專利名稱：抗動物病毒的抗病毒劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗動物病毒的抗病毒劑。更具體而言，本發(fā)明涉及含有 作為活性成分的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗動物病毒的抗病毒 劑，以及含有所述蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞， 所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力，并 且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
背景技術(shù)：
至今所開發(fā)的抗病毒劑大多為根據(jù)被感染的病毒類型表現(xiàn)出優(yōu)良抗 病毒活性且具有相對較低毒性的非蛋白藥物，所述抗病毒活性例如為病 毒吸附抑制、病毒穿透抑制、病毒脫殼抑制、病毒核酸轉(zhuǎn)錄(或翻譯) 抑制(例如，病毒胸苷激酶抑制、病毒反轉(zhuǎn)錄酶抑制、病毒聚合酶抑制
和病毒mRNA加帽抑制)和病毒蛋白合成抑制。
有數(shù)件專利與抗病毒藥物有關(guān)。例如，針對病毒轉(zhuǎn)錄抑制的韓國專 利申請第10-2001-0021449號公開了抑制在細(xì)胞核內(nèi)前病毒長末端重復(fù) 序列(LTR)上的RNA表達(dá)的融合蛋白。
美國專利第5,849,800號公開了與病毒脫殼有關(guān)的金剛胺。
美國專利第4,957,924號公開了作為抑制病毒核酸的生物合成的抗 病毒藥物的無環(huán)鳥苷。所述無環(huán)鳥苷是通過修飾核酸內(nèi)的糖來制備的藥 物且用于治療皰疹病毒感染。所述無環(huán)鳥苷與三磷酸脫氧鳥苷(dGTP)競 爭并加入病毒DNA中，由此終止DNA復(fù)制。
美國專利第5,108,993號和第5,026,687號分別公開了齊多夫定和雙 脫氧肌苷，它們是用于治療人類免疫缺陷病毒(HIV)感染的逆轉(zhuǎn)錄酶抑制 劑。
美國專利第5,962,725號公開了抑制HIV蛋白酶活性以防止HIV產(chǎn)生所需蛋白的奈非那韋(nelfmavir)。
此外，已知阿立酮和普來可那立是介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞結(jié)合然后穿 透并脫殼的抗病毒藥物。據(jù)報道，這些藥物抑制衣殼蛋白從RNA基因組
中脫殼。
已知三氟胸苷是引入到DNA中并由此導(dǎo)致在DNA復(fù)制過程中的突 變體生長的嘧啶類似物。已知膦甲酸與皰疹DNA聚合酶結(jié)合而抑制DNA 復(fù)審ij。己知利巴韋林和尼普蘭諾辛A(neoplanocin A)是抑制mRNA帽結(jié)構(gòu) 的形成而抑制RNA合成的鳥苷和腺苷類似物。
其它抗病毒藥物如沙奎那韋、利托那韋和茚地那韋抑制HIV蛋白酶 活性而防止HIV產(chǎn)生所需蛋白。
然而，這些抗病毒藥物具有副作用，如潛在感染率的增加和在短期 內(nèi)耐藥病毒株的連續(xù)出現(xiàn)(Magden等，Appl Microbiol Biotechnol 66:612-621, 2005)。
稱作免疫蛋白的抗體廣泛用于治療病毒疾病。但是，抗體的臨床使 用局限于涉及抗體對抗特定病毒的中和機(jī)制的被動免疫。例如，已知的 巾白利珠單抗(palivizumab)(Cardenas等，Expert Rev Anti Infect Ther 3:719-726, 2005)針對存在于呼吸道合胞病毒(RSV)包膜內(nèi)的F-糖蛋白的 A抗原位點(diǎn)內(nèi)的表位。
美國專利第6，818，216號公開了一種新型抗RSV抗體，由于所述抗 體與傳統(tǒng)抗RSV抗體相比具有更優(yōu)異的親和力，因而可以以低劑量施用。
然而，這些抗體的根本性問題在于，由突變體在基因抗原結(jié)構(gòu)上的 改變抑制了抗體繼續(xù)識別所述抗原，因此無法實(shí)現(xiàn)對抗原具有特異性的 所述抗體的抗病毒活性。
造成這一問題的原因在于，抗病毒抗體的開發(fā)針對的是病毒基因產(chǎn) 物。作為解決該問題的一個替代方案是開發(fā)出病毒核酸靶向抗體。然而， 目前還未有與所述替代方案的抗體有關(guān)的報道。核酸酶據(jù)報道是降解核 酸的酶。核酸酶轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞中對于該細(xì)胞而言是非常具有細(xì)胞毒性 的，因而引起細(xì)胞死亡這一根本性問題。這種問題不可避免地限制了病 毒核酸靶向抗體的開發(fā)。同時，僅有少數(shù)稱作催化抗體的抗體蛋白在與抗原結(jié)合的同時對該
抗原表現(xiàn)出酶促活性。某些抗DNA抗體、抗RNA抗體和抗DNA/RNA 抗體稱作天然產(chǎn)生的催化抗體(Buneva等，Appl Biochem Biotechnol 75: 63-76， 1998; Jang等，cell Mol Life Sci 60:309-320， 2003)。
另夕卜，本領(lǐng)域內(nèi)已知的唯一抗DNA催化抗體是BV04-01， BV04-01 具有基于重組單鏈可變片段(scFv)的結(jié)構(gòu)，并且表現(xiàn)出作為降解單鏈和雙 鏈DNA的抗DNA催化抗體的催化活性(Gololobov等，Mol Immunol 34:1083-1093， 1997)。
然而，對BV04-01的RNA酶活性、在動物細(xì)胞上的抗病毒活性和 對自衍生的核酸的保護(hù)可能性根本沒有報導(dǎo)
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題
本發(fā)明的一個方面是提供一種新型抗病毒劑，所述抗病毒劑具有對 侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本 身沒有細(xì)胞毒性，因此不造成所述動物細(xì)胞的死亡。
本發(fā)明的另一個方面是提供一種抗病毒動物細(xì)胞，所述抗病毒動物 細(xì)胞具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性降解能力，并且對所述 動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性，因此不造成所述動物細(xì)胞的死亡。
技術(shù)方案
根據(jù)為實(shí)現(xiàn)上述方面的本發(fā)明的一個方面，提供了抗動物病毒的抗 病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入 動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞 本身沒有細(xì)胞毒性。
根據(jù)本發(fā)明的另一個方面，提供了一種抗動物病毒的抗病毒劑，所 述抗病毒劑含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對 侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性結(jié)合和降解能力，并且對所述動物 細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
根據(jù)本發(fā)明的又一個方面，提供了一種含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細(xì)胞，所述蛋白具有對引入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性 結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種含有作為活性成分的編碼蛋白 的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核 酸鏈的選擇性結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
有利作用
從上文可以明顯看出的是，本發(fā)明的抗病毒劑能選擇性地降解侵入 動物細(xì)胞的外來核酸鏈，并且對所述動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，因此表現(xiàn) 出所述宿主細(xì)胞能夠受到保護(hù)且能夠只除去所述外來核酸鏈的有利作用。


從如下詳細(xì)說明并結(jié)合附圖將可以更清晰地理解本發(fā)明的上述和其 它方面、特性和其它優(yōu)點(diǎn)，其中
圖1顯示了本發(fā)明的3D8 scFv蛋白的VH、VL和接頭的堿基和核酸 序列(由"方框"表示的部分對應(yīng)于所述接頭的序列)；
圖2顯示了在細(xì)菌中表達(dá)的本發(fā)明的3D8 scFv、 3D8 VH和3D8 VL 蛋白的表達(dá)載體圖3顯示了確定表達(dá)在細(xì)菌中并純化的本發(fā)明的3D8 scFv、 3D8 VH 和3D8 VL蛋白的純度的SDS-PAGE分析結(jié)果；
圖4顯示了確定以單體形式存在的本發(fā)明的VH和VL蛋白的HPLC 結(jié)果；
圖5顯示了確定本發(fā)明的VH和VL之間的關(guān)聯(lián)的表面等離子共振 (SPR)分析結(jié)果；
圖6顯示了確定本發(fā)明的3D8 scFv、 VH和VL抗體蛋白與具有不同 堿基序列的ssDNA和dsDNA的親和力的表面等離子共振(SPR)分析結(jié) 果；
圖7顯示了在不同濃度的NaCl存在下的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA) 結(jié)果，該結(jié)果確定了本發(fā)明的3D8 scFv、 VH和VL抗體蛋白與DNA的結(jié)合主要由靜電力造成；
圖8 10顯示了瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，該結(jié)果確定了本發(fā)明的3D8 scFv、 VH和VL蛋白的雙鏈(ds(N)4o)DNA降解活性取決于Mg"和反應(yīng)時 間(在圖8和圖9中，"B"是用作對照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理 組；"E"是EDTA處理組，"M"是標(biāo)記；"rc，'是DNA的"松弛環(huán)形形式"的 縮寫；"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式" 的縮寫并指完全螺旋DNA);
圖11顯示了原位丙烯酰胺凝膠測定結(jié)果，該結(jié)果確定了本發(fā)明的 3D8 scFv、 VH和VL蛋白的dsDNA降解活性基于所述蛋白的固有性質(zhì) ("Etbr處理組"是對比數(shù)據(jù)結(jié)果的黑白色的組，其中深色位置是DNA 不與Etbr反應(yīng)的位置)；
圖12顯示了親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA， affinity-linked oligonucleotide nuclease assay)結(jié)果，該結(jié)果確定了本發(fā)明的 3D8 scFv、 VH和VL蛋白的DNA酶活性對堿基序列不具有特異性；
圖13顯示了由X射線衍射分析的本發(fā)明的3D8 scFv蛋白晶體的結(jié)
構(gòu)；
圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的3D8 scFv蛋白晶體和作為傳統(tǒng)抗DNA催 化抗體的BV04-01的重疊結(jié)構(gòu)；
圖15顯示了本發(fā)明的3D8 VH蛋白晶體的結(jié)構(gòu)；
圖16顯示了本發(fā)明的3D8 VL蛋白晶體的結(jié)構(gòu)；
圖17顯示了酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)結(jié)果，該結(jié)果確定了 scFv突 變體的DNA結(jié)合能力和DNA酶活性，在所述突變體中，兩個組氨酸(His) 殘基由丙氨酸取代(黑柱dS-(dN:dN')4o，白柱Ss-(dN)40);
圖18顯示了確定scFv突變體的DNA酶活性的瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果，在所述突變體中，兩個組氨酸(His)殘基由丙氨酸取代("B"是用作對 照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理組；"E"是EDTA處理組，"M"是標(biāo) 記；"rc"是DNA的"松弛環(huán)形形式"的縮寫；"lin"是"線性形式"的縮寫并 指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA);
圖19顯示了確定3D8 VH突變體和3D8 VL突變體的DNA結(jié)合能力變化的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)結(jié)果，在所述突變體中，兩個組氨酸
(His)殘基由丙氨酸取代(黑柱ds-(dN:dN')恥，白柱SS-(dN)40);
圖20顯示了瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，該結(jié)果確定了 3D8 VH突變體和 3D8 VL突變體的DNA酶活性變化，在所述突變體中， 一個組氨酸(His) 殘基由丙氨酸取代("B"是用作對照組的BSA蛋白；"Mg"是Mg"處理組； "E"是EDTA處理組，"M"是標(biāo)記；"rc"是DNA的"松弛環(huán)形形式"的縮寫； "lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并 指完全螺旋DNA);
圖21顯示了瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果，該結(jié)果根據(jù)反應(yīng)時間確定了本發(fā) 明的scFv蛋白的RNA酶活性；
圖22顯示了原位水解測定，其中確定了本發(fā)明的3D8 scFv蛋白的 RNA酶活性是歸因于所述蛋白的固有性質(zhì)("Etbr處理組"是對比數(shù)據(jù)結(jié) 果的黑白色的組，其中深色位置是RNA不與Etbr反應(yīng)的位置)；
圖23顯示了親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)結(jié)果，該結(jié)果 確定了本發(fā)明的3D8 scFv蛋白的RNA酶活性不依賴于Mg2+;
圖24和圖25顯示了熒光顯微鏡圖像，其中確定了轉(zhuǎn)移進(jìn)vero細(xì)胞 的本發(fā)明的3D8 scFv蛋白表現(xiàn)出對水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活 性("3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"， "VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經(jīng)VSV處理")；
圖26和27顯示了熒光顯微鏡圖像，確定了轉(zhuǎn)移進(jìn)vero細(xì)胞的本發(fā) 明的3D8 scFv蛋白表現(xiàn)出對水泡性口炎病毒(VSV)增殖的抑制活性 ("3D8-"指"不含3D8scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"， "VSV-，，指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經(jīng)VSV處理")；
圖28顯示了 MTT測定結(jié)果，該結(jié)果確定了通過VSV感染的細(xì)胞病 變效應(yīng)(CPE)是否在引入了 3D8scFv、 3D8VH、 3D8VL或其它蛋白的各 個vero細(xì)胞上被抑制；
圖29顯示了共聚焦顯微鏡的免疫熒光染色結(jié)果，該結(jié)果確定了在其 中轉(zhuǎn)移有3D8 scFv、VH和VL蛋白的各個HeLa細(xì)胞上的VSV增殖抑制 活性("3D8-，，指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"，"vsv-"指"未用vsv處理"，而"vsv+"指"經(jīng)vsv處理")；
圖30是其中克隆有3D8 scFv基因的動物細(xì)胞表達(dá)載體的示意圖31顯示了 RT-PCR結(jié)果，該結(jié)果確定了 3D8 scFv mRNA在其中 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有3D8 scFv基因的NIH/3T3細(xì)胞中順利表達(dá)；
圖32顯示了使用TRITC的免疫熒光染色測定的結(jié)果，該結(jié)果確定 了 3D8 scFv mRNA在其中穩(wěn)定轉(zhuǎn)染有3D8 scFv基因的NIH/3T3細(xì)胞中 的表達(dá)("a"是顯示不含3D8 scFv的NIH/3T3細(xì)胞的圖像，而"b"是顯示 經(jīng)3D8 scFv轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞的圖像)；
圖33是顯示了 RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結(jié)果確定 3D8 scFv mRNA在經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞系中的表達(dá)；
圖34顯示了流式細(xì)胞測定結(jié)果，該結(jié)果確定3D8 scFv蛋白在代表 性轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞系中的表達(dá)；
圖35是顯示RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結(jié)果確定3D8 scFvmRNA在經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞中的表達(dá)；
圖36顯示了 MTT測定結(jié)果，該結(jié)果確定VSV引起的細(xì)胞病變效應(yīng) (細(xì)胞死亡)是否在表達(dá)3D8 scFv蛋白的NIH/3T3細(xì)胞中被抑制；
圖37顯示了熒光顯微鏡測定結(jié)果，該結(jié)果確定VSV引起的細(xì)胞病 變效應(yīng)(細(xì)胞死亡)是否在表達(dá)3D8scFv蛋白的HeLa細(xì)胞中被抑制；
圖38顯示了胞內(nèi)染色結(jié)果，該結(jié)果確定了CSFV (典型豬瘟病毒) 的增殖在經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞內(nèi)被抑制；
圖39顯示了 MTT測定結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白的HeLa 細(xì)胞的定量抗VSV活性；
圖40顯示了熒光顯微鏡測定結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白 的HeLa細(xì)胞的抗VSV活性(細(xì)胞死亡抑制)；
圖41顯示了顯微鏡測定結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白的HeLa 細(xì)胞的抗ADV活性(細(xì)胞死亡抑制)；和
圖42顯示了顯示RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結(jié)果確 定經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞系的ADV病毒增殖抑制活性。
具體實(shí)施例方式
現(xiàn)在將參考附圖更詳細(xì)地對本發(fā)明進(jìn)行說明。
本發(fā)明提供了含有作為活性成分的本發(fā)明的蛋白或編碼所述蛋白的 核酸序列的抗病毒劑，以及含有作為活性成分的本發(fā)明的蛋白或編碼所 述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞。
在一方面，本發(fā)明涉及含有作為活性成分的蛋白的抗動物病毒的抗
病毒劑，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的選擇性結(jié)合和降 解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性，本發(fā)明還涉及含有作 為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗動物病毒的抗病毒劑，所述蛋白 具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對所述動物 細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細(xì) 胞，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并 且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性，本發(fā)明還涉及含有作為活性成分 的編碼蛋白的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞，所述蛋白具有對侵入動物細(xì) 胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞 毒性。
根據(jù)本發(fā)明，用于所述抗病毒劑和抗病毒動物細(xì)胞的蛋白必須能與 外來核酸鏈結(jié)合并降解所述核酸鏈，同時對所述動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。
作為符合這些要求的蛋白的一個實(shí)例，評估了經(jīng)分離并純化的3D8 蛋白的抗動物病毒的抗病毒活性。如從下列實(shí)施例1中戶萬能見到的，評
估結(jié)果表明所述3D8蛋白展示了抗動物病毒的抗病毒活性且沒有細(xì)胞毒性。
本文所用術(shù)語"對外來核酸鏈的結(jié)合能力"指蛋白能識別核酸(如
DNA禾nRNA)鏈并與所述核酸鏈結(jié)合的能力。蛋白與核酸鏈的結(jié)合基于 在構(gòu)成蛋白的氨基酸中的正電荷與DNA或RNA的磷酸主鏈中的負(fù)電荷 之間的偶聯(lián)。
抗核酸抗體和核酸酶通常通過識別DNA或RNA的特定序列來結(jié)合 所述DNA或RNA。如從實(shí)驗(yàn)例2和5中可以明顯看出，本發(fā)明的蛋白與核酸鏈結(jié)合而沒有任何序列特異性，因此廣泛用在與核酸降解活性相 關(guān)的研究領(lǐng)域。
本文所用術(shù)語"對外來核酸鏈的降解能力"指蛋白能夠通過水解切
割諸如DNA和RNA等核酸鏈的能力。該術(shù)語也叫做"催化能力"。
同時，本文所用術(shù)語"細(xì)胞毒性"指細(xì)胞被侵入性外來材料殺死的
現(xiàn)象。DNA酶(DNA降解酶)和RNA酶(RNA降解酶)通常具有細(xì)胞 毒性。
另一方面，本發(fā)明的蛋白的特征在于對自身衍生的細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性。
編碼具有對引入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力且對^f述 動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的蛋白的核酸序列可為RNA或DNA序列。從穩(wěn) 定性角度考慮，優(yōu)選的是DNA序列。
所述DNA序列可為被引入能在動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的載體中的核 酸序列。如實(shí)施例4所能確定的，在動物細(xì)胞內(nèi)具有這樣的DNA序列的 基因的引入導(dǎo)致蛋白的有效表達(dá)和有效抗病毒活性的展現(xiàn)。
優(yōu)選的是，用于本發(fā)明的抗病毒劑和抗病毒動物細(xì)胞的蛋白獲自誘 發(fā)了自身免疫疾病的動物，所述蛋白能結(jié)合侵入性核酸鏈并降解所述核 酸鏈且對動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性。這就是與核酸結(jié)合或反應(yīng)的蛋白 己知與自身免疫疾病密切相關(guān)的原因。在本發(fā)明中，對于所述動物沒有 特別限制?？梢允褂萌魏蝿游锒鴽]有特別限制，只要所述動物自然地誘 發(fā)自身免疫疾病即可。優(yōu)選的是使用小鼠。
在對所述動物誘發(fā)出自身免疫疾病的基因中，優(yōu)選的是功能異常的 // r基因。
具有功能異常//^基因的動物易患上自身免疫疾病。因此，具有對外 來核酸鏈的結(jié)合和降解能力同時對動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的蛋白可以容 易地從所述/;^基因功能異常的動物中獲取。
爾r基因介導(dǎo)了造成凋亡的主要因素之一的Fas蛋白的產(chǎn)生。Fas蛋 白在細(xì)胞表面介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。當(dāng)Fas蛋白被激活時，細(xì)胞開始執(zhí)行凋亡 機(jī)制。另一方面，當(dāng)//^基因受損時，F(xiàn)as蛋白的形成被抑制，并且由此使正常細(xì)胞凋亡不會發(fā)生。該機(jī)制抑制了能攻擊自身細(xì)胞的淋巴細(xì)胞的 去除，因此導(dǎo)致自身免疫疾病。
作為能結(jié)合侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈并降解所述核酸鏈且對所述 動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的蛋白，可以使用具有對外來核酸鏈的特異性結(jié) 合和降解能力的免疫球蛋白或其片段。所述免疫球蛋白可以優(yōu)選為免疫
球蛋白G(IgG)。更具體而言，所述IgG可為3D8蛋白。
本文所用"免疫球蛋白"是在免疫中起重要作用且發(fā)揮抗體的作用 的血清成分的蛋白總稱。這些免疫球蛋白由通過二硫鍵相連的一對分子
量約為23,000的輕鏈(CL)和一對分子量約為50,000 70,000的重鏈(CH) 構(gòu)成。由y、 (x、 p、 S和e表示的重鏈類型確定了抗體類別，例如分別為 IgG、 IgA、 IgM、 IgD禾口IgE。
IgG由一對分子量約為25,000的輕鏈和一對分子量約為50,000的重 鏈構(gòu)成，且總分子量為150,000。
IgG是在高等動物(兩棲動物或更高等)中很重要的免疫球蛋白， 占整個人類免疫球蛋白的約70%，通過胎盤并表現(xiàn)出各種抗體活性。
同時，任何免疫球蛋白片段可以單獨(dú)使用或作為它們的組合使用， 只要它能結(jié)合核酸鏈并降解所述核酸鏈。優(yōu)選的是選自scFv、 VH、 VL 以及與VH和VL結(jié)合的Fv的片段。
scFv (單鏈可變片段)是通過接頭連接的可變重鏈(VH)和可變輕鏈 (VL)的融合體。已知這種scFv與單獨(dú)使用的VH或VL相比具有強(qiáng)的抗 原結(jié)合力。介導(dǎo)VH和VL之間的結(jié)合的接頭可為本領(lǐng)域內(nèi)常用的任何類 型。
如上所述，已知VH或VL的抗原結(jié)合力通常弱于scFv的抗原結(jié)合 力。然而，在打算改善進(jìn)入組織的滲透性的某些情形中，仍優(yōu)選VH或 VL。
優(yōu)選的是，所述scFv可具有如SEQIDN0 6所示的序列，所述VH 可具有如SEQ ID NO 2所示的序列，而所述VL可具有如SEQ ID NO 4 所示的序列。
在本發(fā)明的蛋白所需的核酸鏈結(jié)合能力和核酸鏈降解能力方面，任何蛋白只要具有對RNA的特異性結(jié)合/降解能力或?qū)NA的特異性結(jié)合 /降解能力，都可用來獲得本發(fā)明所想要的效果。因此具有僅對RNA鏈 的特異性結(jié)合和降解能力的蛋白只能應(yīng)用于RNA病毒，而具有僅對DNA 鏈的特異性結(jié)合和降解能力的蛋白只能應(yīng)用于DNA病毒。
更優(yōu)選的是使用對DNA和RNA鏈都具有結(jié)合和降解能力的蛋白， 因?yàn)樗鼈儗NA病毒和DNA病毒均可以使用。
在本發(fā)明中，對侵入動物細(xì)胞的病毒沒有特別限制。具體而言，所 述病毒可為基于RNA的病毒，更具體而言，所述病毒可為HIV病毒(人 類免疫缺陷)或SARS(嚴(yán)重急性呼吸道綜合征)病毒。
在對確定具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力 且對所述動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性的蛋白是否表現(xiàn)出如上所述的抗動 物病毒的抗病毒活性的嘗試中，使用根據(jù)制備例1的方法獲得的3D8抗 體(IgG)的VH、 VL和scFv域作為一個實(shí)例。根據(jù)制備例2的方法從3D8 雜交瘤細(xì)胞中獲得了所述VH、 VL和scFv域抗體。將這些抗體在大腸桿 菌內(nèi)過表達(dá)并純化后使用。
在實(shí)驗(yàn)例1中，研究了 VH和VL蛋白的存在形式和它們之間的結(jié) 合。研究結(jié)果確定，VH和VL蛋白均以單體而不是以多聚體形式存在， 且VH和VL彼此自然結(jié)合形成Fv。
在實(shí)驗(yàn)例2中，研究了所述VH、 VL和scFv蛋白的DNA結(jié)合能力 和特性。從評估結(jié)果中可確定的是，所有這三種抗體蛋白(scFv、 VH和 VL蛋臺)具有相當(dāng)高的與ssDNA和dsDNA的結(jié)合力。scFv的DNA結(jié) 合親和力比VH和VL的DNA結(jié)合親和力高出100倍 1,000倍。該結(jié) 果顯示，VH和VL域共存的蛋白的DNA親和力要優(yōu)于單獨(dú)存在VH和 VL域的蛋白的DNA親和力。
在實(shí)驗(yàn)例3中，評估了所述VH、 VL和scFv抗體蛋白的DNA降解 活性和底物特異性。在鎂離子(MgS+)的存在下，所述抗體蛋白的DNA酶 活性的順序?yàn)閟cFv〉VL》VH。另一方面，在EDTA存在下，所有蛋白 的DNA酶活性都被抑制。具體而言，從瓊脂糖凝膠電泳測定中確定了隨 著時間的推移，所述蛋白降解了 ss M13mpl8 DNA以及ds M13mpl8DNA。
使用親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)來探查DNA酶活性 的底物特異性。所述scFv、 VH和VL蛋白基本沒有表現(xiàn)出在DNA酶活 性方面的DNA底物特異性。
從實(shí)驗(yàn)例4中確定了 scFv、 VH和VL蛋白通過不同機(jī)理降解DNA。
作為具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力且對 所述動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性的蛋白的一個實(shí)例，使用3D8scFv蛋白 來評估RNA酶活性。作為實(shí)驗(yàn)例5的結(jié)果，可以確定的是，所述scFv 蛋白表現(xiàn)出對dsRNA和ssRNA的RNA酶活性，并取決于反應(yīng)時間。所 述底物特異性測定結(jié)果表明，scFv抗體蛋白在RNA酶活性方面能夠降解 RNA/DNA雜交體以及ssRNA和dsRNA。
在實(shí)施例1中，在用水泡性口炎病毒對注射了 3D8scFv蛋白的動物 細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染后，證實(shí)了 3D8scFv蛋白抗所述病毒的抗病毒活性。結(jié)果， 可以證實(shí)的是，其中沒有引入3D8 scFv蛋白的動物細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞死亡 (細(xì)胞死亡是由VSV導(dǎo)致的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)之一)(圖24)，然而其 中引入了 3D8 scFv蛋白的動物細(xì)胞不管進(jìn)行VSV感染與否都仍然存活。 此外，在HeLa細(xì)胞(人類宮頸癌細(xì)胞系)上觀察到了所述3D8 scFv蛋 白的細(xì)胞死亡抑制活性。
其中沒有感染VSV的轉(zhuǎn)移有3D8 scFv蛋白的Hela細(xì)胞沒有所述 3D8scFv蛋白所固有的細(xì)胞毒性。另一方面，作為對照組的轉(zhuǎn)移有RNA 酶A的Hela細(xì)胞(未轉(zhuǎn)染有VSV)由于所述RNA酶A所固有的細(xì)胞毒 性而全部死亡。
這些結(jié)果表明，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性顯著大于傳統(tǒng)核酸 酶的抗病毒活性，而具有對引入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降 解能力同時對所述動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性的蛋白展現(xiàn)了抗動物病毒 的抗病毒活性。
從實(shí)施例2所獲得的結(jié)果確定，3D8 VH和VL蛋白以及3D8 scFv
蛋白展現(xiàn)出抗動物病毒的抗病毒活性。
即使在編碼具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力且對所述動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性的蛋白的核酸序列侵入動物細(xì)胞的情 形中，也證明了所述核酸序列展示出抗病毒感染的動物細(xì)胞的抗病毒活
性。具體而言，從實(shí)施例4可以證實(shí)，3D8 scFv基因轉(zhuǎn)染的動物細(xì)胞也 產(chǎn)生scFv蛋白，而且還表現(xiàn)出抗多種病毒的抗性。
下文中將給出本發(fā)明的抗動物病毒的抗病毒劑的配制和使用方法。 <配制和施用含有作為活性成分的蛋白的抗動物病毒的抗病毒劑，
所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對
所述動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性>
含有本發(fā)明的蛋白作為活性成分的抗動物病毒的抗病毒劑能夠選擇
性地降解侵入的外來核酸鏈，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
具體而言，本發(fā)明的抗病毒劑能夠只除去侵入性外來病毒而不殺死自身
細(xì)胞，因此可用于病毒介導(dǎo)的疾病，如獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)。 更具體而言，所述疾病的治療影響了受病毒感染的細(xì)胞，并因此防止了 所述細(xì)胞的死亡。
本發(fā)明的抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入 動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本 身沒有細(xì)胞毒性。
"含有作為活性成分的蛋白的抗病毒劑"這一表述是指，以使所述 蛋白能發(fā)揮所需抗病毒活性的量將所述蛋白添加到所述抗病毒劑中，并 且在光一上是指，所述蛋白與各種用于遞送和穩(wěn)定藥物的佐劑一起配制 為多種劑型。
優(yōu)選的是，所述蛋白可包括具有對外來核酸鏈的結(jié)合/降解能力的免 疫球蛋白或其片段。更優(yōu)選的是，所述免疫球蛋白可為免疫球蛋白G (IgG)。最優(yōu)選的是，所述IgG可為3D8蛋白。優(yōu)選的是，所述免疫球蛋 白片段可為選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結(jié)合的Fv中的片段。
本發(fā)明的抗病毒劑還可包含藥用載體或添加劑(一般而言，緩沖劑 溶液、等滲溶液或水性懸浮液等，并且可選的是穩(wěn)定劑或防腐劑等)。制 劑通常包含鹽水和可選的經(jīng)保護(hù)或穩(wěn)定處理的分子，如高分子量蛋白(例 如，人類血清白蛋白)。將具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力且對所述動 物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性的蛋白(優(yōu)選為IgG或其片段)，以使得所述蛋 白"有效"或"對治療有效"的劑量施用于受體。
施用于受體的蛋白的有效劑量可在約O.l mg/kg 約20 mg/kg范圍 內(nèi)。 一般而言，蛋白的有效劑量根據(jù)各種因素如蛋白類型(例如，整個 IgG或其片段)、親和力和具體治療蛋白的個體特性來確定，并且取決于 藥代動力學(xué)參數(shù)。因此，本發(fā)明的蛋白的有效劑量可取決于這些不同的 因素。
根據(jù)本發(fā)明的主要實(shí)施方式，含有蛋白的抗病毒劑的使用能使所述 治療蛋白即使以低劑量施用也能實(shí)現(xiàn)所需的療效。
此外，本發(fā)明的治療蛋白的使用(例如，劑量和處方設(shè)計)可能受 到不希望的副作用(例如，發(fā)熱、頭疼、氣喘和血壓降低等)的限制。
于是，對患者施用的治療蛋白的標(biāo)準(zhǔn)劑量可以根據(jù)患者的個體特性 而改變。在實(shí)踐中，熟練臨床醫(yī)師可以考慮例如具體必要性和患者的總 體狀況等因素來為患者設(shè)計出最優(yōu)選的治療策略(例如，最佳劑量和用 藥方案)。治療蛋白的合適劑量可根據(jù)各種基準(zhǔn)來確定。
根據(jù)本發(fā)明的一個實(shí)施方式，醫(yī)師可在逐漸減少治療蛋白的給定量 的同時，對患者施用本發(fā)明的含所述蛋白的抗病毒劑。在監(jiān)測了治療蛋 白的效能、病毒缺陷細(xì)胞的活性和各種治療癥狀，同時考慮劑量和施用 頻率后，可以控制治療蛋白的相對濃度和劑型以優(yōu)化療效并使副作用最 小化。
同時，本發(fā)明的治療蛋白通?？稍隗w外或通過動物模型確定。例如， 可以通過以下方法來確定最佳劑量，即，在體外將不同濃度的本發(fā)明的 治療蛋白引入目標(biāo)細(xì)胞(病毒感染細(xì)胞)中，然后評估所述目標(biāo)細(xì)胞的 死亡比例。
可通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、動脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮內(nèi)注射直接對受試對象 施用本發(fā)明的含有所述治療蛋白的抗病毒劑。
諸如利妥昔單抗(rituxan)(以RituximabTM的名稱銷售)和奧馬珠單 抗(omalizumab)(以XolairTM的名稱銷售)等單克隆抗體在臨床治療中有效且等價處方方案(即，制劑和/或劑量和/或用藥程序)可用于本發(fā)明 的含有所述治療蛋白的抗病毒劑。
本發(fā)明的抗病毒劑可與化學(xué)療法或治療病毒疾病的治療程序或其組 合聯(lián)合來同時使用或相繼使用。
<配制和施用含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗動物病 毒的抗病毒劑，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降 解能力，并且對所述動物細(xì)胞自身沒有細(xì)胞毒性>
可以使用數(shù)個單獨(dú)的表達(dá)載體或單個表達(dá)載體來進(jìn)行DNA序列的 表達(dá)，如編碼蛋白的核酸序列的表達(dá)。
優(yōu)選的是，根據(jù)本發(fā)明的核酸序列編碼的蛋白包括具有對外來核酸 鏈的結(jié)合/降解能力的免疫球蛋白或其片段。更優(yōu)選的是，所述免疫球蛋
白可為免疫球蛋白G(IgG)。最優(yōu)選的是，所述IgG可為3D8蛋白。此外， 所述免疫球蛋白片段可為選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結(jié)合的 Fv中的核酸編碼的免疫球蛋白片段。
如果分別對各個序列采用單一載體，可在注射和電穿孔前將所述載 體混合以便允許個體肌肉細(xì)胞攜帶上和表達(dá)各所述載體。
本文所用術(shù)語"表達(dá)載體"指通過編碼多肽的核酸的插入或合并來 操作且能在所述載體處于適當(dāng)環(huán)境中時指導(dǎo)所述多肽的表達(dá)的質(zhì)?；蛎?介物。
合適的表達(dá)載體通常包含啟動子、復(fù)制起點(diǎn)、聚A識別序列和核糖 體識別位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，且可包含諸如增強(qiáng)子等其它調(diào)控元 件(組織特異性)。
幫助所插入的編碼核酸序列在肌肉內(nèi)有效轉(zhuǎn)錄的啟動子可以為組成 型，或如果需要時可為誘導(dǎo)型、組織特異型或發(fā)育階段特異型。可用于 本發(fā)明的啟動子的實(shí)例包括通常在肌肉內(nèi)發(fā)揮功能的啟動子，如骨骼肌 動蛋白基因啟動子(Muscat等，Mol. Cell. Biol. 7, 4089 (1989))、肌肉肌酸 激酶啟動子(Sternberg等，Mol. Cell. Biol., 8, 2896 (1988))和肌球蛋白輕鏈 增強(qiáng)子/啟動子(Donoghue等，Proc. Natl. Acad. Sci, USA 88, 5847 (1991》。
優(yōu)選的表達(dá)載體包含具有多個核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)的表達(dá)盒，所述核酸內(nèi)切酶限制位點(diǎn)允許編碼不同多肽的DNA以將所述編碼DNA與啟
動子或載體的其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件操作性地連接的方式容易地克隆到所述 表達(dá)盒內(nèi)。優(yōu)選的表達(dá)載體還可具有用于原核細(xì)胞的復(fù)制起點(diǎn)和至少一 個選擇性標(biāo)記以幫助克隆到這類細(xì)胞中。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員了解如何 通過選擇用于在肌肉中表達(dá)的多肽的正確配置有啟動子、增強(qiáng)子和其他 轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控元件的適當(dāng)組合的載體來優(yōu)化表達(dá)。
本發(fā)明的方法學(xué)允許分別來自骨骼肌、平滑肌和心肌的多鏈蛋白表 達(dá)。優(yōu)選的是骨骼肌注射后的表達(dá)，因?yàn)樵摷∪鈦碓簇S富且易于獲得。 對于骨骼肌，所述表達(dá)載體可以通過傳統(tǒng)方式(如注射器和針)或通過 無針注射裝置經(jīng)皮膚注射進(jìn)入所述骨骼肌。后一類裝置在本領(lǐng)域內(nèi)是熟 知的，并且通常涉及通過緊貼皮膚保持的微孔的壓力輔助輸送。
可參考授予Morrow等的美國專利第4,596,556號、授予Parsons的 美國專利第4,913,699號和授予Castellano等的美國專利第5,730,723號適 當(dāng)?shù)剡x擇注射裝置。另一種可商購獲得的注射裝置是BIOJECT (來自 Bioject Medical Technologies, Inc., Portland Oregon U.S.A.)。另——禾中無針注 射裝置是使用加壓氣體來作為氣壓功能而將小顆粒(例如，金顆粒)輸 送到目標(biāo)皮膚位點(diǎn)的基因槍輸送系統(tǒng)。生物導(dǎo)彈輸送裝置的實(shí)例是 PDS-1000 "基因槍"(由美國Dupont， Inc., Wilmington, Delaware銷售)。
表達(dá)載體可以在0.9%的氯化鈉中施用，然而，可以加入各種溶劑和 賦形劑而不影響表達(dá)水平。例如，本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的是，蔗糖能增加 在骨骼肌中的DNA吸收。
可以根據(jù)熟知方法，將本發(fā)明的表現(xiàn)出抗動物病毒的抗病毒效能的 動物細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)用途和細(xì)胞藥物。
本發(fā)明的方式
參考下列實(shí)例(制備例、實(shí)驗(yàn)例和實(shí)施例)來對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì) 的說明。本發(fā)明的范圍不必限于這些實(shí)例且旨在包括利用等效技術(shù)思想 的修改。
實(shí)施例
制備例l: 3D8雜交瘤細(xì)胞系的建立利用聚乙二醇(PEG) 4000融合MRL-/;^//;^小鼠的脾細(xì)胞(來自美國 Jackson Laboratory)和V653細(xì)胞(來自韓國細(xì)胞系庫)并在37。C于5% C02培養(yǎng)箱中的次黃嘌呤-氨基喋呤-胸苷(HAT)培養(yǎng)基(來自 Sigma-Aldrich,Inc.)中培養(yǎng)15天。在培養(yǎng)期間，通過酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA)選擇具有DNA結(jié)合能力的抗體。
通過有限稀釋法將所述細(xì)胞系培養(yǎng)兩次，以獲得約十種分泌抗DNA 抗體的雜交瘤細(xì)胞系。通過ELISA從所述雜交瘤細(xì)胞系中選出顯示出最 大DNA結(jié)合能力的分泌抗DNA抗體的細(xì)胞系。將所選的細(xì)胞系在2006 年9月13日存到韓國細(xì)胞系研究基金會(KCLRF， Korean Cell Line Research Foundation)(登錄號KCLRF畫BP-00146)。
使用同種型檢測定劑盒(Pierce,Inc.)檢測出所選的雜交瘤細(xì)胞系分泌 的抗體的同種型。結(jié)果，確定從所述細(xì)胞系衍生的抗體是IgG2a/K并稱為 "3D8"。
制備例2:克隆來自3D8雜交瘤細(xì)胞系的重鏈(VH)和輕鏈(VL)可變
域基因
將約1 X 106的獲自制備例1的雜交瘤細(xì)胞溶解于0.2 mL的RNA提 取試劑中(RNAzol BTM; TEL-TEST, Inc.)并均化。在所述溶液中加入0.02 mL 氯仿，徹底攪拌15秒，然后讓其在冰浴中靜置5分鐘。離心所得溶液， 然后分離所得上清液。向殘留物中加入0.25 mL乙醇，讓其在4t:靜置 15分鐘，然后離心(12000 g， 4°C)15分鐘。所得RNA沉淀用70%乙醇洗 滌、干燥并溶解于重蒸水中。測量所述RNA在260 nm和280 nm處的吸 光度，并確定所述RNA的純度和產(chǎn)量。
使用RT-PreMix試劑盒(Bioneer Inc.)由如此獲得的RNA合成cDNA。 此時，使用寡聚(dT)寡核苷酸作為引物。使用所述cDNA作為模板，用 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)方法擴(kuò)增VH和VL基因。
用于VH基因擴(kuò)增的引物組如下
正向5'畫ATGGGATGGAGCTRTATCATSYTCTT-3' (SEQ ID NO 7) 反向5'-TGGATAGACAGATGGGGGTGTCGTTTTGGC匿3' (SEQ ID NO 8)使用Taq DNA聚合酶通過降落PCR對所述VH基因進(jìn)行30個循環(huán) 的擴(kuò)增。(每個循環(huán)中的)降落PCR條件如下94。CX1分鐘-> 每個循 環(huán)(從初始退火溫度(65。C))降低0.5。CX1分鐘)72'CX1分鐘。
用于VL基因擴(kuò)增的引物組如下
正向5'-ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTGTGTCTC畫3' (SEQ ID NO 9)
反向5'-GGATGGTGGGAAGATGGATAC-3' (SEQ ID NO 10)
使用Taq DNA聚合酶通過降落PCR對所述VL基因進(jìn)行30個循環(huán) 的擴(kuò)增。(每個循環(huán)中的)降落PCR條件如下94"CX1分鐘-> 每個循 環(huán)(從初始退火溫度(63。C))降低0.3'CX1分鐘)72。CX1分鐘。
用"/。瓊脂糖凝膠對各自的PCR反應(yīng)溶液進(jìn)行電泳，并從所述凝膠 中提取了VH和VL基因，然后將它們克隆到pGEM-T Easy載體(來自 PromegaCorp.)中?？寺』虻膲A基序列由Perkin Elmer 373A自動DNA 測序儀(Applied Biosystems， Inc.)分析。
用于堿基序列分析的引物組如下
正向5'-CAAGCTGGGATTTAGGTG-3'(SEQ ID NO 11) 反向5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3'(SEQ ID NO 12)
從堿基序列分析結(jié)果中可以確定，所述VH基因的堿基序列與SEQ ID NO 1所示的序列相同，所述VH基因的氨基酸序列與SEQ ID NO 2 所示的相同，所述VL基因的堿基序列與SEQ IDNO 3所示的相同，而 所述VL基因的氨基酸序列與SEQ ID NO 4所示的相同。Blast搜索結(jié)果 確定至今尚未有這種堿基序列的報道。
制備例3: VH、 VL和scFv (單鏈片段可變)域基因在細(xì)菌表達(dá)載 體中的亞克隆
為在細(xì)菌中表達(dá)VH或VL蛋白，將在制備例2中所獲的VH和VL 基因克隆到plg20H和plg20L載體(來自美國Stollar BD教授，Tufts University)中。制備了含有作為限制酶識別位點(diǎn)的X顧I/Xk I片段的引 物并將其用于VH克隆。同時，制備了含有作為限制酶識別位點(diǎn)的 Bg/II/NcoI片段的引物并將其用于VL克隆。為構(gòu)造scFv構(gòu)建體，將分別克隆在pGEM-T Easy載體(Promega Corp.) 上的VH和VL基因相繼亞克隆在含有接頭DNA (解碼為"GGGGS3")的 plg20表達(dá)載體中(來自美國StollarBD教授，Tufts University)。此處所
用的引物的堿基序列如下
〈用于VH亞克隆的引物〉
正向5'-TCCCCCCGGGAGGTCCAGCTG-3' (SEQ ID NO 13) 反向5'-GCTCTAGAGGAGACGGT國3' (SEQ ID NO 14)
〈用于VL亞克隆的引物〉
正向5'-GAAGATCTTGTGATGTCA-3' (SEQ ID NO 15) 反向5'畫CATGCCATGGTGATGATGATGTTTTATTTCCAG-3' (SEQ ID NO 16)
作為所述亞克隆的結(jié)果，獲得了 plg20H-3D8 VH、 plg20L-3D8 VL 和pIg20-3D8 scFv載體(克隆在所述plg20載體中的scFv基因的堿基序 列如圖1所示，而所述plg20H-3D8 VH、pIg20L-3D8 VL和plg20-3D8 scFv 載體的圖如圖2所示)。所述scFv基因分別具有如SEQ ID NO 5所示的 堿基序列和如SEQ ID NO 6所示的氨基酸序列。
制備例4: 3D8重組scFv、 VH和VL抗體蛋白的表達(dá)和純化
為了純化VH、 VL和scFv蛋白，將plg20H-3D8 VH、 plg20L-3D8 VL 和plg20-3D8 scFv載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) pLysE細(xì)胞中(來自 Novagen Inc.)，并在含100嗎/mL的氨芐青霉素和20 pg/mL的氯霉素的 LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)直到吸光度(A600)達(dá)到0.8。在所述培養(yǎng)基中加入0.5 mM 異丙基-卩-D-硫代吡喃型半乳糖苷(IPTG)并在常溫下再培養(yǎng)4小時。將所 培養(yǎng)的細(xì)胞離心(10,000Xg， 4"C)10分鐘，然后將所得上清液經(jīng)0.45 pm 過濾膜過濾。使濾液以1 mL/分鐘的流動速率通過IgG-瓊脂糖柱 (Amersham pharmacia Biotech Ltd.)，用磷酸鹽緩沖液(PBS， pH 7.4)和乙酸 銨(pH 5.0)洗滌，然后用O.l M乙酸(pH 3.4)洗脫。將洗脫的蛋白用PBS 透析并在還原條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE)，以確定所述蛋白的純度。
圖3顯示了 VH、VL和scFv蛋白的SDS-PAGE分析結(jié)果。在對20嗎的各種蛋白進(jìn)行SDS-PAGE并用考馬斯藍(lán)染色后，確認(rèn)三種重組抗體已 被純化，純凈度為95%以上。
實(shí)驗(yàn)例1: VH和VL蛋白的存在形式和它們之間的結(jié)合
使用HPLC系統(tǒng)對經(jīng)純化的VH、 VL、 scFv和Fv (定義為具有VH 和VL之間的非共價鍵的可變片段)蛋白執(zhí)行尺寸排阻色譜(SEC)。將 0.02 mL蛋白(濃度為5 |iM 20 pM)注射到TSK G3000SWXL柱中 (TosoHaas，日本)，并使磷酸鹽緩沖溶液(50 mM磷酸鈉/150 mMNaCl， pH7.4)以0.7mL/分鐘的流動速率在其中流過，根據(jù)280nm處的吸光度 獲得所述蛋白的色譜圖。
在磷酸鹽緩沖溶液條件下，VH和VL蛋白都以單體的形式存在，并 沒有觀察到多聚體形式的VH或VL (圖4)。
此外，從圖4中看到了 VH-VL結(jié)合的Fv。用表面等離子共振(SPR) 生物傳感器(Biacore 2000 , Pharmacia,瑞典)分析了 VH和VL蛋白之間 的定量結(jié)合。將0.5 mg/mL 1.0 mg/mL的VL蛋白固定在羧甲基化葡聚 糖涂覆的CM5傳感器芯片(Amersham pharmacia Biotech制造)表面并 讓VH蛋白(12.5nM、 25 nM、 50nM、 100 nM、 200 nM)在磷酸鹽緩沖溶 液條件下在所述芯片表面上流過。感應(yīng)譜分析顯示，VH與VL以14nM 的結(jié)合親和力Ko偶聯(lián)(圖5)。
實(shí)驗(yàn)例2: VH、 VL和scFv蛋白的DNA結(jié)合能力分析和表征
通過表面等離子共振(SPR)分析評估了經(jīng)純化的VH、 VL和scFv蛋 白與帶不同堿基序列的DNA的定量結(jié)合能力。
將具有含生物素標(biāo)記3'端的40聚體合成DNA片段固定在鏈霉親和 素涂覆的傳感器芯片上，此前用HES緩沖液(10mMHEPES， pH7.4， 150 mM NaCl， 3 mM EDTA， 0.005%表面活性劑P20)稀釋的scFv (5 nM 200 nM)、 VH (0.2 pM 50 itiM)和VL (1.6 |^M 200 )iM)蛋白以50 (xl/分鐘 的流動速率在所述芯片上流動3分鐘，并讓HES緩沖液再以50 pl/分鐘 的流動速率流到所述芯片上，以誘導(dǎo)與所述DNA連接的所述蛋白的解 離。
感應(yīng)譜分析確定了所有三種抗體蛋白(scFv、 VH和VL抗體蛋白)具有相當(dāng)高的與ssDNA和dsDNA的結(jié)合能力。所述高結(jié)合能力表明，scFv、 VH和VL抗體蛋白很難具有對DNA的堿基序列特異性(圖6)。此外，scFv的DNA親和力比VH和VL的DNA親和力高出100倍 1 ，000倍。該結(jié)果顯示，其中VH和VL域共存的蛋白的DNA親和力要優(yōu)于其中單獨(dú)存在VH和VL域的蛋白的DNA親和力。
為確定所述scFv、 VH和VL蛋白的非特異性DNA結(jié)合主要由靜電力造成的事實(shí)，在不同濃度(O M 0.8 M)的NaCl存在下，使用具有40
聚體的堿基序列經(jīng)預(yù)先確定的單鏈(SS(N)4o)或雙鏈(ds(N)4o)核酸作為底物
進(jìn)行了 ELISA。
從ELISA結(jié)果中可以看出，隨著NaCl濃度的增加，所有三種蛋白都經(jīng)歷了 DNA結(jié)合親和力從50%到90%的減少。該行為表明抗體蛋白與DNA的結(jié)合主要由靜電力造成(在圖7中，符號'、"表示結(jié)合ss(N)4o底物的scFv，符號"o"表示結(jié)合ds(N)4。底物的scFv，符號"T，，表示結(jié)合ss(N)4o底物的VH，符號"V"表示結(jié)合ds(N)恥底物的VH，符號、"表示結(jié)合ss(N)恥底物的VL，而符號"口"表示結(jié)合ds(N)4。底物的VL)。
實(shí)驗(yàn)例3: VH、 VL和scFv蛋白的DNA降解能力和底物特異性
經(jīng)純化的scFv(0.8 pM)、 VH(5 )iM)和VL (5 iiM)蛋白與300 ng的質(zhì)粒M13mpl8(來自New England Biolabs， Ltd)在TBS溶液(20 mM Tris-HCl，pH 8.0, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl。的存在下反應(yīng)1小時 12小時。反應(yīng)混合物用胰蛋白酶處理并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。
將含50 mM EDTA(而非MgCl2)的TBS溶液加入所得物，以確定DNA酶活性的鎂離子(Mg")依輸性。圖8顯示了在反應(yīng)一小時后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖9顯示了反應(yīng)12小時后的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。在圖8 10中，術(shù)語"rc"是DNA的"松弛環(huán)形形式"的縮寫；術(shù)語"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;術(shù)語"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA。 sc類型的DNA依次被降解為rc類型和lin類型的DNA。其后，lin類型DNA被完全降解為更小的DNA片段。
在鎂離子(Mg"存在下，各個蛋白的DNA酶活性的順序?yàn)閟cFv>VL VH。另一方面，在EDTA存在時，所有蛋白的DNA酶活性都被抑制。具體而言，如可從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果所看到的，ssM13mp18DNA以及dsM13mpl8DNA隨著時間的推移而被降解(圖10)。
圖11顯示了獲自原位丙烯酰胺凝膠測定的結(jié)果。所述丙烯酰胺凝膠測定根據(jù)如下步驟進(jìn)行。首先，讓2嗎 10嗎的scFv蛋白在含dsM13mpl8 DNA(20昭/mL)或ss M13mpl8 DNA (20 (xg/mL)的12%丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行SDS-PAGE。為了從凝膠中除去十二垸基硫酸鈉(SDS)并誘導(dǎo)蛋白折疊，用7M脲溶液洗漆凝膠一小時并讓其在Tris溶液中(10mMTris,pH8.0, 10mMMgCl2, 50mMNaCl)在37。C靜置過夜。然后用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)相繼染色凝膠。觀察到僅在有蛋白且未被溴化乙錠染色的區(qū)域內(nèi)發(fā)生DNA降解。(在圖11中，"Etbr處理組"是對比數(shù)據(jù)結(jié)果的黑白色的組，而深色位置是DNA沒有與Etbr反應(yīng)的位置)。該行為表明，scFv蛋白的DNA酶活性歸因于scFv的固有性質(zhì)，而不是歸因于在蛋白純化期間污染的副產(chǎn)品。總之，這些結(jié)果表明本發(fā)明的重組scFv蛋白表現(xiàn)出強(qiáng)力的抗單鏈(ss) DNA和雙鏈(ds)DNA的DNA酶活性。
使用親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)來探查DNA酶活性的底物特異性。將具有地高辛標(biāo)記的5'端和生物素標(biāo)記的3'端的寡核苷酸，艮卩ss-(dT)40、 ds-(dT:dA)40、 ss-(dN)40、 ds-(dN:dN')40、 ss-(dG-dC)20和ds-(dG-dC:dC-dG)2o通過生物素-鏈霉親和素結(jié)合來固定在內(nèi)涂覆鏈霉親和素的96孔培養(yǎng)板上，然后讓其與3D8 scFv (0.8 (iM)、 Fv (5 pM)、 VH(5 jxM)和VL(5 ^iM)在37。C于含MgCl2的TBS溶液(2mM)中反應(yīng)10小時。本文所用ss-(dT^指由胸腺嘧啶組成的單鏈核酸。本文所用dS-(dT:dA)4o指由胸腺嘧啶40聚體和腺嘌呤40聚體組成的雙鏈核酸。本文所用ss-(dN)4。指由特定堿基40聚體組成的單鏈核酸。本文所用ds-(dN:dN')4()指一條堿基40聚體與另一條堿基40聚體互補(bǔ)結(jié)合的雙鏈核酸。本文所用ss-(dG-dC)4o指其中鳥嘌呤與胞嘧啶交替連接的20聚體單鏈核酸。本文所用ds-(dG-dC:dC-dG)指其中鳥嘌呤-胞嘧啶鏈20聚體與胞嘧啶-鳥嘌呤鏈20聚體連接的雙鏈核酸。
剩余DNA與堿性磷酸酶聯(lián)抗地高辛抗體反應(yīng)，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1 M甘氨酸、1 mM ZnCl2、 1 mM MgCl2中的1 mg/mL p-NPP，pH 10.3)作為堿性磷酸酶的底物。測量了在405 nm處的吸光度(圖42)。如圖12所示的結(jié)果可以明顯看出，scFv、 VH和VL的DNA酶活性對DNA底物基本上是非特異性的。
實(shí)驗(yàn)例4:敲除組氨酸的scFv蛋白的DNA酶活性的變化比較本發(fā)明的3D8 scFv抗體蛋白與作為傳統(tǒng)已知的抗DNA催化抗體的BV04-01/ss-(dT)3的三維結(jié)構(gòu)(圖13和圖14)，可以推斷，VH和VL蛋白各自存在的一個組氨酸(His)殘基介導(dǎo)了 DNA酶活性(圖15和圖16)。
基于此推斷，使用定位突變試劑盒和引物將VH的His35和VL的His94 (S口，圖1中由數(shù)字"35"和"94"代表的殘基)用丙氨酸取代。在細(xì)菌中表達(dá)所得蛋白并提純。評價所述蛋白的DNA結(jié)合能力和DNA降解能力的變化。通過ELSIA評價所述蛋白的DNA結(jié)合能力。更具體而言，用溶解于TBS溶液(20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM NaCl， 5 mM MgCl2)中的40聚體寡核苷酸(10pg/mL， 100pl)在37。C包被聚苯乙烯96孔培養(yǎng)板1小時。培養(yǎng)板用TBST (含0.1% Tween 20的TBS)洗滌三次，向其中加入3。/。BSA-TBS，在37。C靜置1小時，然后用TBST洗滌三次。在每個孔中引入經(jīng)純化的scFv、 VH和VL野生型蛋白(20 |ag/mL， 100 pl)和組氨酸突變體蛋白，并在37。C反應(yīng)1小時，然后用TBST洗滌三次。所得蛋白和兔IgG (10 D/mL， 100 D)在37。C反應(yīng)1小時，用TBST洗滌三次，然后與堿性磷酸酶聯(lián)抗兔IgG (I:IO，OOO稀釋，100 pi)在37。C反應(yīng)1小時，并用TBST洗滌三次。最后，在所得蛋白中加入作為堿性磷酸酶底物的； -NPP溶液(在0.1 M甘氨酸、1 mM ZnCl2、ImM MgCl2中的1 mg/mL的p-NPP， pH10.3)。測量所述蛋白在405nm處的吸光度。
以與實(shí)驗(yàn)例3相同的方法評估了所述蛋白的DNA酶活性。
結(jié)果，scFv蛋白中His殘基取代對DNA結(jié)合沒有大的影響(圖17)，但導(dǎo)致了對DNA酶活性的抑制。這些行為表明，所述兩個His殘基介導(dǎo)了 scFv蛋白的DNA酶活性。
另一方面，VH和VL蛋白中的His殘基取代幾乎不影響DNA結(jié)合能力和DNA酶活性。這些行為意味著VH和VL蛋白的DNA降解機(jī)理與scFv蛋白的DNA降解機(jī)理不同(圖19和圖20)。
在圖18和圖20中，術(shù)語"rc"是DNA的"松弛環(huán)形形式"的縮寫；術(shù)語"lin"是"線性形式"的縮寫并指線性DNA;而"sc"指"超螺旋形式"的縮寫并指完全螺旋DNA。
在圖17 20中，符號"*"表示其中組氨酸被丙氨酸取代的突變體。
實(shí)驗(yàn)例5: 3D8scFv蛋白的RNA酶活性
為評估3D8 scFv蛋白的RNA酶活性，首先制備了 ssRNA和dsRNA底物。
使用煙草花葉病毒殼蛋白(TMV-CP)基因克隆pLITMUS載體(來自New England BioLabs， Inc.)的T7啟動子，通過體外轉(zhuǎn)錄然后純化合成ssRNA，從而制備了所述ssRNA。
所述dsRNA通過使用pLITMUS載體的T7和SP6啟動子進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄來合成dsRNA然后提純并雜交而獲得。
將300 ng如此制備的ssRNA (或dsRNA)與0.8 的scFv蛋白在TBS溶液中反應(yīng)1小時 5小時，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果可以確認(rèn)，所述scFv蛋白對dsRNA和ssRNA都表現(xiàn)出RNA酶活性，并取決于反應(yīng)時間(圖21)。
為確定3D8 scFv蛋白的RNA酶活性是歸因于scFv的固有性質(zhì)而不是蛋白純化期間被污染的副產(chǎn)物這一假定，進(jìn)行了所述3D8 scFv蛋白的原位水解測定。即，讓3D8 scFv蛋白在含20 (ig/mL的dsRNA或20 |ag/mL的ssRNA的丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行SDS-PAGE。用7M脲溶液洗滌凝膠1小時并讓其在Tris溶液(IO mM Tris， pH 8.0， 10 mM MgCl2， 50 mM NaCl)中在37'C靜置過夜。用溴化乙錠和考馬斯藍(lán)依次染色凝膠。觀察到只有在存在蛋白因此沒有被溴化乙錠染色的區(qū)域發(fā)生RNA降解。(在圖22中，"Etbr處理組"是對比數(shù)據(jù)結(jié)果的黑白色的組，而深色位置是RNA不與Etbr反應(yīng)的位置)。這些結(jié)果表明，所述scFv蛋白對ssRNA和dsRNA都表現(xiàn)出強(qiáng)力的RNA酶活性(圖22)。
以與實(shí)驗(yàn)例3中相同的方式通過親和力連接寡核苷酸核酸酶測定(ALONA)探査了 RNA酶活性的底物特異性，不同的是使用了具有地高辛標(biāo)記的5'端和生物素標(biāo)記的3'端的寡核苷酸，即sS-(rU)4()、 dS-(rU:rA)40和ds-(rU:dA)4Q (RNA/DNA雜交體)。
將這些底物通過生物素-鏈霉親和素結(jié)合來固定在鏈霉親和素涂覆的96孔培養(yǎng)板上，并讓其在含MgCl2的TBS溶液(2 mM)中與0.8 的3D8 scFv蛋白在37。C反應(yīng)10小時。
同時，在所得物中加入含50mMEDTA (而不是MgCl2)的TBS溶液，以確定RNA酶活性的二價鎂離子(Mg^)依賴性。
本文所用的ss-(rU)4o指由核糖尿嘧啶(ribouraci1)40聚體構(gòu)成的單鏈核酸。本文所用的ds-(rU:rA)卯指由核糖尿嘧啶40聚體和核糖腺嘌呤40聚體構(gòu)成的雙鏈核酸。本文所用的ds-(rU:dA)4o指由核糖尿嘧啶40聚體和脫氧核糖腺嘌呤40聚體構(gòu)成的RNA/DNA雜交體形式的雙鏈核酸，在所述核酸中將核糖尿嘧啶與脫氧腺嘌呤交替相連排布。
用堿性磷酸酶聯(lián)抗地高辛抗體與剩余RNA和RNA/DNA雜交體反應(yīng)，并向其中加入p-NPP溶液(在0.1 M甘氨酸，1 mM ZnCl2, ImM MgCl2中的lmg/mL的,NPP， pH 10.3)作為堿性磷酸酶的底物。測量所得混合物在405nm處的吸光度。結(jié)果如圖23所示。
結(jié)果表明，scFv抗體蛋白能降解RNA/DNA雜交體以及ssRNA和dsRNA，并且scFv抗體蛋白的RNA酶活性不依賴于Mg2+，這與所述scFv抗體蛋白的DNA酶活性不同。
已知在傳統(tǒng)RNA酶上觀察到了不依賴于Mg^的RNA酶活性。
實(shí)施例1:通過熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)移有3D8 scFv蛋白的動物細(xì)胞的抗病毒活性的確定
用Alexa488標(biāo)記試劑盒(Molecular probes， Inc.，綠色熒光)對如此在細(xì)菌中表達(dá)并純化的3D8 scFv抗體進(jìn)行熒光標(biāo)記。
然后，用微孔穿孔器(microporator)(來自韓國Digital Bio TechnologyCo., Ltd.)在伏特數(shù)為100、脈寬為35和脈沖數(shù)為2的電穿孔條件下將所述3D8 scFv抗體注射到vero細(xì)胞內(nèi)(非洲綠猴腎細(xì)胞)。在2X 105個vero細(xì)胞中導(dǎo)入20嗎scFv蛋白，將導(dǎo)入蛋白的細(xì)胞接種到含0.5 mL的DMEM-10。/。胎牛血清的48孔培養(yǎng)板上，然后將接種后的板在5% 002培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10小時。
重要的是，利用具有單RNA鏈作為基因組的水泡性口炎病毒(VSV)，在5% C02培養(yǎng)箱中以MOI 5對所述細(xì)胞進(jìn)行1小時的轉(zhuǎn)染，然后在新的DMEM-10。/。胎牛血清培養(yǎng)基中溫育。
24小時后，用熒光顯微鏡觀察所述細(xì)胞。從熒光顯微鏡測定中可以確認(rèn)，其中未導(dǎo)入3D8 scFv蛋白的vero細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞死亡(一種由VSV引起的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE》(圖24)，而其中導(dǎo)入有3D8 scFv蛋白的vero細(xì)胞不管VSV感染與否都仍然存活(圖25)。
在圖24和圖25中，"3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+，，指"注射了 3D8 scFv蛋白"，而"VSV+"指"經(jīng)VSV處理"。
通過電穿孔(伏特數(shù)為1000，脈寬為35，脈沖數(shù)為2)將所述3D8 scFv蛋白轉(zhuǎn)染到HeLa細(xì)胞(人類宮頸癌細(xì)胞系)內(nèi)并用VSV轉(zhuǎn)染(感染)。觀察到HeLa細(xì)胞表現(xiàn)出與所述vero細(xì)胞相似的抗病毒活性，即細(xì)胞死亡受到抑制(參見圖27，并且從圖26中可以看出，其中轉(zhuǎn)染了VSV的轉(zhuǎn)移有3D8 scFv蛋白的HeLa細(xì)胞沒有表現(xiàn)出所述3D8 scFv蛋白的固有細(xì)胞毒性(參見圖27中"3D8+ZVSV-"部分))。
在圖26和27中，"3D8-"指"不含3D8 scFv蛋白"，"3D8+"指"注射了 3D8 scFv蛋白"，"VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經(jīng)VSV處理"。
另一方面，所有轉(zhuǎn)移有RNA酶A的HeLa細(xì)胞(未用VSV轉(zhuǎn)染)由于RNA酶A的固有細(xì)胞毒性而在5小時內(nèi)死亡。
該結(jié)果顯示，所述3D8 scFv蛋白的抗病毒活性顯著高于傳統(tǒng)核酸酶的抗病毒活性。
實(shí)施例2:轉(zhuǎn)移有3D8scFv、 VH或VL蛋白的動物細(xì)胞的抗病毒活性的定量測定
通過MTT (溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑)測定定量確定了 3D8 scFv、 VH或VL蛋白的抗病毒活性。
將這些蛋白、作為對照組的牛血清白蛋白(BSA)和溶菌酶以20 pg/2X 105細(xì)胞電穿孔到HeLa細(xì)胞中，以1 X 105細(xì)胞/孔分到96孔培養(yǎng)板上，并在5% C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。
僅進(jìn)行電穿孔而不含蛋白的HeLa細(xì)胞用作另一個對照組。24小時后，將所述不含蛋白的HeLa細(xì)胞組用VSV (MOI-l)轉(zhuǎn)染1小時并在新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時。
當(dāng)用熒光顯微鏡觀察所述不含蛋白的HeLa細(xì)胞時，向其中加入MTT溶液(l mg/mLPBS, 100 iil)并在5% (302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時 5小時。
將所得甲暨(fomazan)溶解在200 pl 二甲亞砜(DMSO)中。用吸收分光光度計在595 nm處測量所述甲暨的吸光度，以確定所述HeLa細(xì)胞的存活率。
結(jié)果，轉(zhuǎn)移有所述scFv、 VH或VL蛋白的HeLa細(xì)胞的存活率顯著高于對照組的HeLa細(xì)胞存活率。該結(jié)果確定了所有scFv、 VH和VL蛋白都具有抗VSV的抗病毒活性(參見圖28:"對照"為未處理組而"BSA"和"溶菌酶"為對照組)。
實(shí)施例3:通過共聚焦顯微鏡對轉(zhuǎn)移3D8 scFv、 VH和VL蛋白的動物細(xì)胞的抗病毒活性的確定
將所述scFv、 VH和VL蛋白以20 jig/2 X 105細(xì)胞/孔電穿孔到24孔培養(yǎng)板上的HeLa細(xì)胞內(nèi)，并在帶滅菌蓋玻片的孔內(nèi)培養(yǎng)24小時。
在24小時培養(yǎng)完成，將所述細(xì)胞用VSV轉(zhuǎn)染1小時并在新的培養(yǎng)基中培養(yǎng)12小時。為通過共聚焦顯微鏡監(jiān)測HeLa細(xì)胞內(nèi)的VSV片段的增殖，進(jìn)行了免疫熒光染色。具體而言，將所述培養(yǎng)基從各孔中分離，用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌所述細(xì)胞一次，然后向其中加入400 pl固定/增透溶液(Becton Dickinson, Inc,)，并讓其在4。C靜置20分鐘。所得細(xì)胞用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌兩次，然后與500 (il的抗VSV-FITC抗體(1:1000稀釋)(Abeam， Inc.)在4"C反應(yīng)40分鐘，并用含2% FBS的PBS緩沖溶液洗滌三次。
將含有作為使細(xì)胞核染為藍(lán)色的試劑的3 (il的DAPI(4'-6-二脒基-2-苯基吲哚)的固定溶液(Invitrogen，Corp,)加到預(yù)先準(zhǔn)備的載玻片上，用附著有所述細(xì)胞的蓋玻片覆蓋所述載玻片，用所述固定溶液密封剩余相鄰區(qū)域，然后用共聚焦顯微鏡觀察VSV顆粒。
31從共聚焦顯微鏡監(jiān)測中可以確認(rèn)，存在于轉(zhuǎn)移有scFv、 VH或VL蛋白的細(xì)胞中的VSV片段的量低于未轉(zhuǎn)移有scFv、 VH或VL蛋白的細(xì)胞中的VSV片段的量。低量的所述VSV片段表明，scFv、 VH和VL蛋白抑制了VSV的增殖。(參見圖29， "3D8-"指"不含3D8scFv蛋白"，"3D8+"指"轉(zhuǎn)移有3D8 scFv蛋白"，"VSV-"指"未用VSV處理"，而"VSV+"指"經(jīng)VSV處理")。
制備例5: NIH/3T3、 HeLa、 PK15動物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化為了建立其中穩(wěn)定表達(dá)3D8 scFv蛋白的細(xì)胞系，用plg20-3D8質(zhì)粒進(jìn)行了 PCR以獲得3D8 scFv基因，并將所述3D8 scFv基因克隆到動物細(xì)胞表達(dá)載體中(圖30)。使用包括pcDNA3.1載體(invitrogen,Inc.)、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pLXIN (invitrogen, Inc.)和逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pQCXIN(invitrogen， Inc.)在內(nèi)的三種載體進(jìn)行所述3D8 scFv基因克隆(在圖30中，這些載體分別由"a"、 "b"和"c"表示)。此處所用的各PCR引物組如下
a) 3D8 scFv基因在pc DNA3.1載體中的克隆
正向 ' 5'-GGATCCTGCTATGGCAAAAGCCCGGGAG陽3' (SEQ ID NO
17)
反向5'畫CTCGAGGTCCATGGTGATGATGATG畫3' (SEQ ID NO 18)
b) 3D8 scFv基因在pLXIN載體中的克隆
正向5'畫TCTCGAGATGGAGGTCCAGCTGCAG-3' (SEQ ID NO 19)反向5'隱TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3'(SEQ ID NO 20)
c) 3D8 scFv基因在pQCXIN載體中的克隆
正向5'-GTTCTAGAGCGGCCGCATGGAGGTCCAGCTGCAGC-3'(SEQ ID NO 21)
反向5'畫TGGATCCTTATTAAAGATCTTCTTCGCTAATAAGTTTTTGTTCTTTTATTTCCAGCTTGGTCCC-3' (SEQ ID NO 22)
(1)通過簡單轉(zhuǎn)染來建立表達(dá)3D8 scFv的HeLa和NIH/3T3細(xì)胞系將HeLa細(xì)胞系和NIH/3T3細(xì)胞系(小鼠胚胎成纖維細(xì)胞)以105細(xì)胞/孔在60 mm培養(yǎng)板上培養(yǎng)，12小時后，用pc DNA3.1-3D8 scFv載體轉(zhuǎn)染這些細(xì)胞。在剛要轉(zhuǎn)染前，用新鮮培養(yǎng)基(DMEM-10M FBS)替代 所述培養(yǎng)基。將6 (il JetPEI轉(zhuǎn)染溶液(Qbiogen， Inc.)和3 pg pcDNA3.1-3D8 scFv載體與NaCl (100 150 mM)均勻混合，并將其于室溫靜置30分鐘。 將所得混合物加入在60 mm培養(yǎng)板上培養(yǎng)的HeLa細(xì)胞系或NIH/3T3細(xì) 胞系。24小時后，用含G418抗生素(lmg/mL)的選擇培養(yǎng)基替換所用培 養(yǎng)基，并且重要的是，連續(xù)重復(fù)替換所述選擇培養(yǎng)基(以2天 3天間隔 進(jìn)行2周)以獲得群落。
通過逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)確定了形成群落的細(xì)胞表達(dá) 3D8 scFv mRNA。使用Trizol溶液(Invitrogen Life Technologies, Inc.)從所 述細(xì)胞中提取總細(xì)胞RNA，然后由3嗎所提取的RNA合成cDNA并使 用RT-PCRPreMix試劑盒(來自Bioneer， Ltd.)對所述cDNA進(jìn)行聚合酶 鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。
圖31是顯示所述NIH/3T3細(xì)胞的RT-PCR分析結(jié)果的瓊脂糖凝膠電 泳圖像。在圖31中，泳道1為尺寸標(biāo)記(來自Bioneer, Inc.的100 bp序 列梯)，泳道2是其中使用蒸餾水(D.W)作為PCR模板的陰性對照組的 PCR圖案，泳道3是其中使用未轉(zhuǎn)染NIH/3T3的細(xì)胞合成的cDNA作為 PCR模板的陰性對照組的PCR圖案，而泳道4顯示了其中使用從轉(zhuǎn)染有 pcDNA3.1-3D8 scFv的NIH/3T3細(xì)胞合成的cDNA作為PCR模板的PCR 圖案。
如從圖31中可以明顯看出，在泳道4的圖案中觀察到對應(yīng)于3D8 scFv基因尺寸的750bp條帶。所述條帶的存在表明所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的NIH/3T3 細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)3D8 scFv mRNA。
然后，通過免疫熒光染色確定所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的NIH/3T3細(xì)胞是否表達(dá) 3D8scFv蛋白。艮P，將所述細(xì)胞通過4%多聚甲醛固定，并相繼使用0.1% Triton X-100進(jìn)行膜增透和使用5M脫脂奶(DIFCO， Inc.)封閉膜。將所得 NIH/3T3細(xì)胞與兔衍生抗3D8 scFv —抗(在3。/。脫脂奶-TBST中以1:50 稀釋)在室溫下反應(yīng)30分鐘，用3。/。脫脂奶-TBST洗滌兩次，與TRITC 聯(lián)抗兔IgG (1:2,000稀釋)在室溫下反應(yīng)30分鐘，并用3n/。脫脂奶-TBST 洗滌兩次。熒光顯微鏡測定結(jié)果表明，3D8 scFv蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的NIH/3T3 細(xì)胞中均勻表達(dá)(圖32)。
在圖32中，"a"是顯示不含3D8 scFv的NIH/3T3細(xì)胞的圖，而"b" 是顯示轉(zhuǎn)染了 3D8 scFv的NIH/3T3細(xì)胞的圖。
從轉(zhuǎn)染了 3D8 scFv的Hela細(xì)胞系中選出G418并在96孔板上進(jìn)行 有限稀釋，以使在每個孔中引入0.5個細(xì)胞以建立單克隆細(xì)胞系。
圖33是顯示RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述結(jié)果確定了 scFv mRNA在經(jīng)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì)胞系中的表達(dá)。在圖33中，泳道M是 100 bp序列梯(來自Bioneer， Inc.),"正常HeLa"泳道是陰性對照組的 PCR圖案，其中使用由未轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞合成的cDNA作為模板，而按 從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用從經(jīng)轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)染有 pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa細(xì)胞系合成的cDNA作為模板的組的 RT-PCR圖案。
如圖33所示，在所有轉(zhuǎn)染細(xì)胞系中都觀察到了對應(yīng)于3D8 scFv基 因尺寸的750bpDNA條帶(Hl-1、 H 1-2、 H2-l、 H2-2、 H3-2和H3-3)。 該行為表明，所述轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了 3D8 scFv mRNA。
然后，通過流式細(xì)胞儀確定了在兩個代表性轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞系(Hl-1 和Hl-2)中的3D8 scFv蛋白的表達(dá)(圖34)。艮卩，將所述細(xì)胞通過4% 多聚甲醛固定，并相繼使用0.1% TritonX-100進(jìn)行膜增透和使用2%胎牛 血清(Invitrogen, Corp.)進(jìn)行膜封閉。將所得HeLa細(xì)胞與兔衍生抗3D8 scFv —抗(在2。/。胎牛血清-TBST中以1:50稀釋)在室溫下反應(yīng)30分鐘， 用2。/。胎牛血清-TBST洗漆兩次，與FITC偶聯(lián)抗兔IgG (1:2,000稀釋) 在室溫下反應(yīng)30分鐘，并用2。/。胎牛血清-TBST洗滌兩次。
流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示，3D8 scFv蛋白在所述經(jīng)轉(zhuǎn)染的HeLa細(xì) 胞中表達(dá)(圖34)。
(2)使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體對表達(dá)3D8 scFv的HeLa和PK15細(xì)胞系進(jìn) 行的確定
將其中克隆有3D8 scFv基因的兩個逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，即pLXIN-3D8 scFv禾B pQCXIN-3D8 scFv轉(zhuǎn)染到作為包裝細(xì)胞系的PT67細(xì)胞內(nèi)。將2X 105個PT67細(xì)胞在6孔板的一個孔上生長約24小時，并用不含血清的 TOMTM (Welgene, Inc.)洗滌。將2嗎的DNA、 5 jxl的lipofectamine (Invitrogen， Corp.)和200 |il的TOIV[Tm互相混合，使其在室溫下反應(yīng)15分 鐘，再向其中加入800^1 TOM 培養(yǎng)基，然后將倒進(jìn)含細(xì)胞的孔內(nèi)，并 在37"C于5% C02培養(yǎng)箱中溫育8小時。8小時后，將所述細(xì)胞在含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)約24小時，然后用含800 pg/mL G418 的DMEM-10。/。胎牛血清培養(yǎng)基替換所用培養(yǎng)基。約兩周后，當(dāng)細(xì)胞開始 在孔內(nèi)成簇并生長時，將它們培養(yǎng)2天 3天并離心以獲得病毒上清液。 剩余溶液經(jīng)0.45 (im過濾器過濾以除去細(xì)胞殘余物。
為將由PT67包裝細(xì)胞系獲得的含3D8 scFv基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒 轉(zhuǎn)導(dǎo)到HeLa和PK15細(xì)胞內(nèi)，將1 X 105個HeLa細(xì)胞和PK15細(xì)胞(豬 腎成纖維細(xì)胞)在60 mm培養(yǎng)板上培養(yǎng)約24小時，并使用添加有溴化己 二甲胺(polyblene) (10昭/mL)的含10。/。血清的DMEM培養(yǎng)基在37。C于5。/。 C02培養(yǎng)箱中溫育兩周。將所述細(xì)胞在添加了 5 mL通過培養(yǎng)所述PT67 包裝細(xì)胞獲得的病毒上清液的培養(yǎng)基中在37X:溫育24小時，然后使用 1 mg/mL的含G418培養(yǎng)基進(jìn)行G418選擇。
在用逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染所述HeLa和PK15細(xì)胞后約三周，當(dāng)通過所述 g418選擇形成了所述轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的細(xì)胞簇時，進(jìn)行有限稀釋而在96孔板的 一個孔中引入0.5個細(xì)胞，以建立單克隆細(xì)胞系。H4-2、 H5-14、 H5-18 和H5-26建立為轉(zhuǎn)染有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的代表性HeLa細(xì)胞系，而Pl-l、 P 1-2和P 1-3建立為轉(zhuǎn)染有所述逆轉(zhuǎn)錄病毒的代表性PK細(xì)胞系。
圖35是顯示RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，所述RT-PCR結(jié) 果確定了 3D8 scFv mRNA在經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞系中的表達(dá)。在圖35 中，泳道M為100bp序列梯(來自Bioneer,Inc.)，"正常PK15"泳道是 陰性對照組的PCR圖案，其中使用由未轉(zhuǎn)染PK15細(xì)胞合成的cDNA作 為模板，并且按從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用從經(jīng) 轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)染有pcDNA3.1-3D8 scFv的HeLa細(xì)胞系合成的cDNA作為模 板的組的RT-PCR圖案，而泳道P1-1、 P 1-2和P l-3分別是其中使用由 經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞系合成的cDNA作為模板的組的RT-PCR圖案。如圖35所示，在所有經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞系(Pl-1、 Pl-2禾BPl-3) 中都觀察到了對應(yīng)于3D8 scFv VH和VL基因的尺寸的400 bp DNA條帶。 這表明所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了 3D8 scFvmRNA。
實(shí)施例4:表達(dá)3D8 scFv蛋白的動物細(xì)胞的抗病毒活性測定 對其中已證明表達(dá)了 3D8 scFv基因的NIH/3T3和HeLa細(xì)胞系的抗 病毒活性進(jìn)行確定。具體而言，評估了所述NIH/3T3細(xì)胞系抗水泡性口 炎病毒(VSV)的抗病毒活性，評估了所述HeLa細(xì)胞系抗VSV、單純皰疹 病毒(HSV)和偽狂犬病(Aujesky's disease)病毒(ADV)的抗病毒活性，并評 估了所述PK15細(xì)胞系抗典型豬瘟病毒(CSFV)的抗病毒活性。
感染到所述經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中的病毒量在0.1 1.0的感染復(fù)數(shù)(MOI) 范圍內(nèi)。為確定各細(xì)胞系的抗病毒活性，用病毒感染所述細(xì)胞系，在約 20小時 72小時后，進(jìn)行細(xì)胞死亡監(jiān)測、RT-PCR或胞內(nèi)病毒染色。根 據(jù)如下方式確定各細(xì)胞系的病毒活性
確定抗VSV的抗病毒活性(負(fù)鏈RNA基因組) :在病毒感染后20小時 40小時用顯微鏡觀察細(xì)胞死亡 -確定抗HSV的抗病毒活性(雙鏈DNA基因組) :在病毒感染后20小時 40小時用顯微鏡觀察細(xì)胞死亡 :在用HSV-GFP (綠色熒光蛋白)病毒感染細(xì)胞后24小時用顯微 鏡觀察細(xì)胞死亡，所述HSV-GFP病毒當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP時發(fā)綠色熒 光。
確定抗ADV的抗病毒活性(雙鏈DNA基因組) :在感染后40小時進(jìn)行靶向ADV gp50基因的RT-PCR。
評估抗CSFV的抗病毒活性(正鏈RNA基因組) :在感染后72小時時對胞內(nèi)病毒進(jìn)行染色。
圖36顯示了以與實(shí)施例2中的相同方式確定表達(dá)所述3D8 scFv蛋 白的NIH/3T3細(xì)胞的抗VSV活性的定量MTT測定結(jié)果。
在用VSV以MOI 1感染所述細(xì)胞后24小時，互相比較細(xì)胞系的細(xì) 胞存活率。具體而言，未轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞系的存活率約為47%，而 經(jīng)3D8 scFv基因轉(zhuǎn)化的NIH/3T3細(xì)胞系的存活率約為76%。相似地，未轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞的存活率約為32%，而經(jīng)3D8 scFv轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞 的存活率約為85%(圖36)。這些結(jié)果表明，3D8 scFv蛋白能抑制NIH/3T3 細(xì)胞中的VSV (RNA病毒)活性。
圖37顯示了熒光顯微鏡測定結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)所述3D8 scFv 蛋白的HeLa細(xì)胞的抗VSV活性。在用VSV以MOI 1感染所述細(xì)胞后 24小時，觀察了細(xì)胞行為。從所述細(xì)胞觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞 的死亡率低于未轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞的死亡率(圖37中，"正常HeLa"是 不表達(dá)3D8 scFv蛋白的正常細(xì)胞，而H4-2、 H5-14、 H5-18和H5-26是 表達(dá)3D8scFv蛋白的細(xì)胞)。這些結(jié)果表明，3D8scFv蛋白能抑制HeLa 細(xì)胞中的VSV (RNA病毒)活性。
圖38顯示了胞內(nèi)染色結(jié)果，該結(jié)果確定經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞的CSFV 增殖抑制活性。在用CSFV (MOI = 0.5)感染所述細(xì)胞1小時后，將所 述細(xì)胞從病毒接種培養(yǎng)基中分離。在添加有1 ml含10% FPS的完全 DMEM的每個孔中培養(yǎng)所述細(xì)胞72小時。培養(yǎng)72小時后，將所述細(xì)胞 從所述培養(yǎng)基分離并用PBS洗滌。用80。/。丙酮在-2(TC將所述細(xì)胞固定 IO分鐘。在除去丙酮并干燥后，將所述細(xì)胞與識別CSFVE2抗原的3B6 單克隆抗體(來自韓國National Veterinary Research & Quarantine Service 的抗E2抗體)在37。C反應(yīng)40分鐘。所得細(xì)胞用PBS洗滌三次，并與生 物素偶聯(lián)抗小鼠抗體在37。C反應(yīng)40分鐘。所得細(xì)胞用PBS洗滌三次， 在AB溶液中培養(yǎng)40分鐘，用PBS洗滌三次，然后與二氨基聯(lián)苯胺四鹽 酸鹽(DAB)底物溶液在室溫下反應(yīng)約IO分鐘。反應(yīng)后，從孔中除去DAB 溶液，用自來水洗滌培養(yǎng)箱，用自來水將孔裝到l/4并用顯微鏡觀察。
如從圖38中可以看出，正常PK15細(xì)胞(在圖38中由"正常PK15" 表示)表面和與其相鄰區(qū)域全部被染為深色，而在細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)3D8 scFv 蛋白的經(jīng)轉(zhuǎn)化的PK15細(xì)胞系(P1-1、 Pl-2、 Pl-3)幾乎沒有染色。這些結(jié) 果表明，3D8 scFv蛋白能抑制PK15細(xì)胞中的CSFV增殖。
同時，圖39顯示了以與實(shí)施例2中的相同方式進(jìn)行的定量MTT測 定的結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白的HeLa細(xì)胞的抗VSV活性。
在用VSV (MOI:0.1或1)感染所述細(xì)胞后24小時和36小時，互相比較了所述細(xì)胞系的存活率。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)3D8 scFv基因轉(zhuǎn)化的H4-2 細(xì)胞的存活率高于未轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞的存活率，具體而言，所述經(jīng)3D8 scFv基因轉(zhuǎn)化的H4-2細(xì)胞的存活率在MOI 1時為約75%，而在MOI 0.1 時為約88%(圖39)。這些結(jié)果表明，3D8scFv蛋白能抑制HeLa細(xì)胞中 的VSV活性。
圖40顯示了以與實(shí)施例4中的相同方式進(jìn)行熒光顯微鏡測定的結(jié) 果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白的HeLa細(xì)胞的抗VSV活性。
在用HSV-GSP以MOI 1和MOI 0.5感染所述細(xì)胞后24小時，觀察 了所述細(xì)胞的熒光活性。經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞的熒光細(xì)胞比 例(fluorescent cell ratio)低于未轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞的熒光細(xì)胞比例。這些結(jié)果 表明，3D8 scFv蛋白能抑制HeLa細(xì)胞中的VSV增殖。
圖41顯示了顯微鏡測定結(jié)果，該結(jié)果確定表達(dá)3D8 scFv蛋白的HeLa 細(xì)胞的抗ADV活性。在用ADV以MOI 0.1和MOI 1感染細(xì)胞后24小 時和40小時，觀察了所述細(xì)胞行為。在所有情形中，觀察到經(jīng)轉(zhuǎn)化HeLa 細(xì)胞的死亡率低于未轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞的死亡率。這些結(jié)果表明，3D8 scFv 蛋白能抑制HeLa細(xì)胞中的ADV (DNA病毒)增殖。
圖42是顯示RT-PCR結(jié)果的瓊脂糖凝膠電泳圖像，該結(jié)果確定經(jīng)轉(zhuǎn) 化的HeLa細(xì)胞系的ADV病毒增殖抑制活性。在圖42中，泳道M為100 bp序列梯(來自Bioneer, Inc.),"正常HeLa"泳道是其中使用由未轉(zhuǎn)化 的HeLa細(xì)胞合成的cDNA作為模板的陰性對照組的RT-PCR圖案，而按 從左至右的順序，第三至第七泳道分別為其中使用由經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞 系(H1-2、H2-2、H3-1 、H3-2和H3-3)合成的cDNA作為模板的組的RT-PCR 圖案。
用于所述PCR的引物的堿基序列如下。所述引物靶向ADV病毒的 gp50基因。
ADV正向引物5 '-CGTACCGCGCCCACGTGGCC-3 (SEQ ID NO
23)
ADV反向引物5'國GTCGGTGAGGATGTTCACGC-3' (SEQ ID NO
24)從圖42中明顯可以看出，在未轉(zhuǎn)化HeLa細(xì)胞中觀察到了 263 bp的 ADV gp50 DNA強(qiáng)帶，而在經(jīng)轉(zhuǎn)化的HeLa細(xì)胞中觀察到了弱帶。與圖 41相似，這些結(jié)果表明3D8 scFv蛋白能抑制HeLa細(xì)胞中的ADV病毒增殖。
總之，上述結(jié)果證明，DNA病毒(例如，ADV和HSV)和RNA病 毒(例如，VSV和CSFV)在表達(dá)3D8scFv蛋白的細(xì)胞中的增殖受到抑制。
配制例1: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 40昭 Tween 802 mg
甘氨酸2g
通過將所述成分溶解在注射用生理鹽水中，進(jìn)行無菌過濾，分裝到 2 mL小瓶中，凍干并密封來制備組合物(20 mL)。 配制例2: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 40嗎 Tween 801 mg 山梨糖醇2g 甘氨酸1 g
通過將所述成分溶解在注射用生理鹽水中，進(jìn)行無菌過濾，分裝到 2 mL小瓶中，凍千然后密封來制備組合物(20 mL)。 配制實(shí)施例3: 3D8 scFv蛋白的配制 ScFv (SEQ ID NO: 6) 20嗎 血清白蛋白501 mg 山梨糖醇4g
通過將所述成分溶解于0.01 M磷酸鹽緩沖溶液(PBS, pH 7.0)中，進(jìn) 行無菌過濾，分裝到2mL小瓶中，凍干然后密封來制備組合物(20mL)。 施用例1: 3D8 scFv DNA的肌內(nèi)注射
將100嗎表達(dá)scFv蛋白的載體DNA(SEQIDNO: 6)肌內(nèi)注射到小 鼠的股四頭肌中。將稀釋在0.9% NaCl中的50嗎載體DNA各自注射到小鼠的兩個股四頭肌中。
注射后，通過將電極置于與注射位點(diǎn)相鄰的肌肉上并對所述位點(diǎn)施 加具有10串1,000次脈沖的電勢來進(jìn)行電穿孔。此時，施加的脈沖長度
為200微秒(兩次)，兩個連續(xù)脈沖之間的間隔為600微秒，而電流限制 為50 mA。對皮膚使用導(dǎo)電凝膠。在較大型動物的情形中，可將所述電 極插入動物的肌肉中。 工業(yè)應(yīng)用
從上文可以明顯看出，本發(fā)明能夠應(yīng)用于動物細(xì)胞，特別是能應(yīng)用 于人類細(xì)胞，因此可廣泛用于與由包括HIV病毒和SARS病毒在內(nèi)的多 種病毒引起的疾病的治療相關(guān)的藥物行業(yè)中。
權(quán)利要求
1. 一種抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
2. —種抗動物病毒的抗病毒劑，所述抗病毒劑含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié) 合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
3. 如權(quán)利要求2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述核酸序列 為DNA序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述DNA序列是被引入到能在動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的載體中的核酸序列。
5. 如權(quán)利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述蛋白獲自誘發(fā)有自身免疫疾病的動物。
6. 如權(quán)利要求5所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述自身免疫 疾病由/pr基因的功能異常所誘發(fā)。
7. 如權(quán)利要求5所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述誘發(fā)有自 身免疫疾病的動物是小鼠。
8. 如權(quán)利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中對外來核 酸鏈的所述結(jié)合和降解能力是對RNA鏈的結(jié)合和降解能力，或?qū)NA 鏈的結(jié)合和降解能力。
9. 如權(quán)利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中對外來核 酸鏈的所述結(jié)合和降解能力是對RNA和DNA鏈都具有的結(jié)合和降解能 力。
10. 如權(quán)利要求1或2所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述蛋 白是具有對外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片 段。
11. 如權(quán)利要求10所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球 蛋白是免疫球蛋白G。
12. 如權(quán)利要求10所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球蛋白片段選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結(jié)合的Fv。
13. 如權(quán)利要求ll所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述免疫球 蛋白G是3D8。
14. 如權(quán)利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述scFv 具有如SEQ ID NO 6所示的序列。
15. 如權(quán)利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述VH具 有如SEQ ID NO 2所示的序列。
16. 如權(quán)利要求12所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述VL具 有如SEQ ID NO 4所示的序列。
17. 如權(quán)利要求1所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中侵入動物細(xì) 胞的病毒是RNA病毒。
18. 如權(quán)利要求17所述的抗動物病毒的抗病毒劑，其中所述RNA 病毒是獲得性免疫缺陷綜合征病毒或嚴(yán)重急性呼吸道綜合征病毒。
19. 含有作為活性成分的蛋白的抗病毒動物細(xì)胞，所述蛋白具有對 侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本 身沒有細(xì)胞毒性。
20. 含有作為活性成分的編碼蛋白的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞， 所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力，并且對 所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。
21. 如權(quán)利要求20所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述核酸序列是 DNA序列。
22. 如權(quán)利要求21所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述DNA序列是 被引入到能在動物細(xì)胞內(nèi)表達(dá)基因的載體中的核酸序列。
23. 如權(quán)利要求19或20所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述蛋白獲 自誘發(fā)有自身免疫疾病的動物。
24. 如權(quán)利要求23所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述自身免疫疾病 由/pr基因的功能異常所誘發(fā)。
25. 如權(quán)利要求23所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述誘發(fā)有自身免疫疾病的動物是小鼠。
26. 如權(quán)利要求19或20所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中對外來核酸 鏈的所述結(jié)合和降解能力是對RNA鏈的結(jié)合和降解能力，或?qū)NA鏈 的結(jié)合和降解能力。
27. 如權(quán)利要求19或20所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中對外來核酸 鏈的所述結(jié)合和降解能力是對RNA和DNA鏈都具有的結(jié)合和降解能力。
28. 如權(quán)利要求19或20所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述蛋白是 具有對外來核酸鏈的結(jié)合和降解能力的免疫球蛋白或免疫球蛋白片段。
29. 如權(quán)利要求28所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白是 免疫球蛋白G。
30. 如權(quán)利要求28所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白片 段選自scFv、 VH、 VL以及與VH和VL結(jié)合的Fv。
31. 如權(quán)利要求29所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述免疫球蛋白G 是3D8。
32. 如權(quán)利要求30所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述scFv具有如 SEQIDN0 6所示的序列。
33. 如權(quán)利要求30所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述VH具有如SEQ IDN0 2所示的序列。
34. 如權(quán)利要求30所述的抗病毒動物細(xì)胞，其中所述VL具有如SEQ IDN0 4所示的序列。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗動物病毒的抗病毒劑。所述抗病毒劑含有作為活性成分的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列，所述蛋白具有對侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈的結(jié)合能力和降解能力，并且對所述動物細(xì)胞本身沒有細(xì)胞毒性。本發(fā)明還公開了含有本發(fā)明的蛋白或編碼所述蛋白的核酸序列的抗病毒動物細(xì)胞。所述抗病毒劑和抗病毒動物細(xì)胞由于能夠選擇性地降解侵入動物細(xì)胞的外來核酸鏈，并且對所述動物細(xì)胞沒有細(xì)胞毒性，因此不造成所述動物細(xì)胞的死亡，從而表現(xiàn)出有利的作用。
文檔編號A61K38/16GK101534848SQ200780042871
公開日2009年9月16日 申請日期2007年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2006年9月19日
發(fā)明者孫鐘南, 樸乙鏞, 權(quán)明姬, 李又覽, 李建燮, 李承炫, 李錫瓚, 沈惠京, 鄭義靜, 鄭有哲, 金基潤, 金容星, 金映林, 金正宣, 金泰賢 申請人:亞洲大學(xué)校產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)