(c-5),57.87(och3),58.92(c-4),61.34(och2),63.08(c-9),68.08(c-7),69.70(c-8),75.34(c-6),102.36(c-3),134.66(三唑-c-5),134.73(三唑-c-4),150.02(c-2),168.75(coona),173.61(nhcoch3)；lrms[c15h21n4nao8](m/z):(+ve離子模式)431.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(5-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-39).

使用己烷：丙酮(4:3)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-39(82％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.74(s,3h,nac),2.02(s,3h,oac),2.04(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),3.80(s,3h,cooch3),4.04(td,j＝10.1,7.3hz,1h,h-5),4.21(m,1h,h-9),4.51(m,1h,h-9’),5.05(d,j＝10.5hz,1h,h-6),5.31–5.46(m,2h,h-7,h-8),5.98(d,j＝2.5hz,1h,h-3),6.09(dd,j＝9.7,2.5hz,1h,h-4),6.75(d,j＝7.4hz,1h,nh),7.30–7.32(m,2h,2ph-h),7.47–7.53(m,3h,3ph-h),7.58(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.73,20.79,20.89(3ococh3),23.03(nhcoch3),50.85(c-5),52.58(cooch3),54.24(c-4),62.01(c-9),67.63(c-7),69.87(c-8),74.78(c-6),108.02(c-3),126.01(ph季碳),129.07(ph),129.23(ph),130.07(ph),132.70(三唑-c-4),139.35(三唑-c-5),145.49(c-2),161.49(cooch3),169.79,170.40,170.58,171.03(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c26h30n4o10](m/z):(+ve離子模式)581.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(5-苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-45)

產(chǎn)率＝88％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.72(s,3h,nac),3.55(d,j＝9.7hz,1h,h-7),3.62(dd,j＝12.0,6.3hz,1h,h-9),3.87(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),3.95(ddd,j＝9.3,6.2,2.7hz,1h,h-8),4.33–4.51(m,2h,h-5,h-6),5.63(dd,j＝9.3,2.2hz,1h,h-4),5.98(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.46–7.56(m,2h,2ph-h),7.57–7.61(m,3h,3ph-h),7.85(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.88(nhcoch3),48.83(c-5),57.52(c-4),63.00(c-9),67.95(c-7),69.64(c-8),75.01(c-6),103.14(c-3),125.71(ph季碳),129.13(ph),129.28(ph),130.10(ph),133.02(三唑-c-4),139.88(三唑-c-5),149.90(c-2),168.80(coona),173.30(nhcoch3)；lrms[c19h21n4nao7](m/z):(+ve離子模式)462.6[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4,5-二苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1172-90).

使用己烷：丙酮(3:2)通過硅膠色譜純化得到純的ie1172-90(79％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.82(s,3h,nac),2.03(s,6h,2oac),2.10(s,3h,oac),3.78(s,3h,cooch3),4.17–4.27(m,2h,h-5,h-9),4.52(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),5.07(d,j＝10.4hz,1h,h-6),5.40(td,j＝6.3,2.5hz,1h,h-8),5.45(dd,j＝6.8,1.7hz,1h,h-7),5.79–5.93(m,2h,h-3,h-4),7.13–7.27(m,6h,nh,5ph-h),7.28–7.34(m,2h,2ph-h),7.38–7.48(m,3h,3ph-h)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.75,20.76,20.89(3ococh3),23.33(nhcoch3),50.56(c-5),52.54(cooch3),54.97(c-4),62.09(c-9),67.54(c-7),69.93(c-8),75.13(c-6),108.41(c-3),126.48(ph季碳),127.15(ph),128.09(ph),128.44(ph),129.31(ph),130.11(ph),130.14(ph),130.18(ph季碳),135.11(三唑-c),144.35(三唑-c),145.49(c-2),161.50(cooch3),169.80,170.27,170.63,171.37(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c32h34n4o10](m/z):(+ve離子模式)657.3[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4,5-二苯基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1172-102)

產(chǎn)率＝84％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.83(s,3h,nac),3.58(d,j＝9.7hz,1h,h-7),3.63(dd,j＝12.0,6.2hz,1h,h-9),3.88(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),3.94(ddd,j＝9.4,6.2,2.7hz,1h,h-8),4.37(d,j＝11.0hz,1h,h-6),4.59(dd,j＝11.2,9.2hz,1h,h-5),5.48(d,j＝9.7hz,1h,h-4),5.90(s,1h,h-3),7.36–7.59(m,10h,ph-h)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.94(nhcoch3),48.33(c-5),58.44(c-4),63.01(c-9),67.98(c-7),69.61(c-8),74.96(c-6),103.15(c-3),126.05(ph季碳),127.31(ph),128.55(ph),128.80(ph),129.21(ph),129.63(ph季碳),130.25(ph),130.42(ph),135.79(三唑-c),144.67(三唑-c),149.71(c-2),168.67(coona),173.41(nhcoch3)；lrms[c25h25n4nao7](m/z):(+ve離子模式)539.2[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-4-(4-(2-溴苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1257-75)

使用己烷：丙酮(3:2)通過硅膠色譜純化得到純的ie1257-75(88％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.85(s,3h,nac),2.06(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),2.09(s,3h,oac),3.84(s,3h,cooch3),4.16–4.28(m,2h,h-5,h-9),4.68(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.91(dd,j＝10.7,1.8hz,1h,h-6),5.43(ddd,j＝6.7,5.6,2.6hz,1h,h-8),5.53(dd,j＝5.8,1.7hz,1h,h-7),6.00(dd,j＝9.9,2.5hz,1h,h-4),6.11(d,j＝2.2hz,1h,h-3),6.59(d,j＝8.4hz,1h,nh),7.20(ddd,j＝8.1,7.3,1.6hz,1h,ph-h),7.40(td,j＝7.5,1.3hz,1h,ph-h),7.63(dd,j＝8.0,1.2hz,1h,ph-h),7.96(dd,j＝7.9,1.7hz,1h,ph-h),8.22(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.80,20.95(3ococh3),23.13(nhcoch3),49.56(c-5),52.75(cooch3),57.49(c-4),62.10(c-9),67.81(c-7),70.62(c-8),76.10(c-6),107.03(c-3),121.42(ph季碳),122.66(ph),127.76(ph),129.75(ph),130.65(ph),133.59(三唑-c5),145.61(三唑-c4),145.94(c-2),161.33(cooch3),170.15,170.29,170.71,171.09(nhcoch3,3ococh3).

5-乙酰胺基-2,6-脫水-4-(4-(2-溴苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1257-84)

產(chǎn)率＝89％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.93(s,3h,nac),3.62–3.77(m,2h,h-7,h-9),3.92(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.02(ddd,j＝9.2,6.2,2.7hz,1h,h-8),4.49(dd,j＝10.9,9.6hz,1h,h-5),4.60(dd,j＝10.9,1.3hz,1h,h-6),5.58(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.92(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.36(ddd,j＝7.9,7.3,1.7hz,1h,ph-h),7.49(td,j＝7.6,1.3hz,1h,ph-h),7.69(dd,j＝7.8,1.7hz,1h,ph-h),7.77(dd,j＝8.1,1.2hz,1h,ph-h),8.45(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.77(nhcoch3),48.68(c-5),60.07(c-4),63.10(c-9),68.11(c-7),69.75(c-8),75.42(c-6),101.91(c-3),121.49(ph季碳),123.72(ph),127.90(ph),129.16(ph),130.16(ph季碳),130.42(ph),130.71(ph),133.42(三唑-c5),145.89(三唑-c4),150.39(c-2),168.78(coona),173.54(nhcoch3).

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲氧羰基)苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie1398-25)

使用己烷：丙酮(4:3)通過硅膠色譜純化得到純的ie1398-25(91％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ1.76(s,3h,nac),2.02(s,3h,oac),2.04(s,3h,oac),2.05(s,3h,oac),3.75(s,3h,ph-cooch3),3.80(s,3h,c2-cooch3),4.17(dd,j＝12.4,7.1hz,1h,h-9),4.31(q,j＝9.8hz,1h,h-5),4.69(dd,j＝12.5,2.8hz,1h.h-9’),4.78(d,j＝10.3hz,1h,h-6),5.38(ddd,j＝7.6,5.4,2.8hz,1h,h-8),5.52(dd,j＝5.0,1.9hz,1h,h-7),5.78(dd,j＝10.2,2.5hz,1h,h-4),6.03(d,j＝2.4hz,1h,h-3),7.13(d,j＝8.9hz,1h,nh),7.38(t,j＝7.8hz,1h,ph-h),7.50(td,j＝7.7,1.4hz,1h,ph-h),7.65(d,j＝7.7hz,1h,ph-h),7.76(d,j＝7.6hz,1h,ph-h),7.84(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.72,20.79,20.91(3ococh3),22.80(nhcoch3),48.65(c-5),52.29,52.66(2cooch3),57.96(c-4),62.23(c-9),67.78(c-7),70.91(c-8),76.66(c-6),107.37(c-3),122.06(ph),128.35(ph),129.85(ph),129.99(ph季碳),130.15(ph季碳),130.35(ph),131.62(三唑-c5),145.79(三唑-c4),145.89(c-2),161.36(c2-cooch3),168.39(ph-cooch3),170.07,170.27,170.76,171.02(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c28h32n4o12](m/z):(+ve離子模式)639.3[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(4-(2-甲氧羰基)苯基)-[1,2,3]三唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie1398-33).

產(chǎn)率＝68％。¹hnmr(400mhz,d2o):δ1.94(s,3h,nac),3.66(dd,j＝12.2,6.0hz,1h,h-9),3.72(dd,j＝9.8,1.4hz,1h,h-7),3.93(dd,j＝12.0,2.9hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.4,6.4,2.7hz,1h,h-8),4.47(t,j＝10.3hz,1h,h-5),4.61(dd,j＝10.9,1.4hz,1h,h-6),5.59(dd,j＝9.5,2.1hz,1h,h-4),5.95(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.43–7.55(m,3h,3ph-h),7.75(dd,j＝6.6,1.5hz,1h,ph-h),8.18(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(101mhz,d2o):δ21.76(nhcoch3),48.80(c-5),59.69(c-4),63.10(c-9),68.13(c-7),69.77(c-8),75.40(c-6),102.22(c-3),122.33(三唑-c5),125.00(ph季碳),126.44(ph),128.30(ph),128.57(ph),128.79(ph),138.95(ph季碳),146.15(三唑-c4),150.22(c-2),168.85(c2-coona),173.80(nhcoch3),178.10(ph-coona)；lrms[c20h20n4na2o9](m/z):(+ve離子模式)528.8[m+na]⁺.

氟化7,8,9-三-o-乙?；?3,4,5-三脫氧-3-氟-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-赤型-β-l-葡萄糖-non-2-ulopyranosylonate甲酯(ie1257-22).

使用己烷：丙酮(3:2)通過硅膠色譜純化得到純的10(57mg,81％)。¹hnmr(400mhz,cdcl3):δ0.96–1.01(m,6h,異丁基-2ch3),2.01(s,3h,oac),2.09(s,3h,oac),2.13(s,3h,oac),2.23(dq,j＝13.0,6.8hz,1h,異丁基-ch),3.36(s,3h,och3),3.90–3.96(m,4h,cooch3,h-5),4.19(dd,j＝12.6,4.6hz,1h,h-9),4.27(dd,j＝12.6,2.5hz,1h,h-9’),4.54(s,2h,och2),4.99–5.30(m,3h,h-3,h-6,h-7),5.37(ddd,j＝8.6,4.6,2.4hz,1h,h-8),6.19–6.29(m,2h,h-4,nh),7.60(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(100mhz,cdcl3):δ18.86(異丁-ch3),19.32(異丁-ch3),20.59,20.75,20.79(3ococh3),35.53(異丁-ch),50.84(d,j＝5.8hz,c-5),53.62(cooch3),58.34(och3),59.00–59.40(m,c-4),61.86(c-9),65.50(och2),67.08(c-7),68.29(c-8),71.51(c-6),90.64(dd,j＝196.1,30.3hz,c-3),105.58(dd,j＝230.3,26.8hz,c-2),124.52(三唑-ch),144.83(三唑-季碳),164.51(d,j＝32.9hz,cooch3),169.56,170.41,170.69(3ococh3),178.35(異丁-co)；¹⁹fnmr(376mhz,cdcl3):δ-118.67(d,j＝14.0hz,f-2α),-197.42(d,j＝13.2hz,f-3β)；lrms[c24h34f2n4o11](m/z):(+ve離子模式)615.3[m+na]⁺.

氟化3,4,5-三脫氧-3-氟-5-異丁酰胺基-4-(4-甲氧基甲基-[1,2,3]三唑-1-基)-d-赤型-β-l-葡萄糖-non-2-ulopyranosylonate(ie1257-24).

¹hnmr(400mhz,d2o):δ0.81(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),0.94(d,j＝6.9hz,3h,異丁-ch3),2.35(p,j＝6.9hz,1h,異丁-ch),3.38(s,3h,och3),3.54(d,j＝9.2hz,1h,h-7),3.61(m,1h,h-9),3.78–3.91(m,2h,h-8,h-9’),4.52–4.76(m,3h,och2,h-6),4.85(m,1h,h-5),5.32(ddd,j＝49.5,13.7,9.7hz,1h,h-3),5.75(q,j＝11.2hz,1h,h-4),8.28(s,1h,三唑-ch)；¹³cnmr(100mhz,d2o):δ18.11(異丁-ch3),18.65(異丁-ch3),34.87(異丁-ch),48.15(d,j＝6.1hz,c-5),57.26(och3),63.16(c-9),63.18–63.58(m,c-4),64.13(och2),67.85(c-7),69.83(c-8),73.73(d,j＝3.3hz,c-6),90.22(dd,j＝190.9,32.6hz,c-3),106.79(dd,j＝224.1,27.8hz,c-2),124.89(三唑-ch),144.09(trizaole-qc),169.21(d,j＝30.7hz,cooh),180.88(異丁-co)；¹⁹fnmr(376mhz,d2o):δ-112.75(d,j＝13.8hz,f-2α),-199.41(d,j＝14.3hz,f-3β)；lrms[c17h25f2n4nao8](m/z):(+ve離子模式)496.8[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+1]⁺計算值c17h26f2n4o8[m+1]⁺453.1791；實測值,453.1810.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie889-76).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.60(s,3h,nac),1.82(s,6h,2oac),1.84(s,3h,oac),3.60(s,3h,cooch3),3.96(dd,j＝12.7,7.0hz,1h,h-9),4.19(q,j＝9.9hz,1h,h-5),4.40–4.50(m,2h,h-6,h-9’),5.16(ddd,j＝7.5,6.0,2.4hz,1h,h-8)；5.22–5.33(m,2h,h-4,h-7),5.86(d,j＝1.6hz,1h,h-3),6.20(d,j＝9.6hz,1h,nhac),6.84(m,1h,ar-h),6.99(m,1h,ar-h),7.26(s,1h,ar-h-3’),7.37(m,2h,ar-h-4’,ar-h-7’)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ20.76,20.92(3ococh3),22.97(nhcoch3),49.26(c-5),52.79(cooch3),58.00(c-4),62.08(c-9),67.67(c-7),70.86(c-8),77.06(c-6),93.82(ar-c-cn),107.66(c-3),114.69(cn),117.55(ar),117.78(ar),121.14(ar),123.23(ar),124.63(ar季碳),126.08(ar),131.60(ar季碳),146.63(c-2),161.29(cooch3),170.17,170.30,170.63(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c27h29n3o10](m/z):(+ve離子模式)578.1[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie889-80)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.91(s,3h,nac),3.61–3.77(m,2h,h-7,h-9),3.94(dd,j＝11.9,2.6hz,1h,h-9’),4.05(ddd,j＝9.2,6.2,2.6hz,1h,h-8),4.50(m,1h,h-5),4.64(d,j＝11.0hz,1h,h-6),5.47(dd,j＝9.4,2.3hz,1h,h-4),5.96(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.21(m,1h,ar-h),7.37(ddd,j＝8.9,6.7,1.1hz,1h,ar-h),7.65–7.87(m,3h,ar-h-3’,ar-h-4’,ar-h-7’)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.77(nhcoch3),49.83(c-5),59.20(c-4),63.08(c-9),68.09(c-7),69.77(c-8),75.41(c-6),92.08(ar-c-cn),103.30(c-3),115.30(cn),117.35(ar),119.65(ar),121.36(ar),122.82(ar),124.09(ar季碳),125.99(ar),132.03(ar季碳),150.56(c-2),168.78(coona),173.36(nhcoch3)；lrms[c20h20n3nao7](m/z):(+ve離子模式)460.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c20h20n3na2o7[m+na]⁺460.1091；實測值,460.1097.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie889-92).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ0.92(d,j＝6.8hz,3h,異丁酰基-ch3),1.00(d,j＝6.8hz,3h,異丁?；?ch3),2.07(s,3h,oac),2.09(s,3h,oac),2.10(s,3h,oac),2.27(m,1h,異丁酰基-ch),3.86(s,3h,cooch3),4.23(dd,j＝12.4,6.6hz,1h,h-9),4.50(m,1h,h-5),4.68(dd,j＝12.5,2.7hz,1h,h-9’),4.77(d,j＝10.6hz,1h,h-6),5.40(m,1h,h-8),5.51(dd,j＝5.6,1.6hz,1h,h-7),5.62(dd,j＝9.7,2.4hz,1h,h-4),6.15(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.24(d,j＝9.4hz,1h,nh),7.11(dd,j＝8.6,6.7hz,1h,ar-h),7.28(dd,j＝8.4,6.6hz,1h,ar-h),7.50(s,1h,ar-h-3’),7.60-7.64(m,2h,ar-h-4’,ar-h-7’)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ18.77,19.05(異丁?；?2ch3),20.69,20.73,20.90(3ococh3),35.51(異丁酰基-ch),49.11(c-5),52.78(cooch3),57.88(c-4),62.05(c-9),67.61(c-7),70.80(c-8),77.01(c-6),93.83(ar-c-cn),107.56(c-3),114.80(cn),117.58(ar),117.81(ar),121.20(ar),123.22(ar),124.66(ar季碳),126.15(ar),131.56(ar季碳),146.50(c-2),161.31(cooch3),170.10,170.14,170.57(3ococh3),177.07(異丁?；?co)；lrms[c29h33n3o10](m/z):(+ve離子模式)606.4[m+na]⁺.

2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie889-99)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.88(d,j＝6.9hz,3h,異丁?；?ch3),0.97(d,j＝6.9hz,3h,異丁酰基-ch3),2.44(m,1h,異丁?；?ch),3.62–3.75(m,2h,h-7,h-9),3.93(dd,j＝12.0,2.7hz,1h,h-9’),4.04(ddd,j＝9.3,6.3,2.6hz,1h,h-8),4.56-4.66(m,2h,h-5,h-6),5.47(dd,j＝9.6,2.4hz,1h,h-4),5.95(d,j＝2.2hz,1h,h-3),7.20(ddd,j＝7.8,6.8,1.0hz,1h,ar-h),7.36(ddd,j＝8.3,6.8,1.0hz,1h,ar-h),7.70(dd,j＝8.6,1.1hz,1h,ar-h),7.74–7.87(m,2h,2ar-h)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ18.16,18.59(異丁?；?2ch3),35.06(異丁?；?ch),49.13(c-5),59.30(c-4),63.07(c-9),68.20(c-7),69.81(c-8),75.45(c-6),92.08(ar-c-cn),103.34(c-3),115.47(cn),117.33(ar),120.04(ar),121.38(ar),122.81(ar),124.04(ar季碳),126.01(ar),132.04(ar季碳),150.37(c-2),168.87(coona),180.37(異丁酰基-co)；lrms[c22h24n3nao7](m/z):(+ve離子模式)488.1[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c22h24n3na2o7[m+na]⁺488.1404；實測值,488.1400.

7,8,9-三-o-乙酰基-2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie927-93).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ2.07(s,3h,oac),2.08(s,3h,oac),2.10(s,3h,oac),3.86(s,3h,cooch3),4.22(dd,j＝12.5,6.6hz,1h,h-9),4.54(q,j＝9.9hz,1h,h-5),4.68(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.82(dd,j＝10.6,1.9hz,1h,h-6),5.43(td,j＝6.0,5.5,2.6hz,1h,h-8),5.52(dd,j＝5.6,1.8hz,1h,h-7),5.62(dd,j＝9.7,2.4hz,1h,h-4),6.17(d,j＝2.4hz,1h,h-3),7.13(ddd,j＝7.9,6.8,1.0hz,1h,ar-h),7.28(ddd,j＝8.4,6.7,1.0hz,1h,ar-h),7.52(s,1h,ar-h-3’),7.58–7.69(m,2h,ar-h-4’,ar-h-7’),7.91(d,j＝9.6hz,1h,nh)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ20.50,20.71,20.91(3ococh3),49.81(c-5),52.93(cooch3),57.45(c-4),61.93(c-9),67.46(c-7),70.64(c-8),76.40(c-6),93.61(ar-c-cn),107.14(c-3),113.24-117.05(cf3),114.37(cn),117.73(ar),117.80(ar),121.08(ar),123.65(ar),124.93(ar季碳),126.55(ar),131.85(ar季碳),146.73(c-2),157.56(q,jc,f＝38.8hz,cocf3),161.03(cooch3),169.91,170.38,170.71(3ococh3)；lrms[c27h26f3n3o10](m/z):(+ve離子模式)632.1[m+na]⁺.

2,6-脫水-4-(1-氰基-2h-異吲哚-2-基)-3,4,5-三脫氧-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie927-99)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ3.60–3.75(m,2h,h-7,h-9),3.93(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.07(ddd,j＝9.4,6.4,2.6hz,1h,h-8),4.64-4.74(m,2h,h-5,h-6),5.57(dd,j＝9.4,2.3hz,1h,h-4),6.00(d,j＝2.3hz,1h,h-3),7.21(m,1h,ar-h),7.36(m,1h,ar-h),7.69(d,j＝8.6hz,1h,ar-h),7.77(d,j＝8.5hz,1h,ar-h),7.84(s,1h,ar-h-3’)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ50.48(c-5),58.73(c-4),63.00(c-9),68.08(c-7),69.66(c-8),75.05(c-6),91.94(ar-c-cn),103.21(c-3),109.60-118.88(cf3),115.01(cn),117.34(ar),121.36(ar),123.02(ar),124.19(ar季碳),126.23(ar),132.12(ar季碳),150.62(c-2),158.20(q,jc,f＝38.8hz,cocf3),168.44(coona)；lrms[c20h17f3n3nao7](m/z):(+ve離子模式)514.1[m+na]⁺,492.2；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c20h17f3n3na2o7[m+na]⁺514.0830；實測值,514.0836.

5-乙酰胺基-7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(1h-四唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie832-86)

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.95(s,3h,nac),2.06(s,3h,oac),2.09(s,3h,oac),2.10(s,3h,oac),3.84(s,3h,cooch3),4.02(m,1h,h-5),4.22(dd,j＝12.6,6.4hz,1h,h-9),4.63(dd,j＝12.5,2.6hz,1h,h-9’),4.95(dd,j＝10.5,1.8hz,1h,h-6),5.38(td,j＝6.2,2.6hz,1h,h-8),5.49(dd,j＝5.9,1.8hz,1h,h-7),6.05(d,j＝2.5hz,1h,h-3),6.11(dd,j＝9.8,2.5hz,1h,h-4),6.67(d,j＝8.2hz,1h,nh),8.70(s,1h,四唑-ch)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ20.72,20.75,20.91(3ococh3),23.13(nhcoch3),49.72(c-5),52.87(cooch3),55.92(c-4),61.93(c-9),67.62(c-7),70.50(c-8),75.70(c-6),105.19(c-3),140.84(四唑-c5),146.64(c-2),161.07(cooch3),170.17,170.27,170.63,171.54(nhcoch3,3ococh3)；lrms[c19h25n5o10](m/z):(+ve離子模式)506.5[m+na]⁺.

5-乙酰胺基-2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-4-(1h-四唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie832-98)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ1.94(s,3h,nac),3.65-3.74(m,2h,h-7,h-9),3.92(dd,j＝11.9,2.7hz,1h,h-9’),4.02(ddd,j＝9.3,6.2,2.7hz,1h,h-8),4.44(dd,j＝10.9,9.7hz,1h,h-5),4.62(dd,j＝11.0,1.4hz,1h,h-6),5.73(dd,j＝9.6,2.3hz,1h,h-4),5.88(d,j＝2.3hz,1h,h-3)；¹³cnmr(75mhz,d2o):δ21.63(nhcoch3),48.44(c-5),58.77(c-4),63.04(c-9),67.99(c-7),69.67(c-8),75.29(c-6),100.61(c-3),143.99(四唑-c5),150.85(c-2),168.53(cooch3),173.82(nhcoch3)；lrms[c12h16n5nao7](m/z):(+ve離子模式)388.4[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c12h16n5na2o7[m+na]⁺388.083964；實測值,388.084945.

7,8,9-三-o-乙?；?2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(1h-四唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸甲酯(ie889-36).

¹hnmr(300mhz,cdcl3):δ1.05(d,j＝6.9hz,6h,異丁酰胺基-2ch3),2.01(s,3h,oac),2.05(s,6h,2oac),2.34(m,1h,異丁酰胺基-ch),3.81(s,3h,cooch3),4.01(m,1h,h-5),4.18(dd,j＝12.5,6.3hz,1h,h-9),4.60(dd,j＝12.6,2.6hz,1h,h-9’),5.03(dd,j＝10.5,1.7hz,1h,h-6),5.32(td,j＝6.1,2.5hz,1h,h-8),5.46(dd,j＝5.9,1.8hz,1h,h-7),6.03(d,j＝2.4hz,1h,h-3),6.14(dd,j＝9.8,2.5hz,1h,h-4),6.94(d,j＝8.1hz,1h,nh),8.65(s,1h,四唑-ch)；¹³hnmr(75mhz,cdcl3):δ18.85,19.27(異丁酰胺基-2ch3),20.66,20.84(3ococh3),35.56(異丁酰胺基-ch),49.69(c-5),52.79(cooch3),55.77(c-4),61.91(c-9),67.49(c-7),70.51(c-8),75.64(c-6),105.15(c-3),140.81(四唑-c5),146.70(c-2),161.18(cooch3),170.04,170.15,170.58(3ococh3),178.53(異丁酰胺基-co)；lrms[c21h29n5o10](m/z):(+ve離子模式)534.3[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c21h29n5nao10[m+na]⁺534.180663；實測值,543.1788531.

2,6-脫水-3,4,5-三脫氧-5-異丁酰胺基-4-(1h-四唑-1-基)-d-甘油基-d-半乳糖-壬-2-烯酸鈉(ie889-42)

¹hnmr(300mhz,d2o):δ0.99-1.04(m,6h,異丁酰胺基-2ch3),2.46(m,1h,異丁酰胺基-ch),3.59–3.75(m,2h,h-7,h-9),3.93(dd,j＝12.0,2.6hz,1h,h-9’),4.03(ddd,j＝9.7,6.2,2.6hz,1h,h-8),4.49(dd,j＝10.9,9.7hz,1h,h-5),4.65(dd,j＝10.9,1.2hz,1h,h-6),5.76(dd,j＝9.7,2.3hz,1h,h-4),5.88(d,j＝2.2hz,1h,h-3),9.38(s,1h,四唑-ch)；lrms[c14h20n5nao7](m/z):(+ve離子模式)416.0[m+na]⁺；hrms(api)(m/z):[m+na]⁺計算值c14h20n5na2o7[m+na]⁺416.115264；實測值,416.116886.

生物學(xué)

細(xì)胞和病毒

a549細(xì)胞(腺癌人肺基底上皮細(xì)胞)由歐洲細(xì)胞培養(yǎng)物保藏中心(86012804-1vl，sigmaaldrich)提供。細(xì)胞在補充有1％谷氨酰胺(200mm)和5％胎牛血清的dulbecco改良的eagle培養(yǎng)基(dmem)(lonza，basel，瑞士)中增殖。對于感染和感染后程序，將a549細(xì)胞供養(yǎng)在僅用1％谷氨酰胺補充的dmem中。正常的人支氣管/氣管上皮(nhbe)細(xì)胞(cc-2540，批號313831，lonza)在b-ali^tm生長培養(yǎng)基(lonza)中擴(kuò)增，并且相同的培養(yǎng)基用于感染和感染后研究。在補充有1％谷氨酰胺(200mm)和2％熱滅活的胎牛血清的eagle最小必需培養(yǎng)基(emem)(lonza)中培養(yǎng)llc-mk2細(xì)胞(獼猴腎，atccccl-7)。在hpiv-3感染和感染后潛伏期間，llc-mk2細(xì)胞供養(yǎng)在補充有1％谷氨酰胺的emem中。所有細(xì)胞系在37℃在5％co2的加濕大氣中培養(yǎng)。

hpiv-3(菌株c-243)來自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(atcc，manassas，va)。利用補充有谷氨酰胺的emem(ememinf)，病毒在llc-mk2細(xì)胞中、在35℃下、在5％co2的加濕大氣中繁殖。感染后3至4天收集含病毒的培養(yǎng)上清液，并通過離心(3,000rcf，15分鐘)從細(xì)胞碎片中澄清，同時監(jiān)測細(xì)胞病變效應(yīng)。使用30kdaamicon超過濾裝置(millipore，billerica，ma)將病毒濃縮至少10次以用于血細(xì)胞凝集抑制(hi)測定。神經(jīng)氨酸酶抑制(ni)測定和std-nmr實驗使用peg沉淀并經(jīng)如上所述純化的病毒。

將澄清的hpiv-3上清液與peg6000(8％終濃度)和nacl(0.4m終濃度)混合，然后緩慢攪拌在4℃培養(yǎng)過夜。通過在4℃下以3,000rcf離心30分鐘使peg6000/hpiv-3復(fù)合物成球。棄去上清液，并使用相對于初始病毒懸浮液體積至少1:40的的一定體積的gnte緩沖液(200mm甘氨酸，200mmnacl，20mmtris-hcl，2mmedta，ph7.4)在4℃下過夜重懸小球。通過上下移液使病毒懸浮液均質(zhì)化，然后使用具有“緊(tight)”杵的勻漿器(douncer)對剩余的病毒聚集體進(jìn)行機(jī)械破碎。將hpiv-3勻漿加載到在gnte緩沖液中制備的30％-60％非線性蔗糖梯度的頂部上，并在4℃以100,000rcf離心2小時30分鐘，無需制動減速。病毒在30％-60％蔗糖界面濃縮，然后收集并儲存在-80℃用于ni測定或在4℃用于std-nmr實驗。

hpiv-3hn抑制劑：化合物2，3，5-10提供為凍干粉末，隨后溶解于無菌水中以產(chǎn)生10mm儲備溶液。將溶液超聲處理15分鐘以允許完全溶解，然后過濾滅菌。將儲備溶液在-20℃儲存于玻璃小瓶中，并在使用前在適當(dāng)?shù)木彌_液中立即稀釋。對于stdnmr實驗，在d2o中以100mm制備儲備溶液。溶液如上所述地處理和儲存。

重組hn表達(dá)和純化：基于實質(zhì)上修改的文獻(xiàn)程序，使用bac-to-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(invitrogen，卡爾斯巴德，加利福尼亞州)表達(dá)hn蛋白。因此，將蜜蜂蜂毒信號肽(hbm)的核苷酸序列添加至編碼hn胞外域(氨基酸125至572)的序列的下游。將該序列(hbm+hn)進(jìn)行密碼子優(yōu)化以在草地貪夜蛾細(xì)胞(sf9)中表達(dá)，并直接通過dna2.0基因合成服務(wù)(dna2.0，門洛帕克，加利福尼亞州)排序為命稱為hbm-hnhpiv-3opt的基因。通過pcr擴(kuò)增hbm-hnhpiv-3opt并連接到提供用于純化和檢測目的的額外的c-末端6-組氨酸標(biāo)簽(his-tag)的pfastbac/ct-載體中。

根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行包含hbm-hnhpiv-3opt的重組桿狀病毒的產(chǎn)生和擴(kuò)增。用高moi的hbm-hnhpiv-3opt桿狀病毒感染在insect-xpress無蛋白質(zhì)的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基(lonza)中培養(yǎng)的sf9細(xì)胞(invitrogen)。感染后4天，收集含有重組hn的上清液，以產(chǎn)生最高的蛋白質(zhì)表達(dá)。通過離心(3,000rcf，15分鐘)澄清上清液以除去細(xì)胞碎片，然后按照制造商的方案在histrapexcel5ml柱(通用醫(yī)療生命科學(xué)集團(tuán)，白金漢郡，英格蘭)上純化。用500mm咪唑溶液洗脫重組hn，并通過神經(jīng)氨酸酶活性(na)測定評估收集的組分(見下文)。合并最活躍的組分，并用10kdaamicon超過濾器單元(millipore)濃縮至終體積為800μl。進(jìn)行其他的純化步驟，在4℃下在superdex75凝膠過濾柱(通用醫(yī)療)上使用快速蛋白質(zhì)液相色譜(amersham生物科學(xué))，并用frac-920收集1ml組分。通過在280nm處監(jiān)測組分收集測定的含蛋白質(zhì)組分在na測定評價并進(jìn)行sds-page。將純化和濃縮的重組hn蛋白在4℃保存。

血細(xì)胞凝集抑制測定：在u型底96孔板測定中重復(fù)兩次評價hn抑制劑。將化合物在pbs中稀釋為每種測試濃度的4x溶液(25μl/孔，1x終濃度)。將每個稀釋物與4個血細(xì)胞凝集單位(hau)的hpiv-3混合(25μl/孔，最終1hau)，并在室溫下培養(yǎng)20分鐘。將板轉(zhuǎn)移到冰上，并向每個孔中加入等體積(50μl)的冷凍的0.75％豚鼠紅細(xì)胞(gp-rbc)或1％人紅細(xì)胞(h-rbc)。然后將板在4℃下培養(yǎng)1小時30分鐘，然后讀取血細(xì)胞凝集的程度。hiic50被認(rèn)為是與未處理的病毒懸浮液相比將血凝素活性(凝集)降低50％的抑制劑濃度。

神經(jīng)氨酸酶抑制測定

制備純化的hpiv-3、抑制劑和mun，并在na反應(yīng)緩沖溶液(naoac50mm，cacl25mm，ph4.6)中稀釋。na采用不同的hpiv-3稀釋液，其初步測試以確定用于測定中的最低病毒濃度。用足夠的純化的病毒進(jìn)行na測定以獲得最大熒光信號，其比被認(rèn)為統(tǒng)計學(xué)顯著的實驗背景高至少5倍。神經(jīng)氨酸酶抑制(ni)測定重復(fù)三次進(jìn)行。對于每個測試濃度，向每個孔中加入2μl純化的hpiv-3和4μl2.5x抑制劑溶液(1x終濃度)。將板在室溫下保持20分鐘，然后向每個孔中加入4μl的5mm2'-(4-甲基umbelliferyl)-d-n-乙酰神經(jīng)酰胺(mun)(2mm終濃度)，然后將板在37℃攪拌(1000rpm)培育30分鐘。通過向每個孔中加入190μl甘氨酸緩沖液(甘氨酸0.25m，ph10.4)來終止酶反應(yīng)。通過向病毒中加入mun得到陰性對照，然后在t＝0時停止酶反應(yīng)。使用victor3多標(biāo)簽讀出器(perkinelmer，沃爾瑟姆，馬塞諸塞州)測量相對熒光(rf)。通過背景消減(陰性對照rf)處理數(shù)據(jù)，然后用graphpadprism4(graphpadsoftwareinc.，拉荷亞，加利福尼亞州)分析以計算ic50值(非線性回歸(曲線擬合)，劑量-反應(yīng)-抑制，3參數(shù)邏輯)。與未處理的病毒懸浮液相比，將神經(jīng)氨酸酶活性(相對熒光)降低50％的抑制劑的濃度被認(rèn)為是niic50值?；谙惹肮_的步驟，通過使用整個hpiv-3病毒的酶動力學(xué)實驗測定抑制劑6和10的ki值。因此，在20分鐘時間內(nèi)，在5個底物濃度[s]：2、4、8、10和16mm，以及四種抑制劑濃度[i]：10為0、0.5、2.5、5μm，6為10或0、10、20、60μm，每5分鐘測量一次神經(jīng)氨酸酶活性。所有測定進(jìn)行三次，使用graphpadprism4(graphpadsoftwareinc.，拉荷亞，加利福尼亞州)將最終數(shù)據(jù)擬合到用于競爭性抑制的米氏(michaelis-menten)方程中，從而使用[i]＝0和變量[s]實驗的數(shù)據(jù)和ki值確定米氏常數(shù)(km)。

病毒生長抑制測定：在基于細(xì)胞的測定中評估最佳抑制劑之前，進(jìn)行mtt測定以評價化合物的細(xì)胞毒性。在303μm(測試的最高濃度)下，用6、8和10培養(yǎng)llc-mk2細(xì)胞48小時后沒有觀察到細(xì)胞毒性效應(yīng)。使用焦點形成測定法評估病毒生長抑制，其通過對來自低moi感染的匯合的48孔板形式的llc-mk2單層的ememinf中的2μm的6、8和10存在下子代的滴定。病毒接種物(100ffu/孔)與6、8和10預(yù)培養(yǎng)20分鐘。感染進(jìn)行一式兩份，并在37℃持續(xù)1小時，每15分鐘輕輕攪拌。移除接種物并用500μl/孔的各自的2μm化合物稀釋液(在ememinf中)替換。

使用相同條件減去化合物得到感染的陽性對照。病毒在感染的細(xì)胞單層上的增殖在37℃，5％co2下保持48小時。收集來自一式兩份的培養(yǎng)物上清液，合并且在15,000rcf下澄清10分鐘并在-80℃儲存。將上清液在ememinf中稀釋10^-3、10^-4和10^-5，以避免任何殘留的化合物影響隨后的病毒滴定。使用前述用于病毒感染的條件一式兩份進(jìn)行病毒滴定。1小時后，將ememinf中的avicel(fmcbiopolymer，費城，賓夕法尼亞州)直接添加至接種物(1％終濃度)以限制和定位病毒增殖。將板在37℃，5％co2下培養(yǎng)36至40小時以允許焦點形成。輕輕去除avicel并用3.7％多聚甲醛/pbs替換，然后將板在室溫下保持15分鐘用于病毒滅活和細(xì)胞固定。將細(xì)胞單層用pbs洗滌3次，每次5分鐘，然后用0.3％h2o2/pbs在37℃下滅活內(nèi)源性過氧化物酶30分鐘。將板再次用pbs洗滌3次，每次5分鐘，并與1μg/ml的小鼠單克隆igg抗-hpiv-3hn(fitzgerald，clone#m02122321,2.0mg/ml)在37℃，5％牛奶/pbs中培養(yǎng)1小時。用0.02％吐溫20/pbs將細(xì)胞單層洗滌3次，每次5分鐘。將在5％牛奶/pbs中以1:1000稀釋的山羊抗-小鼠-igg(h+l)-hrp綴合物(biorad，ref#170-6516)加入每個孔中并在37℃培養(yǎng)1小時。如前所述用0.02％吐溫20/pbs洗滌細(xì)胞單層，然后用pbs漂洗兩次。通過在每個孔中加入trueblue溶液(hrp底物)并在37℃培養(yǎng)板1小時來顯示焦點。棄去trueblue溶液，將板用水漂洗兩次，然后干燥，隨后掃描(圖2)，并對焦點計數(shù)。ic50值被認(rèn)為是與未處理的感染的llc-mk2單層相比使子代病毒滴定量降低50％的抑制劑濃度。

原位elisa：原位elisa是評估病毒生長抑制的有用技術(shù)。它在一個步驟中測量感染的細(xì)胞單層的細(xì)胞表面處hpiv-3hn的表達(dá)水平。表達(dá)水平與非固定化病毒感染和再感染靶細(xì)胞的能力直接相關(guān)。在接種在96孔板中的匯合細(xì)胞單層上進(jìn)行感染。將病毒(40ffu/孔)與作為10倍稀釋系列的終濃度為1000μm至0.001μm的化合物6和10預(yù)培養(yǎng)20分鐘。感染一式三份，并在37℃持續(xù)1小時，每15分鐘輕輕攪拌。移除接種物并用200μl/孔的各個相應(yīng)化合物稀釋液替換。通過使用相同的實驗條件減去抑制劑，合并用于感染的陽性對照。將感染的細(xì)胞單層在37℃，5％co2下保持36-40小時以進(jìn)行病毒增殖。病毒滅活，通過直接加入100μl11.1％多聚甲醛/pbs固定細(xì)胞。將板在室溫下保持15分鐘，然后用pbs洗滌3次，每次5分鐘，然后通過用0.3％h2o2/pbs在37℃處理30分鐘使內(nèi)源性過氧化物酶失活。洗滌細(xì)胞單層，并在37℃，5％牛奶/pbs中利用1μg/ml的小鼠單克隆igg抗-hpiv-3hn(fitzgerald，clone#m02122321,2.0mg/ml)培養(yǎng)1小時。孔用0.02％吐溫20/pbs洗滌3次，每次5分鐘。將在5％牛奶/pbs中以1:2000稀釋的山羊抗-小鼠-igg(h+l)-hrp綴合物(biorad，ref#170-6516)加入每個孔中，并在37℃培養(yǎng)1小時。用0.02％吐溫20/pbs洗滌細(xì)胞單層，然后用pbs漂洗兩次。向每個孔中加入bdopteiatmb底物(bdbiosciences，圣何塞，加利福尼亞州，100μl)，然后將板在37℃培養(yǎng)。通過每孔加入50μl的0.6mh2so4，在3-5分鐘后停止酶反應(yīng)。通過用victor3多標(biāo)簽讀取器(perkinelmer，沃爾瑟姆，馬塞諸塞州)在450nm下讀取每個孔的吸光度(od)0.1秒來獲得原始數(shù)據(jù)。通過從初始o(jì)d讀數(shù)減去陰性對照(未感染細(xì)胞)od以獲得最終od，并用graphpadprism4(graphpadsoftwareinc.，拉荷亞，加利福尼亞州)分析數(shù)據(jù)以計算ic50值(非線性回歸(曲線擬合)，劑量-反應(yīng)-抑制，4參數(shù)邏輯)。ic50值被認(rèn)為是與未處理的感染的細(xì)胞單層相比，將在450nm處的吸光度降低50％的抑制劑的濃度。

可以使用公開的模型在高度分化的人呼吸道道上皮(hae)細(xì)胞的hpiv-3抑制測定中測試本發(fā)明的化合物。簡而言之，測試步驟如下：如先前所述(müller等人，2013)，分離，培養(yǎng)和分化人呼吸道上皮(hae)細(xì)胞。簡言之，將人鼻呼吸道上皮細(xì)胞分離，擴(kuò)增并接種在膠原包被的可滲透膜支持物上。一旦細(xì)胞匯合，移除頂部培養(yǎng)基，并將細(xì)胞維持在空氣-液體界面約4至6周以允許上皮分化。含有纖毛細(xì)胞的培養(yǎng)物通過細(xì)胞腔表面用每孔5000個焦點形成單位的hpiv-3接種1小時。在細(xì)胞剛剛被病毒感染后，將不同濃度的化學(xué)式(i)，(ii)，(iii)和(iiia)的測試化合物加入到基底外側(cè)培養(yǎng)基中。如先前公開的(guillon等人，2014)，在感染后1,3和6天通過病毒滴定，使用焦點形成測定或原位elisa在a549或llc-mk2細(xì)胞中評估病毒負(fù)載的減少。這些結(jié)果可以與現(xiàn)有技術(shù)的參考化合物例如包括bcx-2855的bcx化合物比較，以給出相對藥效的表示。(guillon,p.,dirr,l.,el-deeb,i.m.,winger,m.,bailly,b.,haselhorst,t.,dyason,j.c.,和vonitzstein,m.(2014).structure-guideddiscoveryofpotentanddual-actinghumanparainfluenzavirushaemagglutinin–neuraminidaseinhibitors.nat.commun.5.；和müller,l.,brighton,l.e.,carson,j.l.,fischer,w.a.,和jaspers,i.(2013).culturingofhumannasalepithelialcellsatairliquidinterface.j.vis.exp.)

結(jié)果

進(jìn)行合成的c4修飾的neu5ac2en衍生物對hpiv-3hn的藥效的比較，為了方便起見，基于存在于c5的酰胺基將ic50值分成兩組。第1組抑制劑具有c5乙酰胺基官能團(tuán)，第2組抑制劑具有c5異丁酰胺基官能團(tuán)(圖3和圖4a-c)。基準(zhǔn)物和充分表征的廣譜神經(jīng)氨酸酶抑制劑neu5ac2en(2)顯示最弱的抑制，對于hpiv-3hnni和hi，ic50值分別為1565μm和1438μm。對于3，bcx2798(6)的c5乙酰胺基類似物，觀察到的抑制與2相比得到改善，盡管它仍然在較高微摩爾范圍內(nèi)，對于hpiv-3hnni和hi的ic50值分別為138μm和210μm。這些ic50值與本發(fā)明的新型抑制劑7(一種c4甲氧基甲基官能化的三唑neu5ac2en衍生物)觀察到的相似，實驗測定的hpiv-3hnni和hiic50值分別為154μm和313μm。在用較大體積的苯基(8)代替c4三唑的甲氧基甲基部分(7)時，觀察到藥效的顯著改善。測得8的hpiv-3hnni和hi的ic50值分別為6.5μm和4.6μm。這些值總結(jié)在表2中。

在包含c5異丁酰胺基官能團(tuán)的第二組抑制劑中，顯然每種抑制劑的親和力相對于其c5乙酰胺基類似物得到改善。藥效級并非不可預(yù)期的，在同一組內(nèi)是相同的。因此，發(fā)現(xiàn)neu5ac2en的c5異丁酰胺基類似物5具有最弱的抑制，對于ni和hi的ic50值分別為188μm和358μm，并且參考hpiv抑制劑bcx2798(6)的ni和hi的ic50值分別為21.5μm和16.1μm。在三唑環(huán)上具有相對小的甲氧基甲基取代基的抑制劑9具有接近于c4疊氮基類似物6測定的ic50值(對于ni和hi，ic50分別為14.2μm和13.8μm)。類似地，如在含有c5乙酰胺基的第1組抑制劑中觀察到的，將抑制劑9中的甲氧基甲基的取代基大小增加至如抑制劑10中的大體積苯基部分導(dǎo)致藥效的顯著改善，對于ni和hi其ic50值為2.7μm和1.5μm。有趣的是，當(dāng)使用人紅細(xì)胞代替豚鼠紅細(xì)胞時，觀察到hiic50值的改善(圖2)。這種改善最可能反映人和豚鼠紅細(xì)胞之間的唾液酸含量和/或連接呈現(xiàn)差異。例如，眾所周知的是，人組織和細(xì)胞(包括紅細(xì)胞)僅表達(dá)含有n-乙酰神經(jīng)氨酸的糖綴合物受體，而其他動物也表達(dá)基于n-羥乙酰神經(jīng)氨酸的受體。然而，不管使用的具體紅細(xì)胞如何，我們設(shè)計的抑制劑10與基準(zhǔn)化合物6相比具有顯著更高的藥效。mun的km值為5.1mm，抑制劑10和6的ki值分別為1.3μm和16μm。

表2：ni和hi的ic50值。每種測試化合物的平均ic50值和計算的標(biāo)準(zhǔn)偏差和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

基于細(xì)胞的測定

在初始酶篩選后，在生長抑制測定中評價最有效的抑制劑10和參考hpiv抑制劑(bcx2798，6)，以比較它們在llc-mk2細(xì)胞中抑制hpiv-3病毒感染和繁殖的能力(圖5a和b)。選擇化合物6作為參照抑制劑，因為它是迄今為止最有文獻(xiàn)證明的基于hpiv-3neu5ac2en的抑制劑并且具有合理的體外hpiv-3抗病毒效力。在初始測定中，在6或10以2μm的抑制劑濃度存在下將病毒繁殖48小時，并測定病毒滴定量。在該抑制劑濃度下，計算出通過6和10病毒滴定量分別減少14％和94％(圖5b)。使用三種不同的細(xì)胞系在良好建立的原位elisa技術(shù)中測定兩種抑制劑的病毒生長抑制ic50值。選擇llc-mk2(猴腎上皮細(xì)胞)細(xì)胞系，因為其廣泛用于基于hpiv-3細(xì)胞的感染研究，以及hpiv-3易感人體呼吸道細(xì)胞系a549(肺腺癌上皮細(xì)胞)和正常人支氣管上皮(nhbe)原代細(xì)胞，以研究天然組織相關(guān)細(xì)胞中的病毒生長抑制。該方法本身具有相對于病毒滴定方法的有用優(yōu)點，因為它是將非固定化病毒生長與低感染倍數(shù)(moi)的感染的細(xì)胞單層的hn表達(dá)水平相關(guān)聯(lián)的更快的、一步的、非主觀技術(shù)。有趣的是，相對于人細(xì)胞系，用實驗室建立的細(xì)胞系llc-mk2測得10和6的稍低的病毒生長抑制ic50值。總體上，對于所有三種細(xì)胞系，觀察到相同的趨勢，與抑制劑6(ic50＝54.6-130.6μm)相比，確定抑制劑10具有顯著更強的抗病毒效果(ic50＝2.1-13.9μm)(圖6)。

結(jié)構(gòu)生物學(xué)

樣品制備和¹hnmr實驗：所有nmr實驗在配備有具有三軸梯度的5-mmtxi探針的600mhznmr光譜儀(bruker)上進(jìn)行。通過使用截止值分別為30kda或10kda的amicon過濾單元(millipore)超濾，將完整病毒懸浮液或重組hpiv-3hn與50mm氘代乙酸鈉，在pd4.6的d2o中的5mmcacl2進(jìn)行緩沖液交換。對于每個實驗，使用20μmhpiv-3hn蛋白，蛋白質(zhì)：配體摩爾比為1:100，最終體積為200μl。

¹hnmr光譜是在283k下經(jīng)32次掃描獲得的，在6000hz的光譜寬度上有2s弛豫延遲。由于與病毒相比，蛋白質(zhì)更安全和更容易處理，并且為了在每個實驗中提供完全相同的蛋白質(zhì)濃度，對與完整hpiv-3病毒復(fù)合的化合物10進(jìn)行初始stdnmr實驗，而所有后續(xù)實驗使用重組hn蛋白進(jìn)行。

飽和轉(zhuǎn)移差(std)nmr實驗：蛋白質(zhì)在-1.0ppm處飽和共振，在300ppm處偏共振，具有50ms持續(xù)時間的60個選擇性高斯形脈沖的級聯(lián)，導(dǎo)致總飽和時間為3s，弛豫延遲設(shè)定為4s。每個stdnmr實驗用共1056次掃描(重組hpiv-3hn)或1512次掃描(完整病毒)獲得，并且使用watergate序列抑制殘余hdo信號。應(yīng)用具有5khz強度和10ms持續(xù)時間的自旋鎖濾波器以抑制蛋白質(zhì)背景。用相同的實驗設(shè)置和相同的配體濃度但在不存在蛋白質(zhì)的情況下進(jìn)行對照stdnmr實驗。分別存儲和處理共振譜和偏共振譜，通過從偏共振譜中減去共振譜得到最終的stdnmr譜。使用等式astd＝(i0-isat)/i0＝istd/i0來量化所有std效應(yīng)。因此，將stdnmr光譜的信號強度(istd)與參考光譜的相應(yīng)信號強度(i0)進(jìn)行比較。將光譜中最強的std信號指定為100％的值，并用作參考以計算相對std效應(yīng)。

對與重組表達(dá)的hpiv-3hn復(fù)合的8(圖7)和與重組表達(dá)的hpiv-3hn(圖8)或完整hpiv-3病毒(圖9)復(fù)合的最有效的抑制劑10進(jìn)行飽和轉(zhuǎn)移差(std)nmr實驗，以進(jìn)一步支持展示特異性結(jié)合和抑制的計算學(xué)和生物學(xué)研究。

當(dāng)抑制劑與完整病毒或重組hpiv-3hn復(fù)合時，在不同程度清楚地觀察到與8或10相關(guān)的所有質(zhì)子的stdnmr信號強度，并且明確證明了配體在兩種情況下都結(jié)合。在完整病毒顆粒存在下獲得的10的¹hnmr光譜中在3.25，3.5和4.0ppm可見的微小信號是來自病毒純化過程的雜質(zhì)的結(jié)果，既不屬于病毒顆粒也不屬于10。如所預(yù)期的，這些信號未在stdnmr光譜中觀察到，清楚地證明雜質(zhì)不與病毒結(jié)合(圖9)。這些實驗清楚地證明10與完整hpiv-3病毒和hpiv-3hn的特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實了抑制劑的生物相關(guān)性和效力。

重要的是，在完整病毒和重組hn蛋白的stdnmr光譜中在7.1-7.6ppm處觀察到的芳香族苯基質(zhì)子信號的覆蓋也揭示了抑制劑10與完整hpiv-3病毒或重組hpiv-3hn蛋白的結(jié)合表位即使不是相同的也是相似的(圖10)。

抑制劑10的表位圖

通過分析與10復(fù)合的hpiv-3hn蛋白的stdnmr光譜(圖8)來測定完全配體結(jié)合表位。10的所有stdnmr信號均標(biāo)準(zhǔn)化為所觀察到的最強的stdnmr信號，在7.18ppm處的抑制劑的h4'質(zhì)子。然后計算抑制劑的所有質(zhì)子的相對stdnmr效應(yīng)(表2)。stdnmr信號強度的程度明顯取決于質(zhì)子與蛋白質(zhì)表面的接近度，并揭示所設(shè)計的抑制劑10如何與hn蛋白質(zhì)的結(jié)合位點接合。

表3：與hpiv-3hn復(fù)合的8和10的相對stdnmr效應(yīng)^a。根據(jù)公式astd＝(i0–isat)/i0–istd/i0計算的^astd效應(yīng)。相對于c4三唑arh4'的最強stdnmr強度給出所有stdnmr效應(yīng)。

值得注意的是，對于7.1ppm和7.6ppm之間的苯基基團(tuán)質(zhì)子h2'，h3'，h4'，h5'和h6'觀察到非常強的相對stdnmr效應(yīng)，顯示分子的該區(qū)域與蛋白質(zhì)表面緊密接觸。此外，同樣檢測到三唑部分的ch的顯著stdnmr效應(yīng)。相比之下，抑制劑的c5異丁酰胺基部分的質(zhì)子顯示較小的效應(yīng)(42-54％的范圍內(nèi)的相對stdnmr信號強度)。

與10的neu5ac2en核心結(jié)構(gòu)相關(guān)的質(zhì)子顯示可變的相對stdnmr效應(yīng)。顯著的h3相對stdnmr信號強度(80％)表明分子的該部分與hpiv-3hn的強相互作用。此外，h4，h5和h6的相對stdnmr信號強度分別為59％，50％和49％，表明neu5ac2en核心結(jié)構(gòu)的環(huán)質(zhì)子也參與抑制劑與蛋白質(zhì)的接合。

最后，對于甘油基側(cè)鏈質(zhì)子h7，h8，h9和h9'，分別觀察到36％，35％，24％和21％的較弱的相對stdnmr效應(yīng)，表明甘油側(cè)鏈對抑制劑結(jié)合事件的貢獻(xiàn)小于c4三唑并官能團(tuán)和抑制劑的核心環(huán)結(jié)構(gòu)(圖8)。抑制劑8表位圖(圖7)的所有意圖和目的與抑制劑10的相同，c4三唑部分清楚地緊密接觸蛋白質(zhì)表面。

二氟類似物

化合物可以包括二氟化化合物，并且對該類的選定成員(如下所示的i-170，i-179和i-104)進(jìn)行測試。這種化合物的靶標(biāo)是hpiv-3和hpiv-1的血凝素-神經(jīng)氨酸酶。已經(jīng)獲得了與i-i70復(fù)合的hpiv-3hn的共晶結(jié)構(gòu)。所有以下化合物已經(jīng)在以下項目中測試：(i)針對hpiv-3(且i70也針對hpiv-1)的ni酶測定；(ii)使用hpiv-3評估了人細(xì)胞系a549細(xì)胞(腺癌人肺泡基底上皮細(xì)胞)的基于細(xì)胞的測定；(iii)化合物對a549細(xì)胞的細(xì)胞毒性試驗；和(iv)針對人神經(jīng)氨酸酶2的ni酶測定顯示沒有活性。如圖11所示，任何化合物在150μm下對a549細(xì)胞均未觀察到細(xì)胞毒性。如圖12所示，未觀察到對人neu2的活性。

表4：用于選擇二氟化化合物的基于酶和細(xì)胞的測定，其中i-57和i-40作為相應(yīng)的非氟化“en”化合物用于比較。

流感病毒唾液酸酶活性測定

在標(biāo)準(zhǔn)的96孔板形式中，通過使用來自流感a和b的唾液酸酶，可以使用熒光底物4-甲基umbelliferyln-乙?；?α-d-神經(jīng)氨酸苷(mun)通過potier等人的熒光方法(anal.biochem.1979,94,287-296)的改進(jìn)(biochim.biophys.acta1991,10,65-71)來測定合成的化合物抑制流感病毒唾液酸酶的能力。所有抑制測定可以在6個抑制劑濃度和0.1mmmun下一式三份進(jìn)行。具體而言，向冰上的96孔固體黑色板的每個孔中加入7μl50mm乙酸鈉-6mmcacl2緩沖液(ph5.5)，然后加入1μl抑制劑，1μl唾液酸酶，最后1μl的基底mun。然后將板短暫離心至1000rpm約10秒以組合所有組分，并且混合物可以在37℃下以900rpm振蕩培養(yǎng)20分鐘。為了終止反應(yīng)，可以向每個孔中加入250μl的0.25m甘氨酸(ph10)，并且在355nm激發(fā)和460nm發(fā)射下用victor3多標(biāo)簽讀取器(perkinelmer，沃爾瑟姆，馬塞諸塞州)讀取熒光(1s/孔)?？梢酝ㄟ^背景減法(陰性對照rf)處理數(shù)據(jù)，然后用graphpadprism4(graphpadsoftwareinc.，拉荷亞，加利福尼亞州)分析以計算ic50值(非線性回歸(曲線擬合)，劑量-反應(yīng)-抑制，3參數(shù)邏輯)。

流感a和b的原位細(xì)胞elisa

為了評價合成的化合物對流感a和流感b病毒的病毒生長抑制，在基于berkowitz和levin，1985(antimicrob.agentschemother,28,207-210)所述原理開發(fā)的并且被myc等人，1999(j.virol.methods77,165–177(1999))用于iav的原位細(xì)胞elisa中，mdck細(xì)胞將被流感a或流感b病毒感染。將補充有2mm谷氨酰胺和10％fbs的100μleagle的最小必需培養(yǎng)基(emem)中的mdck細(xì)胞接種在平底96孔微量滴定板上并培養(yǎng)過夜。第二天，去除培養(yǎng)基并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞。向孔中加入總共50μl的病毒接種物(40ffu/孔)，并在37℃，5％co2下培養(yǎng)1小時，每15分鐘輕輕攪拌。然后除去病毒接種物，并用100μl感染培養(yǎng)基(補充有2mm谷氨酰胺和3.0μg/mltpck處理的胰蛋白酶的emem)代替。如有必要，將感染的mdck細(xì)胞額外培養(yǎng)12-20小時，然后吸出培養(yǎng)基?？梢杂?.7％多聚甲醛的pbs溶液固定細(xì)胞。在測定當(dāng)天，洗滌固定的細(xì)胞，并用0.35％h2o2/pbs在37℃滅活內(nèi)源性過氧化物酶30分鐘。再次洗滌孔，并用50μl1.5mg/ml的小鼠單克隆抗流感a或抗流感b血凝素培養(yǎng)，并在37℃下培養(yǎng)45分鐘。用洗滌緩沖液(pbs和0.02％吐溫-20)洗滌細(xì)胞四次，并與50μl的1:2000稀釋的山羊抗-小鼠igg(h+l)hrp綴合物(biorad，ref.170-6516)在37℃下培養(yǎng)45分鐘。如先前一樣用洗滌緩沖液洗滌板，并向每個孔中加入100μlbdopteiatmb底物(bdbiosciences，圣何塞，加利福尼亞州)，然后可以在37℃培養(yǎng)孔板。

通過每孔加入50μl的1mh2so4可以在3-5分鐘后停止酶反應(yīng)。通過用victor3多標(biāo)簽讀取器(perkinelmer，沃爾瑟姆，馬塞諸塞州)在450nm下讀取每個孔的吸光度(od)0.1秒來獲得原始數(shù)據(jù)。通過從初始o(jì)d讀數(shù)中減去陰性對照(未感染細(xì)胞)od來獲得最終od，并且用graphpadprism4(graphpadsoftwareinc.，lajolla，ca)分析數(shù)據(jù)以計算ic50值(非線性回歸(曲線擬合))，劑量-反應(yīng)-抑制，4參數(shù)邏輯)。ic50值被認(rèn)為是與未處理的感染的細(xì)胞單層相比，將450nm處的吸光度降低50％的抑制劑的濃度。

可以對hpiv-3進(jìn)行基于原位細(xì)胞的elisa，其中小修改包括hpiv-1和3測試之間的差異，例如：第一抗體：小鼠單克隆抗-hpiv-3hn(fitzgerald，克隆m02122321)；小鼠單克隆抗-hpiv-1hn(lsbio，refls-c74109)；hpiv-3感染培養(yǎng)基：emem+2mm谷氨酰胺；hpiv-1感染培養(yǎng)基：emem+2mm谷氨酰胺+精選的tryple1.2％。

本發(fā)明化合物的hpiv-3ni和hpiv-1niic50值

通過如之前guillon，p等，naturecommunications(2014)中描述的標(biāo)準(zhǔn)測定方法測定第一方面的許多化合物的ic50值。下表是制備的化合物的ic50值，其中化學(xué)id與實驗表征部分中提供的那些參考和化合物結(jié)構(gòu)一致。

表5-測試化合物的hpiv-3和hpiv-1ic50值